兼具抗菌和矿化再修复的功能粒子及其制备方法、应用

本发明涉及复合材料领域，具体涉及一种兼具抗菌、矿化再修复的功能粒子、以及该功能粒子的制备方法和应用。

背景技术：

1、据世界卫生组织称，龋齿是威胁人类健康的三大疾病之一。龋齿是一种细菌生物膜依赖性疾病，当致龋菌，例如变形链球菌通过发酵代谢碳水化合物，导致酸的产生、ph值降低时，牙齿表面的矿化平衡就会被破坏，同时诱导牙齿硬组织的脱矿质。因此，大多数在初始阶段未恢复的龋损会逐渐恶化然后出现症状。基于此，治疗龋齿的有效策略是抑制龋齿病原体生物膜的形成、减少正常牙齿的硬组织脱矿、以及诱导牙齿矿化再修复。

2、但是，现有的防龋剂的功能比较单一。牙膏和漱口水在抗菌能力方面，虽然含有抗生素、氟化物等预防龋齿病原体生物膜形成的常用药剂，但耐药性限制了日常使用抗生素，而氟化物需要在高浓度下才能表现出一定的抗菌活性，且安全性是氟化物例如二胺氟化银临床应用的关键问题，银离子和氟化物的细胞毒性都不容忽视。此外，当钙离子和磷酸盐等矿物离子较少的情况下，脱矿牙釉质和牙本质表面难以快速有效地再生hap晶体，从而导致牙釉质棱柱和牙本质小管保持暴露于外部环境。

3、因此，有必要开发一种能够有效抗菌且有利于矿化再修复的功能粒子来阻止、预防龋齿。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种兼具抗菌和矿化再修复的功能粒子，其包括从内向外依次连接的矿化单元、连接层和抗菌层，该功能粒子在口腔龋病的酸性环境下能够裂解，释放出原花青素(pa)、聚赖氨酸(ε-pl)、黄芩素(bc)、ca2+离子、po4 3–离子等有效成分治疗龋齿并进行矿化再修复，实现兼具抗菌抑制生物膜与矿化再修复的双重功能，显著地提高了龋齿的防治效果。

2、上述目的通过下述技术方案实现：

3、兼具抗菌和矿化再修复的功能粒子，包括聚(三甲胺n-氧化物)稳定无定形磷酸钙形成的矿化单元，所述矿化单元外部设置有聚赖氨酸与黄芩素反应形成的抗菌层，所述矿化单元和抗菌层之间通过由原花青素构成的连接层连接。

4、本技术方案中，功能粒子从内向外依次包括矿化单元、连接层和抗菌层三部分。

5、矿化单元作为功能粒子的中心，其包括聚(三甲胺n-氧化物)和无定形磷酸钙(acp)反应得到的聚合物。聚(三甲胺n-氧化物)(ptmao)是三甲胺n-氧化物(tmao)衍生的新型两性离子聚合物，利用两性离子的带负电的羟基和带正电的胺基能够分别为钙离子ca 2+和磷酸根离子po43–提供沉积的位点以稳定无定形磷酸钙，同时，ptmao正负电荷分子间距短而偶极作用更小，因此具有优异的超亲水性和防污能力。本技术方案中，将矿化单元作为中心物质，在功能粒子分解后能够得到钙离子和磷酸根离子以诱导牙齿矿化再修复。

6、抗菌层是功能粒子的最外层，其由聚赖氨酸与黄芩素反应的产物构成。其中，聚赖氨酸(ε-pl)是一种食品级的抗菌剂，其拥有良好的抗菌效果与丰富的反应基团；而黄芩素(bc)是一种群体感应抑制剂，研究发现，黄芩素可以通过抑制lux基因表达来抑制变形链球菌的群体感应系统，所以，引入群体感应抑制剂可以控制病原细菌的过度生长，同时达到预防生物膜的目的。在本技术方案中，利用席夫碱反应连接聚赖氨酸和黄芩素，并将其作为功能粒子的最外层以实现抗菌抑制生物膜的功能。

