一种基于葡聚糖和明胶的光诱导生物粘合剂及其制备与应用

本发明涉及生物医用材料，尤其涉及一种基于葡聚糖和明胶的光诱导生物粘合剂及其制备与应用。

背景技术：

1、由眼外伤，细菌及病毒感染等所引起的角膜病成为致盲性眼病，目前临床上针对该类疾病主要采取基于手术缝合线的角膜移植术进行治疗。

2、然而，鉴于手术缝合线的缺陷，其在角膜移植治疗中的使用会极大的限制手术治疗的效果。具体而言如，手术缝合线的使用需要在角膜组织上创造新的创面，且术后拆线容易导致术后并发症，引起已恢复角膜的二次损伤，此外该手术方案具有一定的挑战性，对医生手术能力有较高要求。因此，基于手术缝合线的角膜移植治疗方案在具有极高技术难度的同时，仅具有较低的治疗效果，并不是一种良好的致盲性角膜病临床治疗方案。

3、目前，针对手术缝合线的缺陷，人们开发了生物粘合剂作为缝线的替代材料以尝试实现角膜移植中的无缝线伤口闭合。当前的商业化生物粘合剂主要分为两类，一类是氰基丙烯酸酯类生物粘合剂，另一类是纤维蛋白胶类生物粘合剂。

4、这两类生物粘合剂各有特点，氰基丙烯酸酯类生物粘合剂具有较高的粘附能力，但其显著的降解毒性以及极差的生物相容性极大地限制了其在生物医学领域的应用，而纤维蛋白胶类生物粘合剂虽具有极佳的生物相容性，但其极低且持久性弱的粘附强度也大大地限制了其在角膜领域的应用。

5、此外，这些生物粘合剂的粘附性均缺乏时空可控性，使得其在临床上的使用尤为困难。因此，当今市面上仍旧缺乏能够有效替代手术缝合线用于角膜移植的生物粘合剂。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点和不足，提供一种基于葡聚糖和明胶的光诱导生物粘合剂及其制备与应用。

2、本发明特别用于角膜组织工程，将氧化葡聚糖与具有光固化能力的明胶基材料复合，得到一种极佳光响应粘附能力及湿环境下长效粘附性能的水凝胶材料用于匹配角膜缺损修复需求。

3、本发明在以天然高分子为主要支架的基础之上，向体系内引入具有特定化学功能的官能团，保证了体系良好的生物相容性的同时，还赋予了生物粘合剂快速的光响应粘附性能以及湿环境下极强且长效的组织粘附能力。该体系能够全面克服上述各类生物粘合剂的缺陷，更加有效地实现角膜供体在角膜植床上的固定，促进受损角膜天然结构的重生及生理功能的重现，在角膜组织工程等多种生物医学领域内具有巨大的应用潜力。

4、本发明通过下述技术方案实现：

5、一种基于葡聚糖氧化和明胶改性的光响应生物粘合剂，组分为氧化葡聚糖，丙烯酸酐酰化明胶及半胱氨酸酰化明胶，结构式分别如下：

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8、基于氧化葡聚糖(od)、丙烯酸酐酰化明胶(g-aa)和半胱氨酸酰化明胶(g-sh)的制备，包括以下步骤：

