一种双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体及其纳米制剂的制备方法与应用

本发明属于纳米制剂领域，具体涉及一种双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体及其制剂在肿瘤成像与治疗方面的应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤一直是威胁人类健康和生命的重要疾病之一，其发病率呈现逐年上升并年轻化的趋势。目前，对于化学治疗，传统的化疗药物(如阿霉素、柔红霉素、奥沙利铂、紫杉醇等)虽然在肿瘤的治疗中占据重要地位，但这些小分子抗癌药物经静脉给药后缺乏选择性，存在一定的毒副作用。尽管目前研究人员开发了许多纳米载药体系来改善单独的抗癌药物在治疗过程中存在的水溶性差、肿瘤富集少、正常器官损伤大等缺陷，但这些纳米载药载体因具有较大的尺寸往往会导致其在肝、脾等res器官中富集，难以彻底地排出体外而存在较大的生物毒性，这将遏制其在临床上的应用。超小尺寸的发光金纳米粒子(aunps，d＜3nm)作为一类新型纳米材料，具有可见至近红外区连续可调的光学性质，易表面功能化修饰以及良好的生物相容性且具备可肾清除性，广泛应用于生物成像、载药和肿瘤靶向治疗等领域，拥有良好的临床转化前景，是一种理想的药物载体，但是由于其尺寸较小，血液循环时间短，导致肿瘤靶向效率低，而且其作为药物载体通常通过π-π堆积，静电相互作用负载药物，装载效率和稳定性不高。因此，开发新型超小发光金纳米粒子功能化策略，提高其肿瘤靶向效率和载药效率实现药物可控释放，对提高癌症治愈率、降低死亡率具有十分重要的意义。

2、超分子主客体化学是指主体和客体分子之间通过非共价键相互作用而形成超分子聚集体的化学。这种主客体化学最大的特点在于主体分子能够在水溶液中和客体分子相互作用形成稳定的包合物，且不会轻易发生解离。葫芦[7]脲(cb[7])作为一种新型的超分子主体分子，它具有上下两个亲水性的羰基氧端口和一个疏水性的空腔，可以通过离子偶极作用或是静电相互作用与客体分子形成包合物，因而具有很强的主客体键合能力，而且其具有良好的水溶解性和生物相容性。因此，利用这种具有药物装载能力的cb[7]主体分子来设计和功能化超小发光金纳米载体以及制备基于主客体竞争可控释放药物分子的纳米制剂，为开发新型纳米载药体系提供了一种新的技术方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点和不足，本发明提供了一种双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体及其纳米制剂在肿瘤成像与治疗中的应用。本发明提供的一种双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体及其纳米制剂，具有高肿瘤靶向和近红外二区(nir-ⅱ)发光等性能，可以通过主客体相互作用装载化疗药物奥沙利铂(ox)，利用肿瘤部位过表达的精胺与cb[7]更强的主客体结合能力实现药物的可控释放，以及药物的高效装载并降低药物的脱靶毒性。其次，结合超小发光金纳米粒子本身可消耗gsh的特点，改变肿瘤细胞原有的生理平衡，促进肿瘤细胞的凋亡，可实现化疗和化学动力学联合治疗，从而构建集诊断与治疗于一体的肾清除型多功能纳米载药系统。因此，本发明制备的纳米载体及其纳米制剂在临床肿瘤诊断和治疗领域具有较大的应用前景。

2、本发明的目的通过以下技术方案实现：

3、一种双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体及其纳米制剂在肿瘤成像与治疗中的应用，包括以下步骤：

4、(1)将巯基配体a和b、氯金酸、溶剂充分搅拌混合；

5、(2)加入还原剂后，继续搅拌反应并维持反应液呈碱性；

6、(3)反应完成后，透析纯化去除多余的小分子，离心除去大颗粒，得到双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体，其对照纳米载体具有类似的制备过程；

7、(4)将小分子抗肿瘤药物与上述双靶向剂修饰的金纳米载体混合搅拌，通过主客体相互作用得到所述双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米制剂。

8、优选地，步骤(1)中，所述巯基配体a和b为sh-peg，c(rgdfc)和sh-peg-cb[7]中的一种或两种。

9、优选地，步骤(1)中，所述溶剂为：去离子水、甲醇、乙醇、甲苯中的一种；所述混合的时间为10-30min。

10、优选地，步骤(1)中，所述氯金酸与巯基配体物质的量之比为1：0.5～1：10。

11、进一步优选的，步骤(1)中，所述巯基配体a和b的物质的量之比1：0～0.1：1。

12、优选地，步骤(2)中，所述还原剂为硼氢化钠。

13、进一步优选的，步骤(2)中，所述ph调节溶剂为naoh溶液。

14、优选地，步骤(2)中，所述加入还原剂搅拌反应并使反应液维持ph为6～10。

15、优选地，步骤(2)中，所述氯金酸与还原剂摩尔比为1：1～1：5。

16、优选地，步骤(3)中，所述透析使用的透析袋的截留量为3000-14000da，透析时间为1～3天。

17、优选地，步骤(3)中，所述纯化过程使用的超滤管截留量为10000～50000da。

18、优选地，步骤(3)中，所述双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体为cb[7]/c(rgdfc)-aunps，其对照的纳米载体分别为peg-aunps、cb[7]/peg-aunps c(rgdfc)/peg-aunps，以上所合成的金纳米载体粒径均一，其尺寸分布在1.1～1.9nm。

