一种多表位1型糖尿病疫苗及其制备方法

本发明属于生物，具体涉及一种多表位1型糖尿病疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、1型糖尿病(type 1diabetes mellitus,t1md)主要多见于青少年，发病率正呈逐年上升趋势。1型糖尿病是一种由t淋巴细胞介导的自身免疫性疾病，其典型特征是胰岛β细胞特异性损伤导致体内胰岛素缺乏，逐渐引起严重的心血管、眼、肾及神经系统病变。目前较为常用的治疗手段是给患者注射胰岛素，用于控制血糖，缺点在于：需终生依赖注射胰岛素，也易造成低血糖，同时部分患者存在胰岛素抵抗。治疗1型糖尿病的最佳目标是阻止或减轻活化的t淋巴细胞介导的一系列自身免疫反应，同时保护胰岛细胞功能，促进再生和修复。但现有治疗方法都无法实现这一目标。因此使用免疫手段调控自身免疫系统引发免疫耐受，可能成为预防并治疗1型糖尿病的新型手段。

2、近年来，通过大量动物模型的研究以及临床治疗，对1型糖尿病病理生理学的认识有了显著的发展。基于自身抗原诱导恢复机体产生针对自身抗原的免疫耐受的免疫治疗方法，被认为是较为理想的干预手段，因此利用疫苗预防或治疗1型糖尿病是一种有希望的方法。目前已经确定的致病t细胞靶向抗原有20多种，这些抗原在t1dm发病的不同时期所表达的水平，会受到抗原表位、调控基因等多个因素影响而发生变化。在不同的自身免疫t1dm个体中,始动抗原可能不尽相同，有的是gad65启动了自身免疫反应，而有的是ins抗原，但究竟是哪个胰岛自身抗原启动了自身免疫糖尿病的发病,至今仍有争论，这可能也是为什么目前单一自身抗原疫苗对1型糖尿病预防作用不理想的原因之一。因此，携带多个目标抗原或辅助抗原，拓宽疫苗的保护谱，是1型糖尿病疫苗优化设计的一种策略。

3、在众多抗原中胰岛素ins及谷氨酸脱羧酶65，即gad65在患病进程中的作用备受关注。

4、胰岛素ins是第一个被鉴定出的人类t1dm抗原，是t1dm患者发病进程最早出现的抗原。在动物模型的研究中发现，胰岛素b链9-23肽是启动t1dm的主要自身抗原，nod鼠发病时，胰岛素抗体的浓度与发生t1dm的风险正相关。

5、gad65是谷氨酸脱羧酶的异构体65kd，由585个氨基酸残基组成，是t1dm患者中含量最高的自身抗原，超过65％的t1dm患者在确诊时，体内有gad65自身抗体。gad65包含了许多不同的抗原表位，对自身免疫糖尿病的发生、发展有着不同的影响，gad206-220、gad286-300、gad290-309、gad509-528、gad524-543、gad546-554抗原表位肽段或其特异性t细胞克隆，能减轻自身免疫性胰岛炎，降低发病率，是预防1型糖尿病的保护性表位。

6、重塑免疫系统特异性免疫耐受，是t1dm较为理想的治疗策略，而诱导抗原特异性treg细胞是t1dm疫苗研究成功的关键。因此利用1型糖尿病这两个重要的自身抗原gad65和ins基因的保护性表位构建双表位疫苗，诱导针对特异性抗原的免疫耐受、诱导treg细胞、抑制dc细胞的活化，从而保护胰岛β细胞不被自身免疫攻击，并拓宽疫苗的保护谱，是糖尿病疫苗优化设计的一种策略。

技术实现思路

1、本发明为弥补现有技术的不足，提供一种多表位1型糖尿病疫苗及其制备方法，旨在多表位1型糖尿病疫苗免疫机体后，能诱导机体产生针对gad65和ins的特异性抗体，同时诱导机体产生免疫耐受、产生treg细胞、抑制dc细胞的成熟，降低血糖，从而预防和治疗1型糖尿病。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明一方面提供一种多表位1型糖尿病疫苗，其活性成分包括重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7；

