SARS-CoV-2亚单位疫苗的制作方法

本发明涉及蛋白质亚单位疫苗，其包含来自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的至少一种变体的至少一种抗原，以及可选的至少一种佐剂和至少一种免疫刺激剂。本发明还涉及所述疫苗用于产生针对sars-cov-2的至少一种变体的免疫原性和/或保护性免疫应答的用途，以及包含一剂或多剂所述疫苗的试剂盒。

背景技术：

1、sars-cov-2是一种携带单链正义rna基因组(约30kb)的包膜病毒，属于冠状病毒科乙型冠状病毒属。病毒rna编码4种结构蛋白(包括刺突蛋白(s)、包膜蛋白(e)、膜蛋白(m)和核衣壳蛋白(n))、16种非结构蛋白和9种辅助蛋白。s糖蛋白由胞外结构域(可加工成s1和s2亚单位)、跨膜结构域和胞内结构域组成。与sars-cov类似，sars-cov-2通过s1亚单位内的受体结合结构域(rbd)与人血管紧张素转换酶2(ace2)结合，以促进进入宿主细胞，然后通过s2亚单位介导膜融合。

2、开发安全有效的covid-19疫苗并不容易，但疫苗的制造、分销和管理也可能面临巨大的挑战，特别是在发展中国家以及如果必须注射疫苗的情况下，因为需要冷链来保持其稳定性和活性。针对covid-19的多种疫苗策略也在深入研究中，其中刺突蛋白是主要目标。这些疫苗由不同的平台生产：rna、dna、重组蛋白、基于病毒运载体、病毒样颗粒(vlp)、减毒活病毒和灭活病毒。这些不同类型的候选疫苗面临着与开发、制造、储存和分销进行大规模疫苗接种相关的各种挑战。

3、亚单位疫苗或重组蛋白疫苗使用完整蛋白(例如刺突蛋白)或蛋白片段(例如s1、rbd或融合蛋白)作为抗原。与其他类型的疫苗相比，亚单位疫苗具有若干优点，例如它们便宜且易于生产，并且比其他类型的疫苗(例如基于mrna或含有完整病毒或细菌的疫苗)更稳定。

4、然而，亚单位疫苗的主要缺点是用于引发免疫应答的抗原可能缺乏某类病原体所共有的称为病原体相关分子模式的分子结构。这些结构可以被免疫细胞读取并识别为危险信号，因此它们的缺失可能会导致免疫应答较弱。此外，由于这些类型的抗原不感染细胞，因此亚单位疫苗主要专门触发抗体介导的免疫应答。同样，这意味着该免疫应答可能弱于其他类型的疫苗。为了克服这个问题，亚单位疫苗有时与佐剂一起递送。因此，亚单位疫苗在制剂中往往需要佐剂以增加免疫原性。

5、已经开发或研究了若干种佐剂和免疫刺激剂，例如铝盐、水包油乳剂(mf59、as03和af03)、病毒体和as04作为佐剂，以及qs-21或其他皂苷、单磷酰脂a(mpla)、cpg(odn)作为免疫刺激剂。然而，选择合适的佐剂有助于在先天水平和适应性水平上促进针对目标病原体的适当免疫应答，从而在保持安全性的同时引发保护性免疫，这一点至关重要，但并不简单。选择错误的佐剂可能会导致特定的疫苗抗原不能胜任。因此，疫苗抗原的选择必须考虑佐剂的选择，以避免丢弃潜在有效的候选疫苗抗原。开发安全的疫苗同时获得适当的功效仍然是最重要的需求。

6、因此，需要针对sars-cov-2的安全且有效的新的疫苗，特别是使免疫原性增强的疫苗。

技术实现思路

1、一般定义

2、必须注意的是，除非上下文另有明文说明，否则如本文所使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代。此外，除非另有说明，否则一系列元素之前的术语“至少”应理解为指该系列中的每个元素。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物旨在涵盖在本发明中。

3、当涉及给定的量或数量时，术语“约”表示数字可以在其指定值附近±20％之间变化。优选地，“约”意指其值附近±15％，更优选地，“约”意指其值附近±10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％，甚至“约”意指其值附近±1％，按照该优先顺序。

