黑木耳总多糖或单体多糖在制备PD-L1抑制剂中的用途的制作方法

本发明涉及黑木耳总多糖及单体多糖的新的药理用途，尤其涉及黑木耳总多糖及单体多糖在制备pd-l1抑制剂中的用途，属于黑木耳总多糖及单体多糖的新用途领域。

背景技术：

1、pd-l1抑制剂作为免疫激活药物，可阻断pd-1与pd-l1的相互作用，是激活肿瘤免疫应答的有效手段，可以在不影响机体细胞正常免疫功能条件下达到理想的抗肿瘤效果。pd-l1抑制剂药物目前已经上市，目前获得适应症批准的药物有度伐利尤单抗、阿特丽珠单抗、舒格利单抗。度伐利尤单抗主要用于三期的非小细胞肺癌，阿特丽珠单抗主要用于广泛期小细胞肺癌，舒格利单抗主要用于晚期非小细胞肺癌。阿得贝利单抗是我国自助研发的pd-l1抑制剂药物，临床研究已经证实这种免疫药物与化疗联合用于广泛期小细胞肺癌患者，对于传统化疗可以明显延长患者生存时间。但已知pd-l1抑制剂不良反应发生率高，且价格昂贵。因此，亟需开发一种pd-l1抑制剂，降低或消除副作用，且生产成本低廉，适用于大多数临床患者，从而从根本上提高pd-l1抑制剂在癌症患者中的临床疗效。

2、黑木耳学名auricularia auricula(l.exhook.)underw，属于木耳科。常见于木耳的干燥子实体，基于传统中医理论认为黑木耳性味甘平，具有滋阴补血，明目清肺等功能，在众多古籍当中均有记载。迄今为止未有任何文献提示黑木耳多糖类成分可作为pd-l1抑制剂开发的潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供黑木耳总多糖在制备pd-l1抑制剂或制备肿瘤药物中的用途；

2、本发明的目的之二是提供从黑木耳中分离获得的单体多糖在制备pd-l1抑制剂或治疗肿瘤药物中的用途；

3、本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

4、本发明的一方面是提供了黑木耳总多糖在制备pd-l1抑制剂中的用途；其中，本发明中所述的黑木耳总多糖含有乙酰基活性基团；现有技术所披露的采用任何一种提取方法从黑木耳中提取得到的含有乙酰基活性基团的黒木耳总多糖；或者是采用任何一种通过商业途径购买得到的含有乙酰基活性基团的黑木耳总多糖均能适用于本发明；优选的，所述黑木耳总多糖中乙酰基活性基团的含量优选为10％以上，优选为15-30％。

5、作为参考，本发明提供了一种含有乙酰基活性基团的黑木耳总多糖的制备方法，包括：

6、(1)以水为提取溶剂提取黑木耳得到黑木耳水提液；

7、(2)去除黑木耳水提液中的杂质得到含有乙酰基活性基团的黑木耳总多糖。

8、作为一种优选的具体实施方案，步骤(1)中以水为提取溶剂采用沸水提取法从黑木耳中提取得到黑木耳水提液；所述的沸水提取法包括但不限于煎煮法或回流提取法等。

9、作为一种优选的具体实施方案，步骤(2)中所述的杂质包括小分子类化合物、寡糖或可溶性盐；其中，所述的去除黑木耳水提液中的杂质的方法包括采用超滤色谱柱对黑木耳水提液进行截留处理，其中，超滤色谱柱的截留处理范围选自3k、5k、10k或50k，最优选为50k；其中，在进行截留处理时，按照ml/g计，水与黑木耳水提液的比例为7：1、超滤压力为2mpa。

10、作为一种优选的具体实施方案，本发明提供了一种采用上述制备方法制备得到的含有乙酰基活性基团的黑木耳总多糖，其分子量分布包含1737kda、308.5kda以及145.4kda；按照单糖组成摩尔百分比计，木糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：葡萄糖：甘露糖＝25：7：2：3：63；乙酰基含量为20.47％；总糖含量为75.09±5％(其中糖醛酸含量为14.53±2％)、蛋白含量为25.45±5％。