4、所述重组噬菌体gad65190-320+ins17-110+t7的构建方法包括如下步骤：

5、(1)使用连接序列将人gad65190-320氨基酸的核苷酸序列和人ins17-110氨基酸的核苷酸序列串联，并在gad65的n-端使用连接序列添加辅助性th通用表位，构建成gad65190-320+ins17-110多表位核苷酸序列；

6、(2)将gad65190-320+ins17-110多表位核苷酸序列5’端引入ecor i的酶切位点、3’端引入hindⅲ酶切位点，插入pgem-t载体，合成构建质粒gad65190-320+ins17-110/t；

7、(3)将合成构建的质粒gad65190-320+ins17-110/t转入大肠杆菌top10f’感受态细胞，克隆扩增，之后提取重组质粒gad65190-320+ins17-110/t；

8、(4)在重组质粒gad65190-320+ins17-110/t上，用ecor i和hindⅲ进行双酶切，回收目的基因片段，插入t7噬菌体载体多克隆位点的ecor i和hindⅲ之间，使其位于t7 10-3b基因的3’端，使人gad65190-320+ins17-110多表位核苷酸序列与t7 10-3b表达成融合蛋白，构建成重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7。

9、所述人gad65190-320表位氨基酸序列如seq id no.1所示；

10、所述人ins17-110表位氨基酸序列如seq id no.2所示；

11、所述辅助性th通用表位氨基酸序列如seq id no.3所示；

12、所述连接序列的氨基酸序列如seq id no.4所示；

13、所述人gad65190-320表位核苷酸序列如seq id no.5所示；

14、所述人ins17-110表位核苷酸序列如seq id no.6所示；

15、所述辅助性th通用表位核苷酸序列如seq id no.7所示；

16、所述连接序列的核苷酸序列如seq id no.8所示；

17、所述gad65190-320+ins17-110多表位氨基酸序列如seq id no.9所示；

18、所述gad65190-320+ins17-110多表位核苷酸序列seq id no.10。

19、本发明gad65190-320+ins17-110多表位序列设计如图1所示。

20、进一步优选的是，所述步骤(3)的克隆扩增方法是：

21、将合成构建成的质粒gad65190-320+ins17-110/t转入大肠杆菌top10f’感受态细胞，涂布于含有氨苄amp+的lb固体培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑取平板中的单菌落至含氨苄amp+的lb液体培养基的试管中，于恒温摇床37℃，150rpm/min过夜培养，次日，将该菌液接种至含氨苄amp+的lb液体培养基，于恒温摇床37℃，150rpm/min过夜培养，次日收获菌液后，用质粒抽提试剂盒提取重组质粒gad65190-320+ins17-110/t。

22、进一步优选的是，所述步骤(4)包括下列步骤：

23、41)在重组质粒gad65190-320+ins17-110/t上，用限制性内切酶ecori和hindⅲ进行双酶切，所述双酶切体系如下：

24、

25、37℃水浴酶切60min，1％琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收目的基因片段；

26、42)将t7噬菌体载体与目的基因片段进行连接，所述连接体系如下：

27、

28、混匀，16℃静置16小时，得连接产物，于4℃保存；

29、43)取5μl连接产物加入25μl t7噬菌体载体，于室温孵育2小时进行包装，之后加入270μl无抗lb培养基停止反应，得到重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7，于4℃保存。

30、本发明另一方面提供用上述构建方法构建得到的重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7。

31、本发明第三方面提供一种上述重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7在制备多表位1型糖尿病疫苗中的应用。

32、本发明第四方面提供一种多表位1型糖尿病疫苗的制备方法，其采用上述方法构建得到的重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7进行制备。