7、本技术方案中，连接层用于连接抗菌层和矿化单元。连接层采用原花青素(pa)，原花青素的分子式为c15h10o5，分子量为270.24，其具有高度羟基化的结构。作为连接抗菌层和矿化单元的桥梁，原花青素能够通过羟基氧化后的羰基与聚赖氨酸上丰富的胺基发生席夫碱反应连接，并通过氢键、静电相互作用与ptmao连接，从而形成稳定的功能粒子。除了作为抗菌层和矿化单元的连接物质外，原花青素对蛋白聚糖等非胶原蛋白有直接作用，能够抑制内源性蛋白酶的活性，进一步促进矿化效果。

8、当功能粒子在口腔龋病的酸性环境下时，pa与ε-pl之间的席夫碱键会断开，释放出ε-pl-bc粒子与pa，同时ph的改变会破坏pa与ptmao之间的静电相互作用，使得ptmao-acp释放出来，从而得到原花青素、聚赖氨酸、黄芩素、钙离子、磷酸根离子等有效成分治疗龋齿并进行矿化再修复。

9、本技术方案中，将聚赖氨酸结合黄芩素组成抗菌抑制生物膜的外层，以ptmao稳定无定形磷酸钙作为矿化再修复的内层，并通过原花青素连接内外层形成稳定的功能粒子，使得功能粒子能够响应龋齿的酸性环境裂解得到聚赖氨酸、黄芩素、原花青素、钙离子、磷酸根离子等有效成分治疗龋齿并进行矿化再修复，显著地提高龋齿的防治效果；另外，原花青素除了作为内外层的桥梁，其还能够抑制内源性蛋白酶的活性，进一步促进矿化效果；不仅如此，ptmao除了能够稳定无定形磷酸钙外，由于其正负电荷分子间距短而偶极作用小，使得功能粒子还具有优异的超亲水性和防污能力。

10、作为本发明中功能粒子的一种优选实施方式，所述聚赖氨酸和黄芩素的质量比为1:1～2:3。聚赖氨酸和黄芩素的比例将影响功能粒子的抗菌与抑制生物膜的效果。若聚赖氨酸的含量较少，由于黄芩素本身并不具备杀灭致龋菌的能力，形成的ε-pl-bc复合材料的抗菌能力将会下降；若黄芩素的含量较少，则会因为聚赖氨酸对致龋菌产生的生物膜没有良好的抑制效果而造成功能粒子对于抑制生物膜的能力下降。因此，本技术方案中，为使功能粒子同时具备较好的抗菌与抑制生物膜的效果，在功能粒子中，聚赖氨酸和黄芩素的质量比为1:1～2:3。

11、作为本发明中功能粒子的另一种优选的实施方式，所述原花青素和聚(三甲胺n-氧化物)的质量比为1:2～1:3。作为连接矿化单元和抗菌层的“桥梁”，原花青素的用量过少时，功能粒子整体的稳定性会受到严重的影响，且ptmao-acp的结构也会受到影响，造成提前解体或失去稳定能力，导致矿化再修复能力下降，并且，原花青素也能够起到抑制内源性蛋白酶的活性，促进矿化效果的作用，因此其含量不宜过少。当ptmao的含量较少时，稳定acp的能力也会降低，同时功能粒子的均匀性也会受到影响。本技术方案中，将原花青素和ptmao的质量比设置为1:2～1:3，不仅能够使功能粒子整体结构稳定，同时可以使ptmao-acp能够有效地完成矿化再修复，且原花青素能够起到促进矿化的作用，功能粒子的矿化再修复效果更好，此外，还能够控制功能粒子的均匀性，使功能粒子的尺寸在合理的范围内。

12、本发明的另一个目的在于提供上述任一种功能粒子的制备方法，该制备方法合成路径短，反应条件温和，且所用原料的生物相容性较好。

13、具体地，所述制备方法具体包括以下步骤：

14、聚赖氨酸和黄芩素混合后反应，反应完毕经透析、冷冻、干燥制得ε-pl-bc复合材料；

15、混合原花青素与所述ε-pl-bc复合材料，反应后制得第一溶液；

16、混合聚(三甲胺n-氧化物)、可溶性钙盐溶液和可溶性磷酸盐溶液，形成前驱体溶液，将所述第一溶液缓慢加入至所述前驱体溶液中，制得所述功能粒子。

17、本技术方案中，聚赖氨酸、黄芩素组成具有抗菌、抑制生物膜的ε-pl-bc复合材料，该复合材料与原花青素混合反应制得pa-ε-pl-bc第一溶液。ptmao与可溶性钙盐溶液和可溶性磷酸盐溶液混合后得到ptmao-acp的前驱体溶液，随后将第一溶液缓慢加入至前驱体溶液中反应得到兼具抗菌抑制生物膜与矿化再修复的多功能粒子。