19、进一步地：步骤(3)中，所述利用荧光光谱和紫外吸收光谱表征以上制备的近红外二区发光金纳米载体。

20、进一步地：步骤(3)中，所述通过透射电子显微镜(tem)对近红外二区发光金纳米载体进行表征，并统计纳米载体的粒径。

21、进一步地：通过傅里叶红外光谱(ftir)对步骤(3)所述近红外二区发光金纳米载体表面配体的官能团进行表征。

22、进一步地：对步骤(3)中所述近红外二区发光金纳米载体在dpbs中的荧光稳定性进行评估。

23、进一步地：对步骤(3)中探究不同浓度的谷胱甘肽对近红外二区发光金纳米载体的影响。

24、本发明提供的双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体具有高肿瘤靶向性和近红外二区发光的性能，可用于肿瘤的靶向荧光成像分析；而且本发明提供的双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米制剂，利用肿瘤部位过表达的精胺与葫芦[7]脲更强的主客体结合能力，可竞争性释放化疗药物奥沙利铂，实现药物在肿瘤部位的可控释放并减小对正常组织/器官的毒性，再结合超小发光金纳米粒子本身可消耗gsh的特点，可以改变肿瘤细胞内原有的生理平衡，促进肿瘤细胞凋亡，实现化疗和化学动力学联合治疗，从而构建一种集诊断与治疗于一体的肾清除型多功能纳米载药系统，其在临床肿瘤诊断和治疗领域具有较大的应用前景。

25、进一步地：选用小鼠乳腺癌细胞(4t1)和人源肾上皮细胞(hk-2)，探究步骤(3)中所述近红外二区发光金纳米载体在不同浓度下的细胞毒性。

26、进一步地：选用4-5周龄的balb/c雌性小鼠，构建4t1皮下瘤模型，将步骤(3)所述近红外二区发光金纳米载体通过尾静脉注射至小鼠体内，注射体积200-400μl，浓度0.5-2μm，随后利用二区活体成像仪对小鼠进行肿瘤靶向荧光成像分析。成像条件：激发波长808nm，曝光时间0.1-0.5s。

27、优选地，步骤(4)中，所述奥沙利铂和cb[7]/c(rgdfc)-aunps的浓度分别为500-1500mg/l和1-3μm，混合搅拌时间为12-48h。

28、进一步地：步骤(4)中，所述双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米制剂为ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps，并利用荧光发射光谱和紫外吸收光谱对其药物装载前后进行表征。

29、进一步地：利用tem对步骤(4)中ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps的形貌进行表征，并统计其粒径。

30、进一步地：对步骤(4)中所述ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps在dpbs中的荧光稳定性进行考察。

31、进一步地：选用4t1细胞和hk-2细胞，探究步骤(4)中所述ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps在不同浓度下的细胞毒性。

32、进一步地：选用4-5周龄的balb/c雌性小鼠，构建4t1皮下瘤模型，将步骤(4)所述ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps通过尾静脉注射至小鼠体内，注射体积200-400μl，浓度为0.5-2μm，利用二区活体成像仪对4t1皮下瘤小鼠进行活体荧光成像。其成像条件：激发波长808nm，曝光时间0.1-0.5s。

33、进一步地：选用4-5周龄的balb/c雌性小鼠，构建4t1皮下瘤模型，分别于建模后的第5、7、9天尾静脉注射步骤(4)所制备ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps，注射体积200-400μl，在治疗过程中监测小鼠肿瘤生长情况，体重变化(从注射第一剂制剂开始)，最后，对小鼠实施安乐死，取肿瘤组织和各主要器官进行拍照和he病理分析。

34、与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

35、(1)本发明方法制备的双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体，合成方法简单，条件温和，产率高，易于工业化生产；

36、(2)本发明方法制备的双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米载体，稳定性高，生物安全性好，肿瘤靶向性高，具有长时间肿瘤富集和长二区成像窗口；

37、(3)本发明方法制备的双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米制剂ox@cb[7]/c(rgdfc)-aunps，兼具可肾清除性和高肿瘤靶向性；

38、(4)本发明方法制备的双靶向剂修饰的近红外二区发光金纳米制剂ox@cb[7]

39、/c(rgdfc)-aunps，采用主客体相互作用的装载策略和化疗和化学动力学联合治疗，在显著降低了小分子抗癌药物的脱靶毒性的同时，进一步增强了治疗效果，是一种性能优异的抗肿瘤纳米制剂，其在肿瘤治疗等领域具有良好的应用前景。