用作细胞载体的胶原水凝胶的制作方法

本发明涉及胶原水凝胶、其制备方法及其作为细胞培养支架的用途。

背景技术：

1、用于培养生物细胞的载体通常是本领域已知的。这种载体通常被称为基质或支架。这些载体提供了繁殖地，或者一般来说，提供了细胞在细胞培养中生长的基础。

2、含有胶原蛋白的化合物是已知类型的细胞载体。胶原蛋白由结合在一起形成细长原纤维的三螺旋的氨基酸组成，称为胶原蛋白螺旋。胶原蛋白是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，占全身蛋白质含量的25％至35％。它主要存在于例如软骨、骨骼、肌腱、韧带和皮肤等结缔组织中。根据矿化程度，胶原蛋白组织可能是刚性的(骨骼)、柔性的(肌腱)或具有从刚性到柔性的梯度(软骨)。胶原蛋白在角膜、血管、肠道、椎间盘和牙齿上的牙本质中也很丰富。在肌肉组织中，它是肌内膜的主要组成部分。胶原蛋白占肌肉组织的1％至2％，占强壮肌腱肌肉重量的6％。成纤维细胞是最常见的制造胶原蛋白的细胞。胶原蛋白是细胞外基质的主要结构蛋白，是一种将结构和稳定性输送到组织的蛋白质支架，为细胞附着提供附着点，并影响和支持粘附细胞。

3、动物来源的胶原基生物材料已经在医学上使用了几年。特别是在用于止血的临床应用产品中或在整形外科的不同领域中，胶原材料已经被提议作为载体材料。然而，仅含胶原蛋白的组合物基于可溶性胶原蛋白，并且通常不够一致和牢固，如果没有交联剂的帮助，它们缺乏机械强度，或者不具有天然构型，即明胶。

4、在常规生产中，通过酸或酶处理以溶解形式提取胶原蛋白。由此产生的亚基，即三螺旋原胶原，必须在体外重组，只产生仅符合构建水凝胶或薄涂层条件的原纤维和细纤维。

5、水凝胶是一种含水但不溶于水的聚合物，其分子通过化学方式(例如通过共价键或离子键)或物理方式(例如通过连接聚合物链)连接以形成三维网络。由于整体的亲水聚合物成分，它们在相当大的体积摄入下在水中膨胀，但不会失去材料的内聚力。然而，水凝胶的缺点是，鉴于其巨大的保水能力，它们在机械上是不稳定的。胶原水凝胶已被提议作为细胞培养的载体。然而，由于复杂纤维缺乏机械稳定性和天然结构，并且水凝胶在与细胞定殖过程中经常凝结，因此它们的使用非常有限。

6、胶原蛋白的性质可以通过几种方式改变，从而形成离子键、氢键或共价键。网状结构的产生增加了胶原材料的生物降解时间和胶原纤维的机械强度，同时降低了这些纤维的吸水性、溶解度和酶降解速率。胶原蛋白可以通过物理方法或化学方法交联。

7、化学方法使用交联剂，如醛类化合物、碳二亚胺、二异氰酸酯或叠氮化物衍生物。它们的缺点是，其中一些试剂具有高毒性，并且额外的交联破坏了胶原纤维的天然结构，因此对胶原纤维的生物相容性和生物降解性是拮抗的。

8、在物理方法中，β或γ辐射不仅用于灭菌，还用于使胶原材料网状化。当使用β射线对脱水胶原蛋白进行灭菌时，会产生一种难以预测抵抗力的材料。us6706684b1描述了一种制备胶原材料的方法，该胶原材料的体内生物降解速度和机械性能可基于用β辐射照射湿态胶原材料来调节。所用的胶原材料可以是在酸性ph下天然溶解的胶原，或者是用胃蛋白酶消化处理后获得的胶原。它可以是牛胶原i型或iii型或其混合物，主要是通过碘酸的氧化破坏而改性的胶原；通过加热部分失去其螺旋结构的胶原蛋白、功能化胶原蛋白或具有大分子亲水添加剂的胶原蛋白。在所有这些情况下都使用可溶性胶原蛋白。所有这些胶原材料都被公开用于预防术后粘连和/或伤口愈合，并由可溶性胶原制成。

9、本领域公开的另一种增加胶原材料机械性能的方法是将胶原与其他材料组装。前面提到的us6706684b1公开了一种组件，其中打算通过辐射结构化的胶原成分已经预先与未变性胶原纤维的网络结合，该未变性胶原光纤的网络是压实压缩物的形式。其他替代方案是基于与其他组件形成支架。例如，p.n.oliveira等人公开了具有不同胶原蛋白：壳聚糖(coll∶ch)比例的多孔胶原蛋白/壳聚糖支架，通过冷冻干燥，随后通过脱氢热处理(dht)自交联，然后用β辐射灭菌来制备。还公开了将获得的胶原材料用作组织工程的生物材料(参见p.n.oliveira et al；“self-crosslinked fibrous collagen/ch itosan blends:processing,properties evaluation and monitoring of degradation by bi-fluorescence imaging”；international journal of biological macromolec ules,2019,pp.353-367)。

