一种弓形虫核酸疫苗及其构建方法

本发明属于生物，具体涉及一种弓形虫核酸疫苗及其构建方法。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、传统的弓形虫病治疗方案为磺胺嘧啶钠和乙胺嘧啶配伍治疗。但是药物治疗存在很严重的副作用，比如毒性很大。由于疫苗具有无毒，便于制造和大规模应用等优点，被认为是取代药物治疗的一种很重要手段。核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(dna或rna)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗相比，核酸疫苗具有如下优点：免疫保护力增强；制备简单，省时省力；同种异株交叉保护；应用较安全；产生持久免疫应答；贮存、运输方便。尽管弓形虫疫苗种类很多，但是目前还没有应用到临床上的商品化疫苗。为此，研制一种高效、廉价、安全的疫苗是防控弓形虫病的迫切需求。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种弓形虫核酸疫苗及其构建方法。本发明将弓形虫rh毒株上的两个cdna片段sag2和srs2分别或共同插入到真核载体pbudce4.1上，获得重组质粒作为弓形虫核酸疫苗。本发明将弓形虫核酸疫苗对6-8周昆明小鼠进行3次主动免疫，每次间隔两周，通过测定免疫鼠的细胞和体液免疫指标来评价疫苗的免疫原性，通过体内攻虫实验来评估疫苗的免疫保护性。本发明可有效地增强实验动物体液免疫和细胞免疫反应，有效地减少实验动物死亡数量。因此，本发明的弓形虫核酸疫苗可作为预防弓形虫感染的有效候选疫苗。

2、为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：

3、第一方面，本发明提供了一种弓形虫核酸疫苗，包括以弓形虫rh的cdna为模板通过聚合酶链反应扩增获得的基因片段和载体构成的重组质粒；所述基因片段为sag2和srs2中的一种或多种，sag2的核苷酸序列如genbank:jx045478.1所示，srs2的核苷酸序列如genbank:af012276.1所示。

4、第二方面，本发明提供了一种弓形虫核酸疫苗的构建方法，包括以下步骤：

5、感染hff细胞，待细胞完全破裂后收集弓形虫rh，利用trizol法提取虫体rna，以弓形虫rh的rna为模板，利用反转录试剂盒获取cdna；

6、用引物flag-sag2-f-noti和sag2-r-kpni扩增sag2片段，用引物srs2-f-sali和srs2--r-xbai扩增srs2片段，sag2片段和srs2片段分别或共同插入到真核载体上，获得重组质粒，提取质粒并纯化，获得弓形虫核酸疫苗。

7、上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：

8、(1)本发明构建的重组质粒体外转染细胞后，使蛋白成功表达。

9、(2)本发明将弓形虫核酸疫苗对昆明小鼠进行主动免疫，免疫小鼠血清中有较高的抗体效价。

10、(3)使用弓形虫核酸疫苗的免疫小鼠存活率达到30％，疫苗免疫保护效果基本和磺胺药效果相当，是替代药物治疗的潜在方案。

技术特征：

1.一种弓形虫核酸疫苗，其特征在于，包括以弓形虫rh的cdna为模板通过聚合酶链反应扩增获得的基因片段和真核载体构成的重组质粒；

2.如权利要求1所述的弓形虫核酸疫苗，其特征在于，所述真核载体为pbudce4.1。

3.一种弓形虫核酸疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.如权利要求1所述的弓形虫核酸疫苗的构建方法，其特征在于，用moi＝5的比例感染hff细胞。

5.如权利要求1所述的弓形虫核酸疫苗的构建方法，其特征在于，所述真核载体为pbudce4.1。

6.如权利要求1所述的弓形虫核酸疫苗的构建方法，其特征在于，flag-sag2-f-noti的核苷酸序列如seq id no.1所示，sag2-r-kpni的核苷酸序列如seq id no.2所示。

7.如权利要求1所述的弓形虫核酸疫苗的构建方法，其特征在于，srs2-f-sali的核苷酸序列如seq id no.3所示，srs2--r-xbai的核苷酸序列如seq id no.4所示。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种弓形虫核酸疫苗及其构建方法。本发明将弓形虫RH毒株上的两个cDNA片段SAG2和SRS2分别或共同插入到真核载体pBudCE4.1上，获得重组质粒作为弓形虫核酸疫苗。本发明将弓形虫核酸疫苗对6‑8周昆明小鼠进行3次主动免疫，每次间隔两周，通过测定免疫鼠的细胞和体液免疫指标来评价疫苗的免疫原性，通过体内攻虫实验来评估疫苗的免疫保护性。本发明可有效地增强实验动物体液免疫和细胞免疫反应，有效地减少实验动物死亡数量。本发明的弓形虫核酸疫苗可作为预防弓形虫感染的有效候选疫苗。

技术研发人员：周春雪,郭旭东,刘岱昂
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11