33、进一步，优选的是，一种多表位1型糖尿病疫苗的制备方法：

34、在大肠杆菌blt5403加入重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7扩大培养后，收获噬菌体，将收集上清使用amicon ultra-15离心过滤装置去除内毒素。去除内毒素后收集的上清，进行噬斑滴度测定，滴度按照pfu/ml计数，调整噬菌体浓度为所需滴度，将甲醛按1∶4000的体积比加入噬菌体中灭活，制得本发明所述的多表位1型糖尿病疫苗。

35、进一步优选的是，多表位1型糖尿病疫苗的制备方法包括下列步骤：

36、1)大肠杆菌blt5403的处理：

37、11)将甘油保存的大肠杆菌blt5403在含氨苄的lb固体培养基平板上划线，接种复苏，37℃倒置过夜培养；

38、12)次日，挑取大肠杆菌blt5403单菌落，接种于含氨苄5ml lb培养基，37℃、150rpm/min振荡过夜；

39、13)将5ml大肠杆菌blt5403菌液，接种于含氨苄的200ml lb液体培养基，37℃、150rpm/min振荡培养至od600＝0.6；

40、2)多表位1型糖尿病疫苗经过下列方法制得：

41、21)按照1:100的体积比，将2ml重组噬菌体gad65190-320+ins17-110+t7加入步骤13)中的200ml od600＝0.6的新鲜大肠杆菌blt5403菌液中，37℃、150rpm/min培养至噬菌体菌液澄清并出现细丝状残片；

42、22)在步骤21)的重组噬菌体菌液中加入1％的氯仿，培养10min，得重组噬菌体裂解液；

43、23)将1m固体nacl加入步骤22)的重组噬菌体裂解液中，震荡至nacl完全，于4℃放置1h；

44、24)将重组噬菌体裂解液于4℃、4000rpm/min离心20min，收集上清，向上清中加入20g peg8000，震荡至溶解，于4℃过夜；

45、25)次日，于4℃，10000rpm/min离心30min，弃上清，得包含重组噬菌体的沉淀物；

46、26)用10ml重组噬菌体稀释液抽提所得沉淀物，于4℃、10000rpm/min离心15min，得一次上清、沉淀物；所述重组噬菌体稀释液成分为：1m nacl，10mm tris-hcl，ph8.0，1mmedta；

47、27)在沉淀物中加入5ml重组噬菌体稀释液再次抽提、离心过滤，得二次上清、沉淀物；

48、28)收集合并步骤26)、27)的一次、二次上清，用amicon ultra-15离心过滤装置去除内毒素，离心条件为4000×g时间15min，收集上清，并测定滴度，滴度按pfu/ml计数，加入重组噬菌体稀释液调整浓度至所需滴度，将甲醛按1∶4000的体积比加入重组噬菌体中，于37℃、100rpm/min灭活4天，制得包括重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7的多表位1型糖尿病疫苗。

49、由于多表位1型糖尿病疫苗的免疫原性会受表位的加工效率影响，因而要对各独立表位进行修饰，为了保证各表位的正确性和有效呈递的效率，在设计多表位时，加入连接序列能够保证各表位发挥作用。

50、本发明将连接序列引入多表位1型糖尿病疫苗，有以下三个原因：(1)该连接序列使用的氨基酸具有非极性、疏水性，能够充分伸展，有助于融合蛋白形成正确的空间结构；(2)连接序列可能有助于暴露蛋白活性部位，促进表位呈递；(3)连接序列可能有助于提高融合蛋白的正确表达。

