一种适配体-膜融合脂质体纳米药物及其制备方法和应用

本发明属于纳米药物的制备，涉及一种适配体-膜融合脂质体纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、恶性黑色素瘤的高迁移性及侵袭性，使得中后期患者在治疗过程中疗效不佳。放疗与免疫疗法的联合具有很大的应用前景，但也面临诸多挑战，如何精准的在实体瘤部位进行放射治疗及激活免疫应答是目前研究的主要内容。不幸的是，只有一小部分患者对目前可用的免疫疗法有反应。尽管越来越多的人认为免疫与放疗结合可以提高反应率，但这种方法可能受到持续辐射诱导免疫抑制的限制。免疫治疗与放射治疗相结合的最终目标是在所有疾病部位诱导从无效的、预先存在的免疫反应转变为持久的、治疗诱导的免疫反应。

2、现有的递送系统大多为有机或无机的纳米颗粒，包括“元老”脂质体。将治疗药物递送到作用部位的主要挑战是在靶组织、细胞或细胞器中的脱靶毒性、快速清除以及低积累和生物利用度。为了规避这些挑战，研究人员已经开发了广泛的合成输送载体(脂质体，胶束，无机纳米颗粒，树枝状聚合物等)，其中一些已经得到临床批准。在所有纳米颗粒的可用图谱中，脂质体是迄今为止最成功且市场上临床批准数量最多的载体。脂质体负载不同药物采用不同方式，脂质性药物嵌入到磷脂双分子层中；亲水性药物则加载在脂质体的管腔中。脂质体凭借其与生物体质膜类似的基本结构而具备很好的生物相容性。

3、机体的免疫效应分为抗体介导的体液免疫和淋巴细胞、巨噬细胞等介导的细胞免疫，正常的免疫反应能对非己的抗原产生两种免疫效应，以排斥异物发挥免疫保护作用。肿瘤细胞在发生发展过程中会通过多种机制躲避机体免疫系统的识别和攻击，得以在体内生存和增殖，称为肿瘤免疫逃逸(tumor immune escape)。首先，肿瘤细胞的抗原缺失和抗原调变，主要组织相容性复合物i(mhci)类分子的表达低下，其共刺激信号异常的特性使得cd80和cd86等正性刺激分子表达很少，而负性刺激信号如pd-l1等却高表达，因此不能为激活t细胞提供有效的第二信号；其次，肿瘤部位能表达表皮细胞生长因子促进细胞生长，并且分泌tgf-β、il-10等具有免疫抑制作用的多种细胞因子；再者，肿瘤细胞高表达各种抗凋亡分子，从而躲避ctls的杀伤作用；此外，肿瘤细胞主动诱导机体产生treg和髓源性抑制细胞来抑制免疫应答。

4、鉴于肿瘤细胞的这些特征，目前有许多研究针对其免疫抑制设计治疗方案，力求激活机体的免疫应答，刺激dcs成熟呈递抗原，激活t细胞。t细胞一般负责攻击并清除癌细胞，是人体免疫系统的主力军。目前临床上已经开始通过输注体外合成的单克隆pd-1抗体来直接激活并增强体内的t细胞，使得肿瘤细胞上的pd-l1“无从下手”，t细胞抑制被解除，让士气萎靡的“友军”重振军心，从而发挥肿瘤查杀作用。

5、放疗疗效有限且会导致放射抗性和肿瘤高复发转移率，这是由肿瘤缺氧、dna损伤快速修复，特别是肿瘤的抑制性免疫微环境引起的。已有研究设计了由hf4+和cpg odn组成的金属骨架，证明这种骨架可以实现高z元素增强的放射治疗，并进一步引发强大的肿瘤特异性免疫反应，从而表现出有效的肿瘤抑制能力。放射免疫治疗具有良好的抗肿瘤作用，这取决于放射治疗对肿瘤免疫微环境的调节作用，辐射诱导的dna损伤修复(ddr)通路激活导致免疫微环境的抑制，从而削弱了放射免疫治疗的抗肿瘤作用。

6、因此急需研究能够增敏放疗并逆转肿瘤的免疫抑制环境的治疗方案，发挥局部辐照作用的同时，激活肿瘤部位的免疫应答。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种适配体-膜融合脂质体纳米药物；本发明的目的之二在于提供一种适配体-膜融合脂质体纳米药物的制备方法；本发明的目的之三在于提供一种适配体-膜融合脂质体纳米药物在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1.一种适配体-膜融合脂质体纳米药物，所述纳米药物包括核酸适配体、肽核酸和膜融合脂质体；

4、所述核酸适配体首先与肽核酸(pmp)通过碱基互补的方式进行结合得到适配体/肽核酸结合体(aptatp/aptcpg/pmp(acp))，然后用胆固醇在所述适配体/肽核酸结合体(acp)中含有的aptatp和aptpd-l1的3`端上进行修饰，继续插入到所述膜融合脂质体上即可得到适配体-膜融合脂质体纳米药物(lip@aur-acp-pdl1)，其中所述肽核酸、aptatp、aptpd-l1和载药脂质体的摩尔比为3:2:1:80