4、如本文所使用的，多个引用的元素之间的连接术语“和/或”被理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，当两个元素通过“和/或”连接时，第一选项指的是在没有第二元素的情况下第一元素适用。第二选项是指在没有第一元素的情况下第二元素适用。第三选项是指第一元素和第二元素一起适用。这些选项中的任何一个都被理解为落入该含义内，并且因此满足如本文所使用的术语“和/或”的要求。多于一个选项同时适用也被理解为落入该含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。

5、在通篇说明书以及权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise、comprises和comprising)”及变形将被理解为暗示包括所称的整体或步骤、或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤、或整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以被术语“含有”或“包括”替代，或者有时当在本文中使用时被术语“具有”替代。任何前述术语(包含、含有、包括、具有)，无论何时在本发明的方面或实施方式的上下文中使用时，都可以用术语“由......组成”替代，尽管是次优选的。

6、当本文使用“由......组成”时，排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”并不排除不会实质上影响权利要求的基本特征和新颖特征的材料或步骤。

7、本文中的术语“亚型”可以替换为“物种”。它包括任何严重急性呼吸综合征冠状病毒(即sars-cov-2)的株、分离株、进化枝、谱系(lineage)、系(linage)和/或变体。术语“株”、“进化枝”、“谱系或系”、“分离株”和/或“变体”是本领域技术人员熟知的技术术语，涉及微生物的分类学，即，涉及所有表征为科、属、种、株的等级顺序的微生物。科成员的标准是其系统发育关系，属包括具有共同特征的所有成员，而种则被定义为构成复制谱系并占据特定生态位的多原则分类。术语“株”或“进化枝”描述了与其他微生物具有共同特征(如基本形态或基因组结构和组织)但在生物学特性(如宿主范围、组织嗜性、地理分布、减毒或致病性)上有所不同的一种微生物(在本发明中即病毒)。在本发明中，术语“变体”描述了复制并将一个或多个新突变引入其基因组中从而导致与原始病毒的差异的微生物(在本发明中即病毒)。术语“谱系”或“系”描述了衍生自共同祖先的一组病毒序列，这些序列与流行病学事件相关，例如，病毒被引入到不同的地理区域，并有进一步传播的证据。谱系旨在捕捉大流行的即将来临，并具有适合基因组流行病学监测和暴发调查的细粒度分辨率。例如，rambaut a.et al.a dynamic nomenclature proposal for sars-cov-2lineages toassist genomic epidemiology.nat microbiol.2020；5(11):1403-1407中描述了sars-cov-2谱系命名法。因此，“严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)的至少一种变体”是指sars-cov-2病毒的至少一种变体、毒株、分离株、谱系或系、和/或进化枝。优选地，术语“变体”与之前的定义一致，并且也与who网站一致，特指衍生自相同祖先或病原学病毒(即，在这种情况下为sars-cov-2病毒)的具有一个或多个突变的不同sars-cov-2病毒序列。因此，在该具体上下文中，术语“sars-cov-2变体”或“sars-cov-2谱系或谱系”优选地理解为不包括来自其他病毒(例如sars或mers病毒)的病毒基因组，也不包括衍生自所述其他病毒的病毒基因组。

8、更优选地，术语“变体”或“系”包括编码与参考毒株sars-cov-2 wuhan-hu-1的刺突蛋白(genbank登录号qhd43416.1或uniprotid：p0dtc2)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、优选至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性百分比的刺突蛋白的所有sars-cov-2病毒序列(当两个刺突蛋白进行局部比对时，例如通过使用基本局部比对搜索工具(blast)进行局部比对时)。

9、还更优选地，术语“变体”或“系”包括编码与参考毒株sars-cov-2 wuhan-hu-1的刺突蛋白的rbd(genbank登录号qhd43416.1或uniprotid：p0dtc2，氨基酸残基319至541)具有至少85％、86％、87％、88％或89％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％、最优选至少95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性百分比的刺突蛋白的rbd的所有sars-cov-2病毒序列(当两个rbd蛋白进行局部比对时，例如通过使用基本局部比对搜索工具(blast)进行局部比对时)。