11、western blot显示黑木耳总多糖metp可以抑制h157细胞中pd-l1蛋白表达。然而，脱乙酰基单体多糖(dme-2)对h157细胞中pd-l1蛋白的抑制作用不明显，而且对h157细胞中pd-l1蛋白的抑制作用明显弱于me-2。试验证明，含有乙酰基活性基团的黑木耳总多糖能够直接下调nci-h157细胞表面pd-l1表达，对于pd-l1抑制率达到51.4％，可用于肺癌、肠癌等pd-l1高表达的多种癌症治疗。

12、本发明的另一方面是提供了从黑木耳中分离获得的单体多糖在制备pd-l1抑制剂中的用途；其中，所述的从黑木耳中分离获得的单体多糖是公布号为cn 114957508a的发明专利申请中所公开的从黑木耳中分离获得的单体多糖，该单体多糖乙酰基活性基团含量为18.0％。

13、所述单体多糖为高乙酰基葡萄糖醛酸木半乳葡甘聚糖，由木糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，其中，木糖：葡萄糖醛酸：半乳糖：葡萄糖：甘露糖的理论组成的摩尔比例为3：4：1：1：11。

14、进一步的，所述单体多糖的糖残基连接组成为：→3)-甘露糖-(1→、→2，3)-甘露糖-(1→、→2，3，6)-甘露糖-(1→、→3，6)-甘露糖-(1→、甘露糖-(1→、葡萄糖-(1→、葡萄糖醛酸-(1→、木糖-(1→、半乳糖-(1→；其理论糖残基连接组成比例为3：1：3：3：1：1：4：3：1。

15、更进一步的，所述单体多糖的化学精细结构重复单元为如下所示：

16、

17、为了验证从黑木耳中分离获得的单体多糖me-2与pd-l1蛋白结合后是否对pd-l1蛋白表达及功能发挥具有抑制作用，即乙酰基含量大于10％的黑木耳总多糖或黑木耳单体多糖me-2是否可作为pd-l1抑制剂，本发明首先通过蛋白免疫印迹法对非小细胞肺癌nci-h157、a549、llc、人骨肉瘤u2os、结肠癌sw620、肝癌hepg-2和乳腺癌mcf-7在内的七种不同肿瘤细胞pd-l1表达水平进行检测，随后，采用cck8法进行细胞毒实验，结果显示非小细胞肺癌nci-h157、小鼠肺癌llc细胞增殖并未受到明显抑制，可见单体多糖me-2对nci-h157与llc细胞无明显细胞毒性，说明黑木耳单体多糖me-2本身并不具有细胞毒性，说明单体多糖me-2不是通过细胞毒性作用抑制肿瘤细胞增殖。

18、进一步研究发现，黑木耳单体多糖me-2对四种pd-l1高表达型的肿瘤细胞均具有下调pd-l1的作用，其中以非小细胞肺癌h157与小鼠肺癌llc细胞的下调趋势最为明显；且对肿瘤细胞表面pd-l1的下调作用呈浓度和时间依赖性；在给药浓度为2mg/ml和给药时间为24h时的pd-l1的下调最为显著。

19、本发明用干扰素ifn-γ诱导非小细胞肺癌a549、肝癌hepg-2和乳腺癌mcf-7细胞等细胞高表达pd-l1，将黑木耳单体多糖me-2与ifn-γ共同作用于细胞，所得实验结果显示，黑木耳单体多糖me-2可以明显下调ifn-γ诱导的pd-l1高表达，这证明黑木耳单体多糖me-2对pd-l1高表达型及诱导pd-l1高表达型肿瘤细胞，均具有显著下调pd-l1表达的作用。

20、本发明采用流式细胞术检测黑木耳单体多糖me-2对肺癌细胞pd-l1表达丰度的影响，结果发现，随着浓度的升高，两种肺癌细胞荧光强度逐渐变弱，进一步验证了黑木耳单体多糖me-2对非小细胞肺癌及转移性肺癌细胞系pd-l1的表达具有下调作用。

21、在此基础上，本发明进一步检测黑木耳单体多糖me-2介导的pd-l1的下调作用是否会影响肿瘤细胞pd-l1与t细胞pd-1蛋白结合的水平。根据试验结果发现，黑木耳单体多糖me-2剂量依赖性的阻断了pd-1/pd-l1的相互作用；进一步的，通过肿瘤细胞与t细胞共培养的方法验证了黑木耳单体多糖me-2介导jurkat t细胞对肺癌细胞的杀伤作用，结果发现，me-2介导jurkat t细胞发挥肿瘤杀伤作用，阻断了pd-l1/pd-1的相互作用，从而有助于机体免疫检查点生物功能的恢复。

