钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在防治辐射诱导骨髓抑制药物中的应用

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及钠葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂在药学领域中的应用，更具体的说是钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂作为防治辐射诱导骨髓抑制药物的应用。
2.发明背景
3.核技术在能源，航天、医疗等国民经济发展中发挥了重要作用。然而，核恐怖，核泄漏，放射源丢失的不时发生，严重威胁着人类的生命健康。临床上尚缺乏辐射损伤的医学根治手段。造血系统由骨髓造血干细胞及不同发育时期的造血细胞组成，对辐射敏感，受到损伤后会出现不同程度的抑制，表现为骨髓活力下降、活性氧增加以及dna损伤，降低患者生存质量甚至危及生命。
4.近几十年来，对辐射防护药物的研究已经成为了国内外关注的热点。开发新药用于辐射防治过程复杂，且安全性需要经过数次临床验证。目前临床上对出现骨髓抑制多是采用加强营养或给与各种生长因子增加造血细胞的增殖。另外一些具有抗辐射损伤作用的化合物或中药制剂。药物种类很多，多是联合应用，单独评价时疗效不很确定，还会有各种副作用的产生。
5.钠-葡萄糖协同转运蛋白(sodium-glucose co-transporter，sglt)是一个活性葡萄糖转运蛋白家族，分子量为73kd。有两种主要的亚型：sglt-1和sglt-2，sglt2在葡萄糖的重吸收中起主要的作用，它转运肾重吸收葡萄糖的90％，而sglt1转运其余的10％。因此sglt-2抑制剂可以阻断近曲小管对葡萄糖的重吸收，通过尿液排出多余的糖。sglt-2抑制剂的开发始于根皮苷的发现，根皮苷是一种天然存在的化合物，具有尿糖作用。根皮苷易在肠道中水解，口服利用度差，但其类似物口服给药后很容易被吸收。在化学上，大多数sglt2抑制剂是来源于根皮苷原型的糖苷。
6.目前已经有一些sglt-2抑制剂药物获批上市，包括恩格列净、达格列净、卡格列净、伊格列净、托格列净、鲁格列净、索格列净和埃格列净等。其中达格列净、恩格列净和卡格列净于2017年在国内上市，由默沙东和辉瑞共同开发的艾托格列净2020年在我国获批上市。此外，还有一些正在研发的sglt-2抑制剂，如三唑类、吲哚类、噻吩类、哒嗪类、噻唑和噻二唑类、螺环类、苯基类、薁类、异喹啉类、葡萄糖衍生物类以及非糖类等。这些sglt-2抑制剂主要作为治疗2型糖尿病的口服降糖药物，降低糖尿病患者血糖，同时没有增加体重和低血糖的风险，不良反应少见。尽管多种sglt-2抑制剂已经作为临床二型糖尿病的治疗药物，但是其在辐射损伤防治的应用还没有报道。
7.本发明人在实验中首次揭示，sglt-2抑制剂在防治骨髓抑制中具有明显的治疗作用，特别是防治辐射诱导骨髓抑制更加明显，基于上述的发现经过进一步试验从而完成了本发明。


技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题是寻找能够保护辐射诱导骨髓细胞和功能的损伤得到预防、治疗的药物。
9.因此，本发明的目的在提供sglt-2抑制剂在制备预防或治疗辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。
10.为解决上述问题，本发明提供如下的技术方案：
11.一种sglt-2抑制剂在制备预防辐射诱导骨髓抑制药物中的应用。实施方式是：sglt-2抑制剂在制备防治辐射诱导骨髓损伤药物中的应用。所述的辐射诱导骨髓损伤，包括：接受放射治疗的肿瘤患者、辐射暴露的工作人员、意外辐射性同位素暴露的人员。
12.本发明所述骨髓抑制(骨髓抑制性死亡)，包括骨髓细胞活力下降、骨髓细胞中活性氧的增加或骨髓细胞dna损伤。
13.本发明对辐射诱导骨髓抑制的试验内容主要包括以下几个方面：
14.1.sglt-2抑制剂对体外照射的骨髓细胞损伤具有保护作用。
15.2.sglt-2抑制剂对接受全身照射的小鼠骨髓细胞功能损伤具有保护作用。
16.说明书附图
17.图1为恩格列净对骨髓细胞活力的影响；
18.图2为恩格列净对骨髓细胞ros的影响；
19.图3为恩格列净对小鼠骨髓细胞凋亡的影响；
20.图4为恩格列净对外周血及单侧股骨计数的影响；
21.图5为恩格列净对小鼠体内骨髓细胞ros的影响；
22.图6为恩格列净对小鼠体内骨髓细胞nox-4的影响；
23.图7为恩格列净对小鼠体内骨髓细胞γh2ax的影响。
具体实施方式
24.下面通过药效学实验进一步说明sglt-2抑制剂在预防或治疗辐射诱导骨髓抑制作用的药理实验情况。
25.一、实验方法
26.实施例1骨髓单个核细胞分离
27.无菌取小鼠股骨，pbs缓冲液冲洗骨髓，过滤并计数。调整所需的细胞浓度后加入含有10％fbs和1％双抗的1640培养基，制备单个核细胞悬液待用。