10、sars-cov-2的不同变体可以在数据库中找到，例如emma b.hodcroft.2021.“covariants:sars-cov-2mutations and variations of interest”(covariants.org/variants)或o’toole a.et al.,2020“a dynamic nomenclature proposal for sars-cov-2lineages to assist genomic epidemiology”,pango谱系(cov-lineages.org/)。

11、在两个或更多个核苷酸序列、多肽序列或蛋白质序列的背景下，术语“序列同一性”或“同一性百分比”是指当使用序列比较算法(例如，通过blast比对或本领域技术人员已知的任何其他算法)或者通过目视检查进行比较和比对与第二分子的最大对应时，两个或更多个序列或子序列是相同的(“同样的”)，或具有相同的核苷酸或氨基酸残基的特定百分比(“同一性百分比”)。“序列同一性”或“同一性百分比”可以通过计算核酸、多肽或蛋白质中相同位置处相同核苷酸或氨基酸的数量来确定。同一性百分比的计算包括确定两个或更多个序列之间的最佳比对。比对可以考虑每个待测试序列中的插入和缺失(即“空位”)，例如但不限于核酸的非编码区以及多肽序列的截短或延伸。诸如基本局部比对搜索工具(blast)的计算机程序和算法可用于确定同一性百分比。blast是美国国家生物技术信息中心提供的众多资源之一。因为遗传密码是简并的，并且超过一个密码子就可以编码给定的氨基酸，所以如果核酸编码相同的多肽，则核酸的编码区被认为是相同的。因此，同一性百分比也可以基于核酸编码的多肽来计算。同一性百分比可以基于全长共有基因组序列或基因组序列的一部分来计算，例如但不限于单独的开放阅读框(orf)。

12、如果经最佳比对，本发明的蛋白质或肽与合成的或天然存在的蛋白质或衍生自其的肽具有至少约60％同一性的氨基酸序列同一性，通常至少约70％的同一性，更通常至少约80％的同一性，优选至少约90％的同一性，更优选至少约95％的同一性，最优选至少约98％或100％的同一性，则本发明的蛋白质或肽与另一种蛋白质或肽基本上相同。同一性是指两个多肽或两个多核苷酸序列之间的序列相关性程度，这通过两串这种序列、例如全部且完整的序列之间匹配的同一性确定的。同一性可以很容易地计算出来。虽然存在多种测量多肽序列之间同一性的方法，但术语“同一性”是本领域技术人员众所周知的。

13、关于本文所述的蛋白质、多肽、抗原蛋白质片段、抗原和表位的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在对序列进行比对并且如有必要引入空位(以实现最大序列同一性百分比)、并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分后，候选序列中与参考序列(即，其所衍生自的蛋白质、多肽、抗原蛋白质片段、抗原或表位)中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件如blast、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。

14、本文所用的术语“对象”或“宿主”是活的多细胞脊椎动物生物体，包括例如人和非人哺乳动物，包括(非人)灵长类动物，伴侣动物例如狗和猫，和家养动物例如马、牛物种例如牛和羊、雪貂、猪物种例如猪、仔猪、母猪或后备母猪，以及动物园哺乳动物例如猫科动物、犬科动物和牛科动物。因此，术语“对象”或“宿主”在本文中可以与术语“动物”或“人”互换使用。通常，“对象”是人。例如，人可以是新生儿(2个月以下)、婴儿(出生至2岁)、儿童(2岁至14岁)、青少年(15岁至18岁)、成人(18岁以上)或老年人(约65岁或以上)。

15、针对抗原或组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是对象对目标组合物中存在的抗原产生的先天免疫应答、体液免疫应答和/或细胞免疫应答。当术语“增强”用于针对sars-cov-2抗原的免疫应答时，例如抗体应答(例如，中和抗原特异性抗体应答)、细胞因子应答、cd8 t细胞应答(例如，免疫显性cd8 t细胞应答)或cd4 t细胞应答，是指施用了包含至少一种sars-cov-2抗原的对象中免疫应答相对于从施用不包含任何sars-cov-2抗原的疫苗观察到的相应免疫应答而言的增加。