51、本发明使用t7噬菌体作为疫苗载体有多项优点：(1)t7噬菌体复制周期短，培养过程简单，经济成本低；(2)t7噬菌体展示技术已经非常成熟，其遗传背景清晰，对环境变化十分耐受；(3)噬菌体作为疫苗载体能够充分展示目的产物，能有效诱发机体的特异性免疫反应；(4)噬菌体可以活化t辅助细胞，有助于引发t细胞依赖的免疫反应；(5)噬菌体颗粒可通过感染细菌大规模生产抗原表位，同时t7噬菌体可以展示多个具有保护性作用的抗原表位，构建多价抗原；鉴于噬菌体展示技术在基因工程抗原应用中拥有的以上优点，其改变了传统抗原和其它基因工程抗原产量低、纯化工艺复杂等不足，对新型疫苗的开发具有重要意义。

52、内毒素是多种革兰氏阴性菌的细胞壁成分，由菌体裂解后释出的毒素，又称之为“热原”，其化学成分有磷脂多糖-蛋白质复合物，其毒性成分主要为类脂质a，内毒素是一类毒性很强的大分子物质，它的含量关系着疫苗的质量和安全性，因此，在疫苗生产中，控制内毒素十分重要，本发明利用内毒素与其他物质的分子量的差别来去除内毒素，一般在样品流经超滤膜时，超滤膜将内毒素截留在膜上，而让其它低分子量物质透过，从而有效控制内毒素的含量，使抗原损失较少，并且富集样品，能够满足疫苗生产的要求，利用amiconultra-15，其过滤分子量为10kda，能有效地将噬菌体上清液中内毒素去除，进而保留有效的疫苗成分，保持疫苗的抗原性。

53、本发明提出：将人gad65的第190-320位氨基酸序列、人ins第17-110肽通过辅助性th表位及连接序列插入t7噬菌体dna衣壳蛋白10b编码基因的3’端，使人gad65的第190-320位氨基酸的核苷酸序列及人ins的第17-110位氨基酸的核苷酸序列与t7 10b表达成融合蛋白，构建成重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7。这种构建方法的优势在于：

54、(1)同时携带1型糖尿病自身抗原谷氨酸脱羧酶65(gad65)和胰岛素基因(ins)的优势表位，拓宽了1型糖尿病疫苗的保护谱；

55、(2)利用辅助性th表位及连接序列提高抗原呈递和抗原表达的效率；

56、(3)用该重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7疫苗免疫小鼠后，能同时诱导机体产生针对gad65和ins的特异性抗体，能够诱导免疫耐受；

57、(4)重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7疫苗显著地诱导nod小鼠体内treg细胞的增殖，并且抑制dc细胞成熟；维持血糖正常水平，能克服现有疫苗免疫谱单一、治疗成本过高和不能很好的诱导treg细胞，抑制dc细胞成熟的缺点，具有广阔的应用前景。

58、(5)另外在重组噬菌体gad65190-320+ins17-110/t7疫苗制备中加入了去除内毒素的步骤，提高了疫苗的效果和安全性。

59、本发明与现有技术相比，其有益效果为：

60、(1)与现有疫苗相比，同时携带与1型糖尿病发病最重要的两个自身抗原gad65和ins的优势表位，拓宽了疫苗诱导的免疫耐受保护谱，提高了疫苗的保护效率；

61、(2)在制备工艺里加入了超滤去除内毒素步骤，提高了疫苗的质量；

62、(3)将本发明提供的重组噬菌体疫苗皮下免疫非肥胖糖尿病nod小鼠，能成功地诱导免疫耐受，通过检测小鼠血糖发现，28周后经皮下免疫组的小鼠仅有25％血糖升高；而空白组75％小鼠血糖升高，糖尿病病发；并且疫苗组能减轻因糖尿病引起的小鼠体重降低；

63、(4)显著地诱导treg细胞分化，抑制dc细胞，缓解1型糖尿病，保护胰岛功能，弥补传统治疗存在的诸多不足。

64、本发明提供的多表位1型糖尿病疫苗的制备方法简单，治疗成本低廉，能克服现有单抗疫苗免疫谱单一、治疗成本过高和不能很好的保存胰岛细胞功能的缺点，具有广阔的应用前景。