18、在一个或多个实施例中，不同浓度的聚(三甲胺n-氧化物)与可溶性钙盐溶液和可溶性磷酸盐溶液等体积混合。

19、进一步地，所述聚赖氨酸、黄芩素分别溶解后混合，于30～60℃下反应12～18小时后用透析袋透析，透析的截留分子量为2400～2600。本技术方案中，将聚赖氨酸、黄芩素分别溶解，例如，将聚赖氨酸溶解于去离子水中形成第二溶液，将黄芩素溶解于dmso中形成第三溶液，之后充分搅拌形成均匀混合液。均匀混合液于30～60℃的水浴锅中反应12～18小时后用透析袋进行透析，透析的截留分子量为2400～2600。在部分优选的实施例中，聚赖氨酸与黄芩素的反应温度为40～50℃，反应时间为15～16小时。在一个或多个实施例中，透析的截留分子量为2450～2550，优选地，透析的截留分子量为2500。

20、进一步地，透析后于-30～-10℃冷冻18～30小时，之后于-115～-105℃冷冻干燥成型得到ε-pl-bc复合材料。本技术方案中，均匀混合液透析后首先于-30～-10℃冷冻18～30小时，优选地，在-20～-10℃的冰箱中持续冷冻23～25小时，随后再转入至冷冻干燥机中干燥成型得到ε-pl-bc复合材料。在部分优选的实施例中，冷冻干燥机的冷却温度为-115～-105℃，优选地，冷冻干燥机的冷却温度为-110～-105℃。

21、进一步地，所述原花青素与ε-pl-bc复合材料的质量比为1:1～1:1.2。当两者质量比为1:1～1:1.2时，pa能更好地充当“桥梁”作用，使得功能粒子粒子整体更加稳定，同时pa的等质量比加入也不会影响ε-pl-bc复合材料的抗菌性，若pa加入过多，容易导致ε-pl-bc复合材料抗菌性降低。

22、进一步地，所述聚赖氨酸的分子量为3500～4500。优选地，聚赖氨酸的分子量为3800～4200，以进一步提高功能粒子的抗菌效果。

23、进一步地，所述可溶性钙盐为无水氯化钙，所用可溶性磷酸盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。

24、本发明还提供了前述任一种功能粒子响应酸性环境下的应用，具体包括以下步骤：所述功能粒子在酸性环境下分解，释放出原花青素、聚赖氨酸、黄芩素、钙离子和磷酸根离子。

25、本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

26、1、本发明的功能粒子将聚赖氨酸结合黄芩素组成抗菌抑制生物膜的外层，以ptmao稳定无定形磷酸钙作为矿化再修复的内层，并通过原花青素连接内外层形成稳定的结构，使得功能粒子能够响应龋齿的酸性环境裂解得到聚赖氨酸、黄芩素、原花青素、钙离子、磷酸根离子等有效成分治疗龋齿并进行矿化再修复，显著地提高龋齿的防治效果；

27、2、本发明采用原花青素连接内外层，原花青素不仅具有稳定的连接作用，而且其还能够抑制内源性蛋白酶的活性，进一步促进矿化效果；

28、3、本发明的ptmao除了能够稳定无定形磷酸钙外，由于其正负电荷分子间距短而偶极作用小，使得功能粒子还具有优异的超亲水性和防污能力；

29、4、本发明通过合理地设计聚赖氨酸和黄芩素的质量比、以及原花青素和聚(三甲胺n-氧化物)的质量比，使得功能粒子具有更好的抗菌抑制生物膜，以及矿化再修复功能；

30、5、本发明的功能粒子的合成路径短，反应条件温和，并且所用原料的生物相容性较好。