16、在本发明的上下文中，术语“单体”优选用于指但不限于来自sars-cov-2病毒的任何变体的刺突蛋白的受体结合结构域(rbd)或s1亚单位。具体地，本文使用的术语“单体”指包含以下、由以下组成或基本上由以下组成的任何蛋白质：seq id no：1、2、3或4、或在其全长上与序列seq id no：1、2、3或4中的任意一个具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。单体具有与至少一个其他单体分子形成化学键以形成多聚体即二聚体、三聚体、四聚体、五聚体等的能力。二聚体是由两个单体形成的多聚体，这些单体的序列可以相同，也可以不同。

17、“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原或免疫原可以包含：完整的生物体，其是灭活的、减毒的或活的；生物体的亚单位或部分片段；包含具有免疫原性特性的插入物的重组运载体；能够在呈递给宿主动物后诱导免疫应答的dna片段；多肽、蛋白质或其片段、表位或其任意组合。在本发明的上下文中，“抗原”是指包含至少一个单体或由至少一个单体组成的蛋白质。在本发明的上下文中，“抗原”是指包含至少一种多聚体或由至少一种多聚体组成的蛋白质。多聚体或抗原可包含两个单体(二聚体抗原或二聚抗原)、三个单体(三聚体抗原或三聚抗原)、四个单体(四聚体抗原或四聚抗原)或更多个单体。术语“多聚抗原”或“多聚体抗原”是同义的。在抗原由两个单体(理解为两个rbd、两个s1、或各一个)组成的特定情况下，则该抗原被理解为二聚体的形式。应注意，“二聚抗原”和“二聚体形式的抗原”是同义的并且在本文中可互换使用。在本发明的上下文中，二聚抗原的两个单体可选地通过接头彼此化学连接或结合。“彼此结合”是指二聚体的单体通过非常弱、弱、强或非常强的键化学连接，例如通过共价键、非共价键、二硫键或肽键化学连接。

18、在本发明中，描述了两种二聚体形式的抗原：“非融合二聚体”和“融合二聚体”。在本文中“非融合二聚体”理解为由两个单体形成的抗原，其中两个单体通过可逆键彼此结合，例如通过它们的半胱氨酸之间形成的分子间二硫键，从而形成非融合二聚抗原。例如，本文提及的“非融合二聚体”是在被编码所述rbd单体的核酸转染后在细胞内产生的两个可溶性rbd单体，并且当rbd单体释放到细胞上清液时它们例如通过其游离的(未结合的)半胱氨酸彼此相互作用以形成二硫键，从而形成本文所称的“非融合二聚体”。重要的是，非融合二聚体中的两个单体不是通过肽键连接的，也不是单个多肽的一部分。

19、在本文中“融合二聚体”是指由两个单体形成的抗原，其中两个单体一个接一个地连接，使得它们合成或翻译为单个单位，并因此融合二聚体的两个单体是单个多肽的一部分。因此，与非融合二聚体的单体相反，融合二聚体中包含的两个单体通过肽键连接，可选地通过接头连接。

20、此外，在本发明中，当提到“二聚抗原”或“二聚体形式的抗原”时，应当理解为包括上述非融合二聚抗原和融合二聚抗原。“单体rbd抗原”或“rbd-单体”在本文中是指包含一个单体或由一个单体组成的抗原，其中该单体是rbd。“二聚rbd抗原”或“rbd-二聚体”在本文中是指包含彼此结合的两个单体或由彼此结合的两个单体组成的抗原，其中所述单体是rbd。如果“二聚rbd抗原”是非融合二聚体，则在本文中将其称为“非融合二聚rbd抗原”或“非融合rbd-二聚体”。如果“二聚rbd抗原”是融合二聚体，则其被称为“融合二聚rbd抗原”或“融合rbd-二聚体”。除非指定“二聚rbd抗原”是“非融合二聚rbd抗原”或“融合二聚rbd抗原”，否则应理解，“二聚rbd抗原”涵盖两种类型，即rbd的融合二聚体和非融合二聚体。“单体s1抗原”或“s1-单体”在本文中是指包含一个单体或由一个单体组成的抗原，其中该单体是s1。“二聚s1抗原”或“s1-二聚体”在本文中是指包含彼此结合的两个单体或由彼此结合的两个单体组成的抗原，其中所述单体是s1。如果“二聚s1抗原”是非融合二聚体，则在本文中将其称为“非融合二聚s1抗原”或“非融合s1-二聚体”。如果“二聚s1抗原”是融合二聚体，则其被称为“融合二聚s1抗原”或“融合s1-二聚体”。除非指定“二聚s1抗原”是“非融合二聚s1抗原”或“融合二聚s1抗原”，否则应理解，“二聚s1抗原”涵盖两种类型，即s1的融合二聚体和非融合二聚体。

