小口径组织工程血管及其制备方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种小口径组织工程血管及其制备方法。

背景技术：

1、心血管疾病(cvd)一直以来都是发病率和死亡率高、危及生命的疾病，是全球范围内的头号死因。据估计，中国每年有400万人死于cvd，占总死亡人数的40％以上。冠心病、外周动脉疾病等心血管疾病通常需要进行手术治疗,对病变血管进行修复、替换或搭桥；自体动脉和静脉通常是血管修复和替换的首选材料，然而部分患者因多种原因无法获取自体血管。

2、小口径(≤6mm)膨体聚四氟乙烯(eptfe)和聚酯(pet)等高分子材料人工血管植入体内后易形成血栓，内皮化不佳，容易感染，远期通畅率低，使用寿命短。为了提高小口径人工血管的使用寿命，研究者们一直都在致力于开发一种具有仿自体血管结构和成分的人工血管。组织工程技术为制造与天然血管性能相匹配的人工血管提供了一种可行方案，利用生物可降解聚合物或天然材料作支架，为细胞提供类似细胞外基质的生长环境。在细胞增殖过程中，随着支架材料的降解，最终实现仿生人工血管的体外构建。天然仿生组织工程血管具有良好生物相容性，植入体内可快速内皮化，远期通畅率高，并具有血管再生和自我修复等优点。

3、天然蛋白水凝胶，具有与细胞外基质相似的性质，具有良好的生物相容性，并能在体外生物可降解，还可促进细胞黏附、迁移、增殖和分化。与生物可降解聚合物材料结合可更有效调节体外培养过程中凝胶/聚合物支架系统的降解速率，维持凝胶成分的形态稳定，维持细胞增殖/细胞外基质形成与支架系统降解之间平衡。但目前为止，能够通过天然蛋白水凝胶与聚合物结合的支架体系体外仿生培养人工血管鲜有报道。

技术实现思路

1、因此，本发明提供一种小口径组织工程血管及其制备方法，旨在提供一种制备小口径组织工程血管的新方式。

2、为了实现上述目的，本发明还提供一种小口径组织工程血管的制备方法，所述小口径组织工程血管的制备方法包括：

3、将静电纺聚乙二醇管状薄膜置于管状三明治模具中层；

4、将种子细胞与第一溶液混合制成种子细胞-蛋白混合溶液，并注入含聚乙二醇薄膜的柱状三明治模具中层形成复合凝胶；

5、将所述种子细胞-蛋白-聚合物复合凝胶静态培养至稳定后，在模拟机体动脉搏动流压力条件下，继续动态灌流培养并获得由种子细胞和细胞外基质构成的组织工程血管；

6、将所述组织工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得仅由细胞外基质构成的组织工程血管。

7、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述第一溶液为纤维蛋白、胶原蛋白、透明质酸、以及明胶溶液中多种混合形成时，各成分占比为1％-90％。

8、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述将种子细胞与第一溶液混合制成种子细胞-蛋白混合溶液，并注入含聚乙二醇薄膜的柱状三明治模具中层凝胶成型的步骤，包括：

9、将种子细胞与第一溶液混合制成种子细胞-蛋白混合溶液，并注入含聚乙二醇薄膜的柱状三明治模具形成复合凝胶。

10、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述柱状三明治模具从外至内依次包括第一支撑壁、第二支撑壁以及由第三支撑壁形成的中空轴结构，所述中空轴结构位于中心位置，所述中空轴结构的直径2-6mm，所述第二支撑壁形成的中层内径为3-10mm，所述第一支撑壁形成的外层内径为8-30mm，模具长度为10-50cm，第二支撑壁和所述第三支撑壁上均匀分布有多个贯穿孔结构，所述贯穿孔结构的孔径10um-100um。

11、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述将所述种子细胞-蛋白-聚合物复合凝胶静态培养至稳定后，在模拟机体动脉搏动流压力条件下，继续动态灌流培养并获得由种子细胞和细胞外基质构成的组织工程血管的步骤，包括：

12、将所述种子细胞-蛋白-聚合物复合凝胶静态培养1-2周后，在模拟机体动脉搏动流压力条件下，继续动态灌流培养2周-12周，获得由种子细胞和细胞外基质构成的组织工程血管。

