用于疫苗递送的非病毒DNA载体的制作方法

本公开整体涉及针对病原生物体和癌症的免疫原的疫苗。更具体地，本公开涉及用于在受试者或细胞中表达抗原或抗原蛋白的非病毒载体。本公开还涉及包含核酸的核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，以及将编码抗原或抗原蛋白的转基因递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。

背景技术：

1、现有和新出现的传染性病原体在世界范围内持续引起显著的发病率、死亡率和经济负担。大部分死亡仅由几种病原体引起：在大约1400种公认的人类病原体和寄生虫中，大部分死亡由呼吸疾病、腹泻、hiv/aids、tb、疟疾、脑膜炎、百日咳、麻疹、乙型肝炎和性传播疾病(std)引起(dye c.after 2015：infectious diseases in a new era of health anddevelopment.(2014)philosophical transactions of the royal society oflondon.series b,biological sciences,369(1645),20130426.doi：10.1098/rstb.2013.0426)。某些疾病被认为是特别重要的，例如，因为它们在出现时具有100％的致死率，例如hiv/aids；或者因为传染性病毒病原体导致的疾病超出了主要感染者的范围，例如由寨卡病毒感染引起的出生缺陷的出现。

2、用于对抗病原体的治疗产品包括预防性免疫，诸如疫苗，以及感染后治疗剂，诸如抗细菌剂和抗病毒剂。疫苗是由致病性微生物病原体或微生物体或病毒体的一种或几种特异性抗原组成的治疗剂，其整个抗原组诱导接受个体的免疫应答和/或病原体自身的细胞应答(cassone,a.,&rappuoli,r.(2010).universal vaccines:shifting to one formany.bio.1(1),e00042-10.doi:10.1128/mbio.00042-10)。疫苗通过诱导能够快速控制复制病原体或灭活其毒性组分的效应机制来进行保护。

3、虽然疫苗接种提供了一种经济有效的措施来预防疾病和控制群体水平的感染爆发，但是目前市场上的疫苗具有显著的缺点并且有时会失效。

4、重组aav(raav)可能是人类基因转移研究最好的载体，数百项临床试验证明转导的安全性。腺相关病毒(aav)属于细小病毒科(parvoviridae family)，并且更具体地说，构成依赖病毒属(dependoparvovirus genus)。来源于aav的载体(即，ravv或aav载体)对于递送遗传物质是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，因此减少宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人类中被认为是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型aav不同，复制缺陷型aav载体缺乏复制(rep)基因并且通常持续作为附加体，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其他载体系统相比，aav载体通常被认为是相对较差的免疫原，因此不会触发显著的免疫应答(参见(ii))，从而获得载体dna的持久性和治疗性转基因的潜在长期表达。

5、然而，使用aav粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与raav相关联的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源dna(dong等人,1996；athanasopoulos等人,2004；lai等人,2010)，因此，aav载体的用途被限制在小于150,000da的蛋白质编码容量。特别是与抗体递送有关，aav的包装限制对形成天然抗体结构的重链和轻链的有效递送提出了重大挑战。第二个缺点是，由于人群中野生型aav感染盛行，所以必须筛查raav基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，该免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的该载体作出反应，以刺激免疫系统生成高滴度的抗aav抗体，从而杜绝了进一步治疗。预先存在的免疫可能严重限制转导的效率。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链aav dna转化为双链dna，所以aav介导的基因表达的启动相对较慢。

6、已经充分研究了表达未知抗原蛋白的腺病毒载体用于基因和癌症治疗和疫苗。除了广泛的安全性之外，利用腺病毒载体的优点是相对稳定、易于获得高滴度并且能够感染多种细胞系，这归因于其效力。尽管重组腺病毒载体由于其高转导效率和转基因表达而在如今被广泛使用，但是存在针对该载体的预先存在的免疫性的可能性，因为大多数群体已经暴露于腺病毒(id)。这已经在人免疫缺陷病毒(hiv-1)iib期疫苗试验中被证明是有害的，在该试验中基于载体的疫苗为hiv-1复制提供了有利的条件(smaill,f.等人，sci.transl.med.(2013)5:205)。

7、因此，本领域仍然需要开发改进的疫苗治疗剂。

技术实现思路

1、本文所述的技术涉及具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)dna载体(本文称为“封闭端dna载体”或“cedna载体”)，其中cedna载体包含编码抗原或免疫原性肽的核酸序列。将表达编码一种或多种抗原或免疫原性肽的一个或多个核酸序列的一种或多种cedna载体应用于受试者可用于：治疗、预防或降低受试者的疾病或病症的严重程度，在递送中是微创的，是可重复的和剂量有效的，具有治疗效果的快速起效，和/或导致抗原或免疫原性肽的持续表达。