21、体内抗原的存在通常会引发免疫应答。因此，抗原被抗体“靶向”。“表位”是指抗原的特异性抗原决定簇。表位可包含空间构象中的三个氨基酸，该空间构象对该表位是独特的。通常，表位由至少五个这样的氨基酸组成，更通常由至少8-10个这样的氨基酸组成。确定此类氨基酸的空间构象的方法是本领域已知的。

22、亚单位疫苗是向免疫系统呈递一种或多种抗原而不引入完整或其他形式的病原体颗粒的疫苗。“蛋白质亚单位疫苗”在本文中是指来自病毒或细菌病原体的特异性分离抗原。“蛋白质亚单位疫苗”在本文中也指来自病毒病原体的特异性重组抗原。

23、“sars-cov-2刺突(s)蛋白”是指sars-cov-2病毒的四种结构蛋白(刺突(s)蛋白、核衣壳(n)蛋白、包膜(e)蛋白和膜(m)蛋白)中的一种。s蛋白的大小约为180-200kda，由胞外n端、锚定在病毒膜上的跨膜(tm)结构域和胞内c端短片段组成。sars-cov-2 s蛋白的总长度约为1273个氨基酸，由位于n端的信号肽(氨基酸1-13)、s1亚单位(13–685残基)和s2亚单位(686–1273残基)组成；最后两个区域分别负责受体结合和膜融合。在s1亚单位中，具有n端结构域(14-305残基)和受体结合结构域(rbd，319-541残基)；融合肽(fp)(788-806残基)、七肽重复序列1(hr1)(912-984残基)、hr2(1163-1213残基)、tm结构域(1213-1237残基)和细胞质结构域(1237-1273残基)包含s2亚单位。因此，“s1”或“s1亚单位”或“s1抗原”是指位于冠状病毒(cov)的刺突蛋白上的s1亚单位，“rbd”或“rbd抗原”是指位于冠状病毒(cov)的刺突蛋白上的受体结合结构域。

24、根据本发明的抗原的“免疫原性片段”是抗原的部分氨基酸序列或也充当抗原的此类片段的功能等效物，其被抗原特异性抗体或b细胞受体检测并结合。抗原的免疫原性片段比完整抗原短，并且优选长度在约10、50或100至约1000个氨基酸之间，更优选长度在约10、50或30至约500个氨基酸之间，甚至更优选长度在约50至约250个氨基酸之间。rbd或s1抗原的片段包含具有至少15、20或65个连续氨基酸残基的氨基酸，其分别与seq id no：1、3、4或seq id no：2的至少约15、20或65个连续氨基酸残基具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、优选至少约95％、更优选地至少约98％的序列同一性。根据所选择的表达系统，蛋白质片段可以以天然糖基化形式表达，或者可以不以天然糖基化形式表达。

25、“基本上对应于”sars-cov-2病毒的蛋白质或片段的蛋白质或片段是与sars-cov-2病毒的指定蛋白质或片段具有基本上相同的氨基酸序列并且具有基本上相同的功能的蛋白质或片段。

26、与sars-cov-2病毒的蛋白质或片段具有“基本上相同的氨基酸序列”的蛋白质或片段通常与该蛋白质或片段具有超过90％的氨基酸同一性。该定义中包括保守氨基酸取代。

27、本文使用的“抗体”是多克隆和/或单克隆抗体或其片段，包括重组抗体片段及其免疫结合等效物，其能够特异性结合sars-cov-2蛋白和/或其片段。术语“抗体”用于指同质分子实体或混合物，例如由多种不同分子实体构成的血清产物。重组抗体片段可以例如衍生自单克隆抗体或可以从由免疫的非人动物构建的文库中分离。