10、尽管本领域已经公开了一些内容，但是仍然需要提供可以大规模经济地生产而且没有不良毒性、具有高质量和稳定性的胶原材料，并且可以调节其性质以使胶原材料适应预期用途。

技术实现思路

1、本发明人已经开发了不可溶的和天然的纤维状胶原水凝胶结构，其可以在不添加稳定化学物质的情况下制备，并且在不需要使用交联剂的情况下产生抗性结构，这进一步显示了较宽范围的机械强度。这些水凝胶是具有一系列微孔的坚固的3d结构，在培养基中显出良好的稳定性，特别是良好完整性。它们可以与其他生物分子相互作用，并介导细胞粘附，因此可用于细胞支持。

2、它们可以由一定尺寸的天然原纤维胶原在酸性介质中的分散体来制备，特别是以1-15重量％的浓度分散在水中的天然i型胶原纤维，其中纤维的尺寸比可溶性胶原的尺寸更大。所述酸性物质包括纤维，在ph值为1和2之间测量时，其中纤维的量的至少90％具有在1μm至2500μm的范围内的长度，和在0.1至150μm范围内的纤维直径。更准确地说，所述酸性物质包括纤维，在ph值为1和2之间时测量，其中所述纤维的全部量的至少90％具有在10μm至2500μm范围内的长度和在5至80μm范围内的纤维直径；并且，其中胶原纤维的全部量的纤维长度的中位数在100和900μm之间。

3、与现有技术中通常使用的明胶形式的胶原蛋白(胶原蛋白已经不可逆地水解)或被酶处理的胶原蛋白不同，本发明中用作原材料的i型胶原蛋白的特征在于高度天然和纤维的尺寸。用于本发明的这种天然纤维状胶原原料通常用于食品工业，例如在火腿生产领域中作为网和肉之间的分离膜。

4、因此，与使用可溶性胶原的us6706684b1(现有技术中通常用于相关目的的胶原)不同，本发明中用作制备水凝胶的原料的胶原是不溶性胶原，由于其来自食品工业，所以更经济。出乎意料的是，这种不溶性胶原原料在适当处理后可以产生胶原水凝胶，例如本发明的那些特别适用于培养生物材料的胶原水凝胶。不溶性胶原的使用有助于向水凝胶提供用作细胞支持物的合适的机械性能。对这种胶原蛋白进行的处理(中和先前的酸性物质、调节生理ph值和应用β辐射)可能通过获得的交联度来控制最终水凝胶的硬度。

5、因此，本发明的第一方面涉及一种胶原水凝胶，其包含具有微孔的3d原纤维结构，能够通过包括以下步骤的方法获得：a)提供以重量计1-15％的浓度分散在水中的天然i型胶原纤维的酸性物质；b)中和酸性物质以调节ph值至生理ph值；和c)向步骤b)的中和后物质施加至多50kgy(即等于或低于50kgy)范围内的β辐射；其中，所述酸性物质的ph值在0.5-5之间并且包括纤维，在ph值为1和2之间时测量，所述纤维的全部量的至少90％具有在10μm至2500μm范围内的长度和在5至80μm范围内的纤维直径，并且其中胶原纤维的全部量的纤维长度的中位数在100至900μm之间。纤维的尺寸已经用实施例3a中公开的sympatecqicpic/lixell颗粒分析仪测量。

6、本发明的第二个方面涉及制备如上定义的胶原水凝胶的方法，包括以下步骤：a)提供如上定义的分散在水中的天然i型胶原纤维的酸性物质，b)中和酸性物质以调节ph值至生理ph值；和c)向步骤b)的中和后物质施加至多50kgy的范围内的β辐射。本发明的胶原水凝胶的制备可以大规模复制并且具有恒定的高质量。

7、本发明的胶原水凝胶因其良好的生物相容性和高机械稳定性而脱颖而出，具有广泛的应用前景。特别是，由于其在细胞粘附和器官形成中的核心作用，是细胞培养和组织工程的理想基质。因此，本发明的第三方面涉及如上定义的胶原水凝胶作为细胞生长的支持物或作为培养肉的支架的用途。

8、本发明的第四个方面涉及一种培养生物材料的方法，包括以下步骤：a)提供载体材料，所述载体材料为如上定义的胶原水凝胶；b)将所述生物材料与步骤a)的胶原水凝胶接触；和c)在培养条件下将所述生物材料与胶原水凝胶材料一起孵育。

9、本发明的第五个方面涉及如上定义的胶原水凝胶，其包括用于生物医学应用的粘附细胞层，例如基于细胞的治疗或作为联合高级治疗药物(atmp)的粘附细胞层。