9、氧化葡聚糖(od)的制备步骤：

10、(1)将葡聚糖以10％(w/v)的浓度溶解于100ml去离子水中，500rpm溶解1h。

11、(2)待葡聚糖完全溶解后，向溶液内加入8g的naio4，在避光条件下以25℃，500rpm反应3h。

12、(3)反应结束后向溶液中加入与naio4等摩尔量的二甘醇并继续保持上述反应条件0.5-1h。

13、(4)上述反应结束后将溶液置于去离子水中以每天3次的换水频率透析(3500da)。

14、(5)透析5天后，冷冻干燥产物，所得样品氧化葡聚糖保存于室温干燥环境。

15、上述步骤(2)由于naio4见光分解，需要在避光条件下以naio4作为催化剂催化葡聚糖的氧化。

16、上述步骤(3)向溶液中加入与naio4等摩尔量的二甘醇与naio4反应以终止葡聚糖的氧化。

17、上述步骤(4)透析的目的是为了去除步骤(3)溶液中的二甘醇与naio4反应生成的小分子。

18、上述步骤(5)在干燥环境中保存的目的在于防止亲水性的氧化葡聚糖吸潮。

19、丙烯酸酐酰化明胶(g-aa)的制备步骤：

20、(1)将明胶以10％(w/v)的浓度溶解于100ml pbs缓冲液(1×)中，50℃，500rpm溶解1h。

21、(2)待明胶完全溶解后以0.2ml/min的速度向溶液内逐滴滴入1ml丙烯酸肝(aa)，滴加完毕后保持50℃，500rpm的条件反应3h。

22、(3)反应结束后在40℃去离子水中透析(3500da)。

23、(4)频繁换水透析5天，冷冻干燥产物，所得样品g-aa保存于室温干燥环境。

24、步骤(1)与步骤(2)保持50℃的反应温度是防止明胶溶液在反应过程中凝胶，阻碍接枝反应的进行。

25、步骤(3)40℃的透析温度与前两步类似，目的在于防止明胶溶液在透析过程中凝胶，导致其中含有的丙烯酸肝小分子未被完全除去。

26、半胱氨酸酰化明胶(g-sh)的制备步骤：

27、(1).将明胶以1％(w/v)的浓度溶解于300ml pbs缓冲液(1×)中，50℃，500rpm溶解0.5h。

28、(2).待明胶完全溶解以后向溶液中加入nah2po4调节溶液ph值至4-6。调节溶液ph的目的是为了防止步骤(3)加入的半胱氨酸小分子在反应过程中发生小分子反应，导致明胶大分子上的半胱氨酸接枝率降低。

29、(3).待ph调节完成后，向溶液内依次加入1.38g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，0.282gn-羟基琥珀酰亚胺和14.604g半胱氨酸，将反应溶液置于室温，通氮气，500rpm的反应条件下反应8h。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与n-羟基琥珀酰亚胺催化明胶大分子侧链上的氨基与半胱氨酸之间的羧基进行酰胺反应，达到接枝的目的。

30、(4).待反应结束后向溶液中加入微量的二硫苏糖醇，摇晃使其完全溶解。向反应后的溶液中加入二硫苏糖醇的目的在于防止溶液中半胱氨酸上的巯基之间反应形成二硫键，导致明胶大分子的交联。

31、(5).将反应溶液置于25℃去离子水中以每天3次的换水频率进行透析(1000da)。

32、(6).透析5天后，冷冻干燥产物，所得样品g-sh保存于室温干燥环境中。

33、基于生物粘合剂的配置方法，包括以下步骤：

34、(1)使用时，将冻干保存的od与光引发剂i2959共同溶解于pbs缓冲溶液中，通过涡旋及搅拌的方式使两种组分充分溶解，得到溶液ⅰ。由于od与两种改性明胶一接触即发生反应，且其溶解条件与改性明胶不同，故采用分开溶解后混合的策略。

35、(2)将g-aa与g-sh以2：1的质量比溶解于pbs缓冲溶液中，于37℃水浴促使溶解，得到溶液ⅱ。两种改性明胶均保有溶解温度高的特性，且相互之间的溶解混合并不发生反应，故采用同时加热溶解的策略。

36、(3)将溶液ⅰ与溶液ⅱ按照不同比例进行混合，配置得od含量固定，而g-aa与g-sh浓度不同的一系列生物粘合剂预聚液。

37、(4)将生物粘合剂预聚液滴加至应用部位，随后通过紫外光照射引发预聚液的光固化以及粘性产生。

38、(5)随后通过粘附性能等表征测试综合评价生物粘合剂的性能，以获得效果最佳的生物粘合剂浓度组成。效果最佳的生物粘合剂浓度组成的判断主要依赖于生物粘合剂的初始粘附强度以及湿环境下的粘附长效性。

39、本发明的氧化葡聚糖与两种改性明胶复合后得到的生物粘合剂，其在保持原有的良好生物相容性的同时，具有独特的光响应粘附性能以及湿态下的粘附长效性，能够在水环境中有效封闭组织伤口，执行粘附功能，在角膜等高含水率组织部位的应用上具有独特的优势。因此在生物医用材料的领域中，特别适用于湿环境中组织伤口的封闭和粘附。

40、相对于现有技术，本发明具有如下优点及有益效果：

41、(1)本发明的原料来源于天然物质，获取简单，制备方法具有线路简单操作方便，试剂毒性低，纯化方式简单，产率较高且产物易保存等优点；

42、(2)本发明的生物粘合剂组成成分均为天然高分子基材料，具有良好生物相容性，能够有效促进生物组织缺损部位的损伤修复而不引起严重的炎症反应；

43、(3)本发明的生物粘合剂具有独特的光响应粘附特性，能够在光照后展现出独特的粘附性能，能够极大地降低角膜移植手术的操作难度，在临床方面具有广阔应用前景；

44、(4)本发明的生物粘合剂在湿环境下具有独特的长效粘附性能，能够在水环境中长期行使封闭伤口及粘附的功能，在角膜等高含水率生物组织的应用中具有显著的优势。