一种近红外响应型硫化铜纳米粒聚集的脂质纳米体系的制备方法及应用

本发明属于纳米递药体系，具体涉及一种近红外响应型硫化铜纳米粒聚集的脂质纳米体系的制备方法及应用。

背景技术：

1、无机纳米材料是研究者较早研究的用于ptt的材料，目前研究比较多的无机纳米材料主要包括金属纳米粒子、金属硫族纳米粒子、碳基纳米材料及量子点等。其中硫化铜由于其成本低、光热稳定性好、细胞毒性低以及粒径形貌可控而受到广大研究者的青睐。此外，过渡金属铜是人体必需的微量元素，还是体内的生物活性成分。近年来，随着纳米技术和纳米医学的发展，铜的生物学效应和铜纳米颗粒的理化特性促进了独特的含铜生物纳米材料的发展。尽管已经初步证明了某些铜基的纳米剂具有生物相容性，但高的铜累积可能会在体内引起潜在的毒性。因此，在保证硫化铜纳米粒子尺寸较小、易被正常组织清除的同时延长其在肿瘤部位的滞留时间是亟待解决的问题。

2、目前，设计在保证渗透能力的同时在肿瘤部位响应聚集的纳米体系是一个有效方法。利用肿瘤微环境的特性如酸性微环境、ros、特异性酶以及外部刺激如温度、光等诱导粒子的聚集。酶由于其强大的催化功能和特殊的专一性，近年来肿瘤特异性酶响应聚集方面引起了研究者的关注。转谷氨酰胺酶在肿瘤部位高表达且与肿瘤细胞的凋亡密切相关，其可催化谷氨酰胺的γ-羧酰胺基与赖氨酸的ε-氨基之间的胺交换反应，诱导蛋白质的分子间或分子内交联。基于此可利用设计含有谷氨酰胺和赖氨酸的相关多肽修饰硫化铜纳米粒以触发其在肿瘤部位的原位聚集滞留。

3、光动力治疗（pdt）通过激光照射肿瘤部位的光敏剂产生单线态氧以氧化重要的生物大分子并诱导细胞凋亡，是一种新兴的癌症治疗方式。与传统的治疗方式相比，具有无创性、较低的正常组织和脱靶毒性的优点。但是其治疗效果受到肿瘤缺氧微环境和单线态氧寿命短的限制。ptt则是另一种利用激光激活光热试剂产生热量以消除肿瘤的治疗模式。将pdt和ptt联合起来可以有效地弥补光动力治疗的效果。一方面，pdt可以克服热休克蛋白介导的肿瘤细胞的耐热性，此外，pdt和ptt中光热通常是轻度的热疗，可以保护邻近组织免受高温损害。另一方面，ptt协助pdt产生的活性氧增加了肿瘤的通透性，加速细胞内药物的摄取，使得细胞对热更加敏感，进而提高ptt的效果。硫化铜纳米粒子和光敏剂icg在808nm激光照射下可以同时产生光热和光动力治疗效果，可将二者负载进脂质体系用于肿瘤的协同治疗，然而，目前尚没有该方面的相关文献报道。

技术实现思路

1、本发明解决的技术问题是提供了一种近红外响应型硫化铜纳米粒聚集的脂质纳米体系的制备方法，该方法实现了小尺寸硫化铜纳米粒子在肿瘤治疗中的渗透滞留且有效提高了肿瘤治疗效果，将肿瘤部位过表达的转谷氨酰胺酶（tgase）响应、可以发生交联聚集的多肽修饰在硫化铜纳米粒上，与光敏剂icg和温敏性脂质体共组装形成一个纳米递送体系，增强了其在肿瘤部位的渗透聚集能力，同时实现其pdt和ptt协同治疗肿瘤效果，能够用于进一步制备光热光动力协同治疗肿瘤药物。

2、本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种近红外响应型硫化铜纳米粒聚集的脂质纳米体系的制备方法，其特征在于具体步骤为：

3、步骤s1：多肽k功能化修饰的硫化铜纳米粒子的制备

4、以二水合氯化铜、硫代乙酰胺和多肽k为原料，溶于水中并加热升温至40~60℃反应，待反应结束后用超滤管除去未反应的小分子化合物和多肽k并浓缩得到cus-pepk浓缩液备用，其中多肽k的氨基酸序列为crkkkr，如seq id no.1所示；

