一种抗菌肽的用途

本发明属于生物，具体涉及一种抗菌肽的用途。

背景技术：

1、近年来，由于细菌的进化和抗生素的滥用，多重耐药细菌不断增长，导致临床抗感染治疗难度增加，越来越多的患者因为找不到合适的抗菌药而相继死亡，并成为全球第二大死亡原因，给一线临床医生造成巨大困扰与挑战。现有抗生素治疗已然不能满足临床治疗的需求，因此迫切需要寻找新的替代药物或治疗策略。

2、抗菌肽(amp)是一种低分子量蛋白质，具有广谱抗菌和免疫调节活性，可抵抗传染性细菌(革兰氏阳性和革兰氏阴性)、病毒和真菌感染。同时，微生物对大多数抗菌肽难以产生耐药性，这使得它们成为一种长期有效的产品。除此之外，抗菌肽还表现出高特异性、低毒性、生物多样性等特性。因其有望克服日益严重的抗生素耐药问题而引起了人们极大的兴趣。

3、甲烷氧化菌素(mbns)是甲烷氧化菌分泌的一种捕获铜的小分子肽，不同的甲烷氧化菌所产生的甲烷氧化菌素结构和组成会有一定的差别，但这类多肽均是一类带有翻译后修饰基团的肽。早期对于甲烷氧化菌素的结构表征因为其极易降解而难于进行，2004年kim等人才首次研究并得出了发孢甲基弯曲菌(methylosinus trichosporium)ob3b菌株分泌的甲烷氧化菌素结构：

4、

5、以lcgscypcscm序列为前体肽序列，其中的第二个和第八个半胱氨酸被修饰成恶唑酮-硫代酰胺基团。后续也有若干其他菌株分泌的mbn结构被表征出来，均具有典型的修饰基团，修饰基团通常包括恶唑酮-硫代酰胺，2,6-二羟基吡嗪-硫代酰胺等，但至今为止，结构明确的mbn的数量依然较少(dassama lm,kenney ge,rosenzweigac.methanobactins:from genome to function.metallomics.2017jan 25；9(1):7-20.doi:10.1039/c6mt00208k.pmid:27905614；pmcid:pmc5269455.)。

6、目前，研究人员对于mbns的生物活性包括抗氧化活性，金属螯合性等进行了诸多研究和报道，并且发现一些mbns还表现出一定的抗菌活性，作为抗菌肽在抗感染类药物中应用极具前景(周琦琼,辛嘉英,张颖鑫,董静,宋昊,夏春谷.甲烷氧化菌素的生物活性研究进展[j].生物技术通讯,2009,20(05):723-725.)。

7、然而，由于目前结构明确的mbns较少，其制备难度也较大，不同结构的mbns的活性变化难以准确预料。因此开发新的具有优异抑菌活性的甲烷氧化菌素类抗菌肽，具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种新型甲烷氧化菌素抗菌肽作为一种具有优异抗菌效果的抗菌剂的应用。

2、本发明提供了一种抗菌肽在制备抗菌剂中的用途，所述抗菌肽包括如下多肽中的任意一种或多种的混合物：

3、(a)序列为seq id no.1所示的多肽；

4、(b)序列为seq id no.2所示的多肽；

5、(c)序列为seq id no.3所示的多肽；

6、(d)序列为seq id no.4所示的多肽；

7、且所述多肽序列中包括如下修饰：半胱氨酸被修饰为恶唑酮-硫代酰胺基团；

8、其中，序列为seq id no.1所示的多肽占总肽段数的60％以上。

9、进一步地，上述抗菌剂是抗鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌中的任意一种或多种的药物。

10、更进一步地，上述抗菌剂是抗多重耐药鲍曼不动杆菌的药物。

11、进一步地，上述抗菌肽由如下方法制备得到：

12、(1)制备含有rrmbna基因、rrmbnb基因和rrmbnc基因的重组菌；

13、(2)诱导培养步骤(1)所述的重组菌，得到含抗菌肽的菌液；

14、(3)纯化步骤(2)的菌液，即得；

15、所述rrmbna基因序列如seq id no.5所示；rrmbnb基因序列如seq id no.6所示；rrmbnc基因序列如seq id no.7所示。

16、更进一步地，上述步骤(1)所述重组菌的制备方法如下：

17、1)分别构建含有序列如seq id no.5所示的核苷酸片段的重组质粒a，以及含有序列如seq id no.6和seq id no.7所示的核苷酸片段的重组质粒b；

18、2)将步骤1)制备得到的重组质粒a和b共转化至工程菌，得到阳性克隆即可。

19、更进一步地，上述重组菌的制备方法的步骤1)中，所述重组质粒a含有rbs区与seqid no.5融合而成的核苷酸片段p4；重组质粒b含有的序列seq id no.7的核苷酸片段上带有蛋白标签，优选为6×his标签。

20、更进一步地，上述rbs区与seq id no.5融合而成的核苷酸片段p4由：f1和r1、f2和r2、f3和r3互为模板和引物，经pcr扩增得到的；所述f1核苷酸序列如seq id no.8所示；所述r1核苷酸序列如seq id no.9所示；所述f2核苷酸序列如seq id no.10所示；所述r2核苷酸序列如seq id no.11所示；所述f3核苷酸序列如seq id no.12所示；所述r3核苷酸序列如seq id no.13所示。

21、更进一步地，上述pcr扩增为：分别以f1/r1、f2/r2、f3/r3互为模板和引物，经pcr扩增得到组成rrmbna基因的三个短片段p1、p2、p3；以p1、p2、p3为模板，f1/r3为引物，经重叠延伸pcr扩增得到rbs区和rrmbna基因全长的融合片段p4。

22、进一步地，上述步骤(2)诱导培养所用的诱导剂是iptg，所述重组菌为大肠杆菌bl21de3；所述含抗菌肽的菌液是向诱导培养后的重组菌菌体加入蛋白酶抑制剂破碎后得到的；优选地，所述蛋白酶抑制剂是pmsf。

23、进一步地，上述步骤(3)所述的纯化包括如下步骤：

24、1’)粗分离：菌液过镍柱亲和层析柱，洗脱得到复合物；

25、2’)超滤分离：将步骤1’)得到的复合物于超滤管离心，收集超滤管滤液；

26、3’)缓冲液置换：将步骤2’)得到的滤液经大孔吸附树脂纯化，超纯水冲洗去除缓冲液，用50％～70％乙腈或乙醇洗脱目标成分后冻干；

27、4’)分子筛再纯化：重悬步骤3’)得到的冻干粉，经superdex 75 10/300gl凝胶层析柱进行分离，收集洗脱峰，冻干即得纯化后的抗菌肽。

28、本发明的有益效果：本发明提供了一种具有新结构的甲烷氧化菌素类抗菌肽，具有优异的抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等多种细菌具有抑菌效果，特别是对于多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌活性优异，在抗菌抗感染药物、防腐剂等领域具有很好的应用前景。

29、本发明术语：“恶唑酮-硫代酰胺基团”结构为：本发明所述的半胱氨酸被修饰成恶唑酮-硫代酰胺基团，即是指多肽序列中的半胱氨酸部分结构：变成了

30、“rbs区”是指核糖体结合位点，是起始密码子上游的一段富含嘌呤的非翻译区。

31、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

32、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。