5、所述膜融合脂质体按照如下方法制备：将二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、磷脂-甲氧基聚乙二醇(dspe-peg)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)和金诺芬(aur)加入溶氯仿中，搅拌超声使其溶解后，在40～42℃的水浴条件下旋蒸成膜，通风过夜后加入无菌pbs缓冲溶液后吹打重悬，超声使其混合均匀，离心后过0.22μm滤膜，挤压机反复挤压后用透析袋透析得到膜融合脂质体(lip@aur)；

6、所述肽核酸(pmp)是由seq id no：1的氨基酸序列、seq id no：2的核苷酸序列、seq id no：3氨基酸序列、seq id no：4的核苷酸序列和seq id no：1的氨基酸序列依次连接形成；

7、所述aptatp的核苷酸序列如seq id no：5所示、所述aptcpg的核苷酸序列如seqid no：6所示、所述aptpd-l1的核苷酸序列如seq id no：7所示。

8、优选的，在膜融合脂质体的制备过程中，所述二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、磷脂-甲氧基聚乙二醇(dspe-peg)、(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(dotap)和金诺芬(aur)的质量比为7.255:1.516:1.963:2。

9、优选的，所述膜融合脂质体中金诺芬(aur)的含量为44.7μg/ml。

10、优选的，所述适配体/肽核酸结合体(aptatp/aptcpg/pmp(acp))按照如下方法制备：

11、(1)制备aptatp/aptcpg：将aptatp的depc水溶液和aptcpg的depc水溶液在95℃下的油浴中热处理使其混合均匀，置于42℃的烘箱中孵育1h以上得到aptatp/aptcpg；

12、(2)制备适配体/肽核酸结合体(aptatp/aptcpg/pmp(acp))：将pmp的depc水溶液在80～90℃下油浴中热处理10min，加入步骤(1)中制备的aptatp/aptcpg中，继续在42℃的烘箱中孵育1h以上，得到适配体/肽核酸结合体(aptatp/aptcpg/pmp(acp))。

13、进一步优选的，步骤(1)中，所述depc水溶液的浓度为100μm，所述aptatp和aptcpg的摩尔比为2:1，所述aptatp和pmp的摩尔比为1:1.5。

14、2.上述适配体-膜融合脂质体纳米药物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

15、(1)将膜融合脂质体(lip@aur)放入-80℃冷冻，冻干获得脂质粉末；

16、(2)将所述脂质粉末溶于depc水中形成脂质溶液，加入aptatp/aptcpg/pmp(acp)后置于37℃的烘箱中孵育4h以上，然后加入aptpd-l1粉末在depc水形成的aptpd-l1溶液，继续在37℃烘箱中孵育过夜，得到lip@aur-acp-pdl1；

17、(3)将所述lip@aur-acp-pdl1置于-80℃下冷冻后，冷冻干燥得到适配体-膜融合脂质体纳米药物(lip@aur-acp-pdl1粉末)。

18、优选的，所述脂质溶液中脂质、aptatp/aptcpg/pmp(acp)中含有的aptatp和aptpd-l1溶液的aptpd-l1的摩尔比为80:2:1。

19、3.上述适配体-膜融合脂质体纳米药物在制备治疗和/或预防恶性肿瘤的药物中的应用。

20、本发明的有益效果在于：本发明公开了一种适配体-膜融合脂质体纳米药物，主要包括核酸适配体、肽核酸和膜融合脂质体(lip@aur)，其中膜融合脂质体(lip@aur)具有与肿瘤细胞膜融合和释放金诺芬到胞质的作用、核酸适配体具有刺激免疫应答作用。本发明公开的适配体-膜融合脂质体纳米药物是基于适配体3`端修饰的胆固醇(chol)与脂质体之间的亲和力而成，需要的键能小、有良好的空间定向性、高度的选择性以及可逆性。本发明的适配体-膜融合脂质体纳米药物中脂质体可以与膜融合，共载的金诺芬(aur)具有促进细胞铁死亡及增敏放疗功能，免疫佐剂aptcpg可以靶向树突状细胞(dcs)，刺激dcs成熟及抗原呈递的功能，进而激活后续免疫应答。这种仿生的脂质体纳米药物为临床上提高恶性肿瘤治疗的有效性提供了新的途径。

21、另外，本发明公开的适配体-膜融合脂质体纳米药物是一种多功能的生物材料，具有以下优点：(1)放疗响应性的适配体-膜融合脂质体纳米颗粒，采用仿生膜融合脂质体作为载体递送小分子药物及核酸适配体，具备良好生物相容性的同时，与肿瘤细胞膜融合后，药物及适配体可分别在细胞膜内外两侧发挥不同的作用；(2)使用含au元素的小分子药物金诺芬(aur)，不仅能促进肿瘤细胞发生铁死亡，在与放射联合治疗肿瘤时，可增敏放疗诱导细胞发生免疫原性死亡；(3)该纳米药物是由适配体及肽核酸与脂质体结合而成。形成了atp/mmp2双响应性的核酸互补结构，稳定地将免疫佐剂aptcpg递送到指定位置。在与放疗联合时依靠aptatp实现响应性，提升了放疗免疫疗法的治疗效果。由上述功能协同发生作用，本发明的适配体-膜融合脂质体纳米药物可以增强恶性肿瘤的治疗效果，为临床上提高恶性肿瘤的疗效提供了新的途径。

22、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。