2、与离体制造并且可能触发不期望的细胞应答的传统疫苗不同，本文所述的cedna疫苗以更天然的方式呈递给细胞系统。通过使用cedna载体将编码抗原或免疫原性肽的转基因(例如，核酸序列)递送至细胞或组织，避开了适应性免疫应答，并且在不使用免疫或被动转移的情况下产生了期望的抗体特异性。即，cedna载体通过内吞作用进入细胞，然后从内涵体区室逃逸并转运到细胞核。具有转录活性的cedna附加体导致抗原的表达，然后该抗原可以从细胞分泌到循环中。因此，cedna载体可以使得能够连续、持续和长期递送通过单次注射施用的抗体(例如，本文所述的治疗性抗体或其抗原结合片段)。这在核酸疫苗组合物的背景下是特别有利的，其中与mrna疫苗相比，dna疫苗显示出更慢的表达增加和更持续的表达，mrna疫苗可显示出更多增加的初始表达并且更快地减少。

3、根据一些方面，本公开提供了一种无衣壳封闭端dna(cedna)载体，其包含在侧接反向末端(itr)之间的至少一个核酸序列的，其中所述至少一个核酸序列编码抗原或免疫原性肽。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽来源于细菌、病毒、真菌或寄生虫感染因子。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是肿瘤相关抗原。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽与自身免疫病症相关联。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，抗原或免疫原性肽选自表1-8中列出的那些中的一种或多种。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体包含操作性地连接到至少一个核酸序列的启动子序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体包含至少一个聚a序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体包含5'utr和/或内含子序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体包含3'utr序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体包含增强子序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，至少一个itr包含功能末端解链位点和rep结合位点。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(aav)的病毒。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，侧接itr相对于彼此对称或不对称。根据一些实施方案，侧接itr是对称的或基本上对称的。根据一些实施方案，侧接itr是不对称的。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr是野生型的，或者其中所述itr中的两个itr都是野生型itr。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，侧接itr来自不同病毒血清型。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，侧接itr选自表8中示出的任何病毒血清型对。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr包含选自表9中的一个或多个序列的序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的至少一个itr由于影响itr的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型aav itr序列改变。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr来源于选自以下的aav血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11和aav12。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr是合成的。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr不是野生型itr，或者其中所述itr中的两个itr都不是野生型itr。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr通过选自a、a'、b、b'、c、c'、d和d'的itr区域中的至少一个itr区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。根据一些实施方案，所述缺失、插入和/或取代使得通常由a、a'、b、b'、c或c'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由b和b'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由c和c'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由b和b'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由c和c'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr在通常包含由b和b'区域形成的第一茎-环结构以及由c和c'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr在通常包含由b和b'区域形成的第一茎-环结构以及由c和c'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述itr中的一个或两个itr在通常包含由b和b'区域形成的第一茎-环结构以及由c和c'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，两个itr以使得当itr相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体囊封在脂质纳米粒子(lnp)中。

4、根据一些方面，如本文的方面和实施方案中所述的cedna载体用作疫苗。

5、根据一些方面，本公开提供了一种在细胞中表达抗原或免疫原性肽的方法，该方法包括使细胞与任何前述方面和实施方案的cedna载体接触。根据一些实施方案，细胞在体外或体内。根据一些实施方案，至少一个核酸序列经密码子优化以在细胞中表达。

6、根据一些方面，本公开提供了一种治疗患有细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的cedna载体。

7、根据一些方面，本公开提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的cedna载体。

8、根据一些方面，本公开提供了一种治疗患有自身免疫疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的cedna载体。

9、根据一些方面，本公开提供了一种预防受试者的细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的cedna载体。

10、根据一些方面，本公开提供了一种预防受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的cedna载体。

11、根据一些方面，本公开提供了一种预防受试者的自身免疫疾病的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的cedna载体。

12、根据前述方面和实施方案的一些实施方案，该方法还包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，cedna载体通过静脉内、皮下、瘤内或肌肉内注射施用。

13、根据一些方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含任何前述方面和实施方案的cedna载体。根据一些实施方案，药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。

14、根据一些方面，本公开提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含任何前述方面和实施方案的cedna载体。

15、根据一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含任何前述方面和实施方案的cedna载体、以及脂质。根据一些实施方案，脂质是脂质纳米粒子(lnp)。根据一些实施方案，组合物是冻干的。

16、根据一些方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包括任何前述方面和实施方案的cedna载体、任何前述方面和实施方案的药物组合物或任何前述方面和实施方案的组合物。

17、本公开的这些和其他方面在下文中更详细地描述。