28.实施例2对骨髓细胞活力的影响
29.细胞活力测定向96孔板中设定孔加入100ul的单个核细胞悬液，按设计加入处理药物100ul，置入37℃二氧化碳孵箱中，培养18h。取出培养板，放置室温，加入生物发光试剂cell-titer 10ul，振荡混匀后，转入白色测定板，glomax
tm
发光检测仪采用promega自带检测程序cell-titer protocol进行检测。检测结果自动生成excel数据。
30.分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至1
×
106/ml。取细胞悬液100ul及sglt-2抑制剂恩格列净加入96孔培养板，孵育18小时后，生物发光法进行细胞活力测定。结果(图1)发现sglt-2抑制剂恩格列净对体外骨髓细胞无毒性，在500nmol/l和250nmol/l的浓度下对受照小鼠骨髓细胞有显著保护作用。
31.实施例3对小鼠骨髓细胞活性氧的影响
32.骨髓细胞活性氧测定上述培养18h后的骨髓细胞，加入dcfh-da活性氧检测试剂，37度孵育20min。利用流式进行检测，分析恩格列净对小鼠骨髓细胞活性氧的影响。
33.分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2.5
×
105/ml。取细胞悬液1ml及sglt-2抑制剂恩格列净加入6孔培养板，孵育18小时后，dcfh-da进行细胞活性氧测定。结果见图2，发现sglt-2抑制剂恩格列净显著减少受照小鼠骨髓细胞中的活性氧。
34.实施例4对小鼠骨髓细胞凋亡的影响
35.骨髓细胞凋亡测定上述培养18h后的骨髓细胞，加入annexin v-fitc/pi试剂，室温避光孵育15min。利用流式进行检测，分析恩格列净对小鼠骨髓细胞凋亡的影响。
36.分离小鼠骨髓单个核细胞，调整细胞浓度至2.5
×
105/ml。取细胞悬液1ml及sglt-2抑制剂恩格列净加入6孔培养板，孵育18小时后，annexin v-fitc/pi进行细胞凋亡测定。结果见图3，发现sglt-2抑制剂恩格列净显著减少受照小鼠骨髓细胞中的凋亡。
37.实施例5对辐射暴露小鼠外周血及单侧股骨有核细胞计数的影响
38.在给予小鼠照射后给予sglt-2抑制剂，给药7天，10天后处死小鼠，取小鼠外周血及冲洗单侧股骨有核细胞，利用血细胞计数仪进行计数。
39.小鼠按照射剂量分为0、4gy，5只/组。照射后分别给予生理盐水、sglt-2抑制剂恩格列净20mg/kg/d，灌胃给药7天，每处理组5只。照射10天后，取外周血及单侧股骨骨髓细胞进行计数。结果发现(图4)，4gy照射对小鼠外周血和单侧股骨有核细胞计数具有明显的抑制作用，而恩格列净对4gy照射小鼠外周血及单侧股骨有核细胞计数具有明显的保护作用，与对照组相比，p＜0.05。
40.实施例6对辐射暴露小鼠外周血及单侧股骨有核细胞计数的影响
41.造血干祖细胞活性氧测定分离小鼠骨髓细胞，血细胞计数仪计数细胞调整细胞浓度，加入相应的表面抗体，避光孵育，随后加入ros染液，37度孵育20min。利用流式进行检测，分析sglt-2抑制对小鼠造血干祖细胞活性氧的影响。
42.小鼠按照射剂量分为0、4gy，5只/组。照射后分别给予生理盐水、sglt-2抑制剂恩格列净20mg/kg，灌胃给药7天，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞，进行细胞染色，检测ros水平。结果表明(图5)，恩格列净可显著降低受照小鼠细胞的ros水平。
43.实施例7对辐射暴露小鼠细胞nox-4水平的影响
44.造血干祖细胞nox-4和γh2ax测定分离小鼠骨髓细胞，血细胞计数仪计数细胞调整细胞浓度，加入相应的表面抗体，避光孵育，使用固定液固定24小时后破膜，随后加入相应抗体，4度孵育30min。利用流式进行检测，分析sglt-2抑制对小鼠造血干祖细胞nox-4和γh2ax的影响。
45.小鼠按照射剂量分为0、4gy，5只/组。照射后分别给予生理盐水、sglt-2抑制剂恩格列净20mg/kg，灌胃给药7天，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞，进行细胞染色，检测nox-4水平。结果表明(图6)，
46.实施例8对辐射暴露小鼠细胞γh2ax水平的影响
47.小鼠按照射剂量分为0、4gy，5只/组。照射后分别给予生理盐水、sglt-2抑制剂恩格列净20mg/kg，灌胃给药7天，每处理组5只。照射10天后，取骨髓细胞，进行细胞染色，检测γh2ax水平。结果表明(图7)，恩格列净可显著降低受照小鼠细胞的γh2ax水平。
48.根据体外、体内实验结果发现，sglt-2抑制剂恩格列净对辐射诱导的骨髓细胞功能损伤具有一定的保护作用，提示预防或者治疗给药可防治辐射诱导骨髓的损伤。