5、步骤s2：多肽q功能化修饰的硫化铜纳米粒子的制备

6、以二水合氯化铜、硫代乙酰胺和多肽q为原料，溶于水中并加热升温至40~60℃反应，待反应结束后用超滤管除去未反应的小分子化合物和多肽q并浓缩得到cus-pepq浓缩液备用，其中多肽q的氨基酸序列为crrqqr，如seq id no.2所示；

7、步骤s3：含光敏剂icg的温敏性脂质体的制备

8、将胆固醇、二棕榈酰磷脂酰胆碱（dppc）、dspe-peg2k和光敏剂icg溶于氯仿中，再旋蒸除去氯仿得到一层脂质薄膜即lipo@icg的薄膜，避光备用；

9、步骤s4：近红外响应型硫化铜纳米粒聚集的脂质纳米体系的制备

10、将步骤s1得到的cus-pepk浓缩液和步骤s2得到的cus-pepq浓缩液加入到步骤s2得到的lipo@icg的薄膜中，水化至薄膜完全脱落，超声，离心除去未负载的硫化铜纳米粒子，利用脂质体挤出器挤出得到脂质纳米体系。

11、进一步限定，步骤s1的具体制备过程为：将0.1mmol二水合氯化铜置于250ml的圆底烧瓶中，加入100ml超纯水搅拌至充分溶解，再加入0.01~0.1mmol多肽k，搅拌30分钟后加入0.1mmol硫代乙酰胺，升温至50℃反应2~3小时得到深棕色液体，超滤除去未反应的小分子化合物和多肽k，水洗3次，浓缩得到cus-pepk浓缩液备用。

12、进一步限定，步骤s2的具体制备过程为：将0.1mmol二水合氯化铜置于250ml的圆底烧瓶中，加入100ml超纯水搅拌至充分溶解，再加入0.01~0.1mmol多肽q，搅拌30分钟后加入0.1mmol硫代乙酰胺，升温至50℃反应2~3小时得到深棕色液体，超滤除去未反应的小分子化合物和多肽q，水洗3次，浓缩得到cus-pepq浓缩液备用。

13、进一步限定，步骤s3的具体制备过程为：将二棕榈酰磷脂酰胆碱、胆固醇、光敏剂icg以及dspe-peg2k以摩尔比18:6:1:1.5的比例溶于2~3ml三氯甲烷溶液中，待充分溶解后转移至圆底烧瓶中，然后通过旋转蒸发仪于30℃旋转蒸发形成均匀的绿色薄膜，随后向其中加入2ml的超纯水并置于60℃的水浴锅中水化，待水化完全后将得到的绿色溶液转移至冰浴中超声30~60分钟，然后将所得液体通过聚碳酸酯膜过滤器挤压，最后将挤压后的样品用超滤装置浓缩得到样品lipo@icg的薄膜，将其置于4℃冰箱中保存备用，该超滤装置的分子量截点为30kda。

14、进一步限定，步骤s4的具体制备过程为：将得到的lipo@icg的薄膜用2mg/ml的cus-pepq浓缩液和2mg/ml的cus-pepk浓缩液于60℃孵育1h进行水化使硫化铜纳米粒溶液与绿色薄膜状混合物混合，待薄膜水化完全，将混合液转入至离心管中超声10~30分钟，再将混合溶液冻融3~5个循环促使cus-pepq和cus-pepk负载进入脂质体，离心除去未负载的cus-pepq和cus-pepk，将所得液体通过聚碳酸酯膜过滤器挤压得到脂质纳米体系lipo@icg@cus-pepq/k。

15、本发明所述的近红外响应硫化铜纳米粒聚集的脂质纳米体系在制备光热光动力协同治疗肿瘤药物中的应用，其中脂质纳米体系在近红外808nm激光照射下崩解促进硫化铜纳米粒子的释放及在肿瘤部位的渗透和酶响应性聚集滞留，同时实现光热和光动力治疗肿瘤。

16、本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明中多肽功能化修饰的硫化铜纳米粒子与光敏剂icg和温敏性脂质体共组装得到近红外响应型纳米体系，该纳米体系既保证了小尺寸硫化铜纳米粒在肿瘤组织的渗透能力，又延长了其在体内的循环和滞留时间，同时兼具光热和光动力治疗效果，在肿瘤治疗中具有较好的应用前景。