13、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述模拟机体动脉搏动流压力条件包括：

14、先静态体外培养至1-2周后，将血管转移至脉冲流生物反应器，再在0-90mmhg压力的动脉搏动流下培养1-2周，后将动脉搏动流提高到90-130mmhg继续培养，在培养过程的最后一周将动脉搏动流压力提高到130-180mmhg培养。

15、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述将所述种子细胞-蛋白-聚合物复合凝胶静态培养至稳定后，在模拟机体动脉搏动流压力条件下，继续动态灌流培养并获得由种子细胞和细胞外基质构成的组织工程血管的步骤中，静态培养的培养条件包括培养基、培养基补充剂以及活性细胞因子，所述培养基包括低糖或高糖dmem、dmem/f-12、rpmi 1640、以及mem中的一种或多种；

16、所述培养基补充剂包括胎牛血清fbs或fcs、牛血清bs、小牛血清cs、新生小牛血清ncs、山羊血清、马血清、人血清、猪血清、鸡血清、兔血清、以及血清替代物中的一种或两种，且所述培养基补充剂占总培养基比例5％-50％；

17、所述活性细胞因子包括纤维母细胞生长因子、血管生成素、血管紧张素、内皮素、acsdkp、血管调节素、促血管素、内皮细胞生长因子、内皮瘤源性运动因子、表皮生长因子、内皮细胞活力维持因子、胰岛素样生长因子、肝素结合神经营养因子、人子宫血管生成因子、血小板源性内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、胎盘生长因子/血管通透性因子、转移生长因子、转化生长因子tgf、骨成形蛋白bmp、白细胞介素、趋化因子配体ccl和cxcl和生长激素中的一种或多种组合,所述活性细胞因子的含量为1ng-100ug/ml。

18、优选地，在所述小口径组织工程血管的制备方法中，所述种子细胞包括成体人或哺乳动物的血管成纤维细胞、皮下结缔组织成纤维细胞、皮肤成纤维细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞和诱导多功能干细胞分化而来的成纤维细胞、平滑肌细胞、以及内皮细胞中的一种或多种。

19、为了实现上述目的，本发明还提供一种小口径组织工程血管，所述小口径组织工程血管采用上述的小口径组织工程血管的制备方法制备得到。

20、优选地，在所述小口径组织工程血管中，所述小口径组织工程血管的细胞外基质蛋白包括胶原蛋白i和胶原蛋白iii。

21、为了实现上述目的，本发明还提供一种小口径组织工程血管的应用，所述小口径组织工程血管应用于慢性肾衰透析血管通路、冠脉搭桥、外周血管替换，还可用于食管、气管、输尿管、尿道、胆道、输卵管、或者输精管替代物；

22、或者，应用于制备同种异体心脏瓣膜；

23、或者，应用于外科手术补片。

24、本发明具有如下有益效果：

25、本发明提供的小口径组织工程血管的制备方法，将静电纺聚乙二醇管状薄膜置于柱状三明治模具中层，将种子细胞与第一溶液混合制成种子细胞-蛋白混合溶液，并注入含有聚乙二醇薄膜支架的柱状三明治模具中层形成凝胶，再将所述种子细胞-蛋白-聚合物复合凝胶静态培养至稳定后，在模拟机体动脉搏动流压力条件下，继续动态灌流培养并获得由种子细胞和细胞外基质构成的组织工程血管，最后将所述组织工程血管利用脱细胞方法脱去管壁细胞成分，获得仅由细胞外基质构成的组织工程血管，如此得到的小口径组织工程血管具有仿人体自体血管的结构和成分，植入体内具有良好的生物相容性、抗血栓、快速内皮化以及促进组织再生的优势；

26、进一步地，小口径组织工程血管植入人体后可实现快速内皮化，促进血管组织再生，有效解决血栓形成问题和提高远期通畅率。即小口径组织工程血管具有良好的再生性能，可以在原位实现血管再生。

27、进一步地，本发明获得的小口径组织工程血管由于具有径向成型的蛋白纤维组成的仿生细胞外基质3d结构，该小口径血管替换病变血管或通过旁路搭桥术后，生物相容性高，利于细胞的粘附与生长，实现快速内皮化，防止形成血栓，远期通畅率高。