22、本发明还构建了肺癌移植瘤模型通过黑木耳单体多糖me-2口服给药的方式治疗小鼠体内的实体瘤。根据实验结果可见，100mg/kg计量的me-2，显著抑制小鼠肿瘤的增殖，且作用效果明显由于阳性药：肿瘤形态发生明显改变，肿瘤体积逐渐变小甚至消失。且监测小鼠体重、血清生化指标及小鼠重要器官病理切片；实验结果均证明黑木耳单体多糖me-2在100mg/kg计量下对小鼠无明显毒副作用，而且通过定量聚合酶链式反应(qpcr)法证实了黑木耳单体多糖me-2能够明显抑制实体瘤中pd-l1mrna的表达。

23、综上可见，黑木耳总多糖metp及单体多糖me-2可作为天然的pd-l1抑制剂，用于肺癌、肠癌等多种pd-l1高表达的癌症治疗，具有广泛应用价值。乙酰基基团为黑木耳总多糖metp及单体多糖me-2作为pd-l1抑制剂的重要活性基团，与现有的pd-l1抑制剂相比，metp和me-2具有无毒副作用、价格低廉、适应患者群广等优点。

24、由此，本发明的另一方面提供了一种抑制pd-l1的药物组合物，由有效量的黑木耳总多糖或黑木耳单体多糖和药物制剂上可接受的辅料或载体组成；其中，所述的黑木耳总多糖或黑木耳单体多糖含有乙酰基活性基团。

25、本发明的再一方面提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，由有效量的黑木耳总多糖或黑木耳单体多糖和药物制剂上可接受的辅料或载体组成；其中，所述的黑木耳总多糖或黑木耳单体多糖含有乙酰基活性基团；所述肿瘤包括非小细胞肺癌、成骨肉瘤、肠癌、肝癌、乳腺癌等，但不局限于上述肿瘤类型。

26、本领域技术人员可按照药物制剂领域的常规方法将所述的药物组合物制备成常规的药物制剂，所述药物制剂的剂型可以为固体、半固体或液体的形式；优选为冻干粉、片剂、胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、干混悬剂、滴丸剂、干浸膏剂、注射剂或输注剂。

27、所述药物制剂的给药方式为口服给药或注射给药。

28、本发明中所述辅料或载体是指药学领域常规的辅料或载体，例如：稀释剂、崩裂剂、润滑剂、赋形剂、粘合剂、助流剂、填充剂、表面活性剂等；另外，还可以在组合物中加入其它辅助剂，如香味剂和甜味剂。所述稀释剂可以是一种或几种增加片剂重量和体积的成分，常用的稀释剂包括乳糖、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、山梨醇、甘露醇以及无机钙盐等；其中最常用为乳糖、淀粉、微晶纤维素。所述崩解剂可以为交联聚乙烯吡咯烷酮(与总重量比为2-6％)，交联羧甲基纤维素钠(与总重量比为2-6％)、海藻酸(与总重量比为2-5％)、微晶纤维素(与总重量比为5-15％)中之一种或几种混合物。所述的润滑剂包括硬脂酸，硬脂酸钠，硬脂酸镁，硬脂酸钙，聚乙二醇，滑石粉，氢化植物油中之一种或几种混合物。润滑剂的用量范围(与总重量比)为0.10-1％，一般用量为0.25-0.75％。所述的粘合剂可以是一种或几种有利于制粒的成分；可以是淀粉浆(10-30％，与粘合剂总重量比)，羟丙基甲基纤维素(2-5％，与粘合剂总重量比)，聚乙烯吡咯烷酮(2-20％，与粘合剂总重量比)，以聚乙烯吡咯烷酮的乙醇水溶液为佳。所述助流剂可以为微粉硅胶、滑石粉、三硅酸镁中之一种或几种混合物。所述表面活性剂可以为一种或几种能够提高润湿性和增加药物溶出的成分，常用为十二烷基硫酸钠(常用范围为0.2-6％，与总重量比)。