28、本文所用的“佐剂”是用于增强免疫应答的物质。佐剂一词衍生自拉丁语：adjuve，意思是“帮助”。许多类别的化合物已被描述为佐剂，包括矿物盐、微生物产物、乳剂、皂苷、细胞因子、聚合物、微粒和脂质体。目前存在多种具有佐剂特性的化合物，它们通过不同的作用机制发挥其功能。根据作用机制，佐剂可分为递送系统和免疫刺激剂(免疫增强剂)(apostólico j.et al.adjuvants:classification,modus operandi,and licensing.jimmunol res.2016；2016:1459394)。递送系统佐剂可以充当抗原可与之相关的载体，还可以产生局部促炎反应，将先天免疫应答细胞募集到注射部位。免疫刺激剂的作用是通过模式识别受体(prr)活化先天反应或直接(即细胞因子)活化先天反应。一般来说，prr的激动剂活化诱导“抗原呈递细胞”(apc)活化/成熟以及细胞因子/趋化因子的产生，最终导致适应性免疫应答。因此，本文使用的“免疫刺激剂”是通过诱导免疫系统的任何组分的活化或增加活性来刺激免疫系统的化合物。刺激衍生自免疫刺激剂对免疫系统本身的细胞的直接或间接刺激作用。免疫刺激剂可以通过模式识别受体(prr)活化免疫应答或直接活化免疫应答。免疫刺激剂可以是天然化合物或合成化合物。免疫刺激剂可以单独给予以活化非特异性防御机制，或者可以与疫苗一起施用以活化非特异性防御机制并增强特异性免疫应答。免疫刺激剂可以与抗原和其他佐剂组合。

29、“ec50”或“半最大有效浓度”或“50％有效稀释度”在本文中是指提供半最大结合(观察到的其最大效果的50％)的血清中抗体的浓度。ec50可以通过稀释系列与靶抗原的直接且可饱和结合来确定。基于假病毒的中和测定中的ec50是在减去对照组中的背景rlu后，相对光单位(rlu)与病毒对照孔相比减少50％时的稀释度。在基于假病毒的中和测定中确定ec50的方法是本领域技术人员已知的，例如nie j.et al.establishment andvalidation of a pseudovirus neutralization assay for sars-cov-2.emergmicrobes infect.2020dec；9(1):680-686、nie j.et al.quantification of sars-cov-2neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.nat protoc.2020nov；15(11):3699-3715、或hu j.et al.development of cell-based pseudovirus entryassay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizingantibodies against sars-cov-2.genes dis.2020dec；7(4):551-557中描述的方法。

30、“ic50”或“半最大抑制浓度”或“50％抑制稀释度”在本文中是指抑制50％感染所需的血清中抗体的浓度。ic50可以通过稀释系列与靶抗原的直接且可饱和结合来确定。基于假病毒的中和测定中的ic50是在减去对照组中的背景rlu后，相对光单位(rlu)与病毒对照孔相比减少50％时的稀释度。在假病毒中和测定中测定ic50的方法是本领域技术人员已知的，例如nie j.et al.establishment and validation of a pseudovirus neutralizationassay for sars-cov-2.emerg microbes infect.2020dec；9(1):680-686、nie j.etal.quantification of sars-cov-2neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay.nat protoc.2020nov；15(11):3699-3715、或hu j.et al.development ofcell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entryinhibitors and neutralizing antibodies against sars-cov-2.genes dis.2020dec；7(4):551-557中描述的方法。

31、“终点滴度”在本文中是指给出高于截止值的读数的最高稀释度的倒数。截止值优选为阴性对照读数或平均背景的二至三倍，更优选为阴性对照读数或平均背景的三倍。终点滴度可以通过elisa测定中稀释系列与靶抗原的直接且可饱和结合来确定。确定elisa测定中终点滴度的方法是本领域技术人员已知的，例如frey a.et al.a statisticallydefined endpoint titre determination method for immunoassays.j immunolmethods.1998dec 1；221(1-2):35-41中描述的方法。

32、如本文所用，“接头肽”是位于融合二聚体的两个单体之间的短肽序列。放置接头肽以向融合二聚体中包含的两个单体提供运动灵活性。在本发明的上下文中，接头肽具有至少一个氨基酸残基，优选至少两个连续的氨基酸残基，可选地3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基。接头肽包括柔性接头、刚性接头和体内可裂解接头。