一种基于生物正交点击化学反应制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系及其制备方法与应用

本发明公开了一种基于生物正交点击化学反应制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系及其制备方法与应用。

背景技术：

1、寡核苷酸疗法被认为是治疗基因相关性疾病的有效手段。由于脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的特殊性质，大多数寡核苷酸可以通过watson-crick特异性碱基配对与其同源靶分子相互作用，从而能够在遗传水平上进行干预。从理论上讲，任何由致病基因过度表达引起的疾病都可以通过特定的寡核苷酸进行治疗，寡核苷酸疗法为治疗多种遗传性和获得性疾病提供了前景，但是实现有效的寡核苷酸递送仍然是相关领域的主要挑战，寡核苷酸的进一步治疗应用仍受到寡核苷酸的递送效率的限制。对于成功的细胞质寡核苷酸递送，优异的细胞渗透性、溶酶体逃逸和寡核苷酸释放进入细胞质是先决条件。

2、细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,cpps)是短的两亲性或阳离子肽(通常小于30个氨基酸)，用以递送化学药物、核酸、肽和大分子或与其他载体(例如lnp、聚合物囊泡、和外泌体)共同使用用于外源性物质进入细胞甚至细胞器。目前使用cpps递送寡核苷酸的方法主要是与效应核酸复合形成非共价纳米粒子，而穿膜肽与效应核酸共价结合方法探究较少。纳米颗粒的异质性、聚集的可能性为递送带来了不便，同时cpps与寡核苷酸的高摩尔导致更高的细胞毒性。相比之下，共价偶联具有明确的结构和产量、更高的再现性、更低的cpp与寡核苷酸的摩尔比和更小的细胞毒性。微小rna(mirna)是各种生物学和病理学环境的基本调节剂，最近作为有希望的治疗靶标或生物标记物获得越来越多的临床关注，最近的研究证实抑制mirna-182对病理性骨丢失起到明显的保护作用。

3、生物正交点击化学是一种新的点击化学方法，如二苄基环辛炔-叠氮化物(n3-dbco)环加成化学，在反应的快速性、彻底性和特异性方面具有优势，对范围广泛的官能团，高保真度使它们能够更好地保持生物分子的生物活性。因此，开发有效的递送策略以提高安全性和寡核苷酸治疗功效至关重要。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有膜穿透功能的寡核苷酸及其制备方法与应用，通过生物正交点击化学获得可点击细胞穿膜肽寡核苷酸递送系统，mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽可以与azido修饰的寡核苷酸序列快速、彻底、特异地生物正交点击共价偶联。为寡核苷酸的递送提供新的方法，并预防和治疗破骨细胞活化性疾病提供了一种新途径。

2、为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：

3、一种基于生物正交点击化学反应制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系，所细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系包括mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽、azido修饰的寡核苷酸；其中，mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽、azido修饰的寡核苷酸通过生物正交点击化学反应制备而成；mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽的结构式如下所示：

4、

5、上述一种基于生物正交点击化学制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系的构建方法，包括以下步骤：

6、步骤1，利用fmoc固相合成法合成dbco修饰的r9细胞穿膜肽；

7、步骤2，合成azido修饰的寡核苷酸，并使用荧光基团cy3修饰；

8、步骤3，mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽和azido修饰的寡核苷酸通过生物正交点击化学反应共价连接，获得细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系。

9、上述细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系在制备预防或治疗破骨细胞相关疾病的药物上的应用。

10、作为改进的是，所述破骨细胞相关疾病为骨质疏松症。

11、一种药物组合物，所述药物组合物的有效载体为细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系。

12、有益效果：

13、与现有技术相比，本发明一种基于生物正交点击化学反应制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系及其制备方法与应用，通过生物正交点击化学将具有细胞膜穿透功能的细胞穿膜肽和具有生物学功能的寡核苷酸相连接，能够更好地保持生物分子的生物活性，对范围广泛的官能团具有高保真度，无明显的毒副作用，高效地实现寡核苷酸递送，寡核苷酸核心序列能够抑制mir-182，进而能对破骨细胞的活化产生抑制作用，为预防和治疗破骨细胞活化性疾病提供一种新途径。

技术特征：

1.一种基于生物正交点击化学反应制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系，其特征在于，所细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系包括mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽、azido修饰的寡核苷酸；其中，mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽、azido修饰的寡核苷酸通过生物正交点击化学反应制备而成；mal-dbco修饰的r9细胞穿膜肽的结构式如下所示：

2.基于权利要求1所述的一种基于生物正交点击化学制备的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.基于权利要求1所述的细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系在制备预防或治疗破骨细胞相关疾病的药物上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述破骨细胞相关疾病为骨质疏松症。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效载体为细胞穿膜肽-寡核苷酸递送体系。

技术总结
本发明公开了一种基于生物正交点击化学反应制备的细胞穿膜肽‑寡核苷酸递送体系及其制备方法与应用。通过生物正交点击化学将具有细胞膜穿透功能的细胞穿膜肽和具有生物学功能的寡核苷酸相连接，能够更好地保持生物分子的生物活性，对范围广泛的官能团具有高保真度，无明显的毒副作用，高效地实现寡核苷酸递送，为预防和治疗破骨细胞活化性疾病提供一种新途径。

技术研发人员：耿德春,王伟,王庆,柏家祥,葛高然,王振,陈亮,杨惠林
受保护的技术使用者：苏州大学附属第一医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16