Rab5作为靶点在促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复方面的应用

本发明属于生物医学，具体涉及一种蛋白rab5及其在促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复方面的应用。

背景技术：

1、中枢神经元的轴突损伤是生活中常见的疾病，其以神经轴突断裂为特征，常见于外力诱发的各种事故中，例如车祸、摔伤等。轴突损伤会导致运动功能的丧失，给患者的生活带来极大的不便。在如今的治疗水平下，轴突修复在临床上鲜有成功案例。主要原因是高等动物的中枢神经元的轴突在损伤后几乎不会再生，导致运动功能难以恢复。为此，发掘与探索中枢神经元轴突损伤后再生的分子机制，可以帮助我们了解再生的原理，有助于促进中枢神经元的轴突损伤修复。

2、rab家族是最大的ras亚家族之一，存在于所有真核生物中，而rab5则在所有真核生物中都极度保守。rab5在体内的主要作用是介导内体的生成以及运输。但尚未见关于rab5与中枢神经轴突再生和运动功能恢复的关系的研究。

技术实现思路

1、本发明要解决的问题是提供rab5作为靶点在促进神经轴突再生和运动功能恢复当面的应用，体内过表达rab5，可以显著的促进斑马鱼毛特纳神经元轴突的再生，为中枢神经元的轴突再生提供新的靶点。

2、具体来说，本发明提供以下技术方案：

3、一方面，本发明提供促进rab5表达的试剂在制备促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复的药物中的用途。

4、在一些实施方案中，所述试剂包括过表达rab5蛋白的系统。

5、在一些实施方案中，采用gal4/uas表达系统过表达rab5蛋白，gal4基因与uas基因分别存在于两个表达载体中，所述rab5蛋白的核苷酸序列与uas基因连接，启动子与gal4基因连接，所述gal4基因与所述uas基因结合后启动所述rab5蛋白的表达。

6、在一些实施方案中，所述启动子为cmv启动子。

7、在一些实施方案中，所述cmv启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示。

8、在一些实施方案中，所述gal4基因的核苷酸序列如seq id no:5所示。

9、在一些实施方案中，所述uas基因的核苷酸序列如seq id no:6所示。

10、另一方面，本发明提供促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含rab5蛋白。

11、在一些实施方案中，所述rab5蛋白包含如seq id no:1或seq id no:2或seq idno:3所示的序列，或由其组成。

12、另一方面，本发明提供筛选促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复的药物的方法，所述方法包括检测rab5的表达水平。

13、另一方面，本发明提供促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含rab5蛋白和药学上可接受的载体。

14、另一方面，本发明提供促进rab5表达的试剂或核酸构建体在制备促进受试者的中枢神经轴突再生和运动功能恢复的药物中的用途。

15、另一方面，本发明提供促进中枢神经轴突再生和运动功能恢复的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用有效量的rab5蛋白或在受试者中过表达rab5。

16、在一些实施方案中，所述受试者可以是斑马鱼或人或其他哺乳动物，包括但不限于猴，猫，狗，马，兔，啮齿动物(例如，小鼠，大鼠，仓鼠和豚鼠)、牛、绵羊和山羊。

17、本发明的实施例提供一种蛋白rab5，其可作为中枢神经轴突损伤修复的蛋白靶点。

18、本发明还提供rab5的用途，用于制备促进神经轴突再生和运动功能恢复的药物。

19、其中所述神经损伤为双光子毁损斑马鱼毛特纳神经元单侧轴突。

20、本发明还提供rab5在促进促进神经轴突再生和运动功能恢复方面的应用，包括如下验证步骤：

21、s1、获取绿色荧光标记毛特纳神经元的斑马鱼，并利用单细胞电转染技术在单细胞内过表达rab5，在利用双光子激光毁损其轴突后，观察其过表达促进轴突再生的情况；

22、s2、利用药物处理绿色荧光标记毛特纳神经元的斑马鱼，在利用双光子激光毁损其轴突后，抑制性药物处理会阻碍rab5的正常表达，观察其缺失抑制轴突再生的情况；

23、s3、将前两步获得的斑马鱼收集，并在轴突毁损48h后拍摄其轴突再生长度，放置在行为学装置下观察轴突再生长度与运动功能恢复的关系。

24、其中，步骤s1的具体步骤为：

25、s1.1、将三条雌性t056品系斑马鱼与两条wt雄性斑马鱼分别置于同一产卵缸内，黑暗条件下过夜处理12h。

26、s1.2、早上将所有斑马鱼置于光亮场所下，并将雌雄斑马鱼混合。

27、s1.3、待斑马鱼产卵结束后回收斑马鱼，并收集产出的斑马鱼卵。

28、s1.4、将斑马鱼卵转移至玻璃大皿中，并挑去未受精与死亡的鱼卵，置于光亮培养箱中24h。

29、s1.5、取出斑马鱼卵，换水并挑去死卵，加入适量ptu以抑制色素的生成。置于培养箱中24h。

30、s1.6、取出斑马鱼卵，换水并挑去死鱼与死卵，加入适量ptu以抑制色素的生成。置于培养箱中48h。

31、s1.7、取出受精后四天(4dpf)的斑马鱼幼鱼，用ms222将其麻醉并用1％融化的琼脂糖固定在特制的电转板上。

32、s1.8、将cmv-gal4与uas-mcherry-rab5质粒按照比例混合并加入一定量的红色荧光染料。

33、s1.9、将混合好的质粒用细枪头打入预先拉制好的电极丝中，并安装在微操手上。

34、s1.10、将固定完成的斑马鱼幼鱼置于共聚焦显微镜下，并在镜下将电极丝触碰到毛特纳神经元的胞体，施加电刺激，使得胞体转染成功显示出红色荧光。

35、s1.11、释放出固定的斑马鱼幼鱼，并放入培养箱中培养24h。

36、s1.12、取出斑马鱼，换水并挑去死鱼，置于培养箱中24h。

37、s1.13、取出受精后六天(6dpf)的斑马鱼幼鱼，用ms222将其麻醉并用1％融化的琼脂糖固定在载玻片上。

38、s1.14、将固定有斑马鱼幼鱼的载玻片置于配备有双光子激光器的共聚焦显微镜下，并寻找至泄殖孔附近的轴突位点，利用高能双光子激光器毁损轴突。

39、s1.15、释放出轴突损伤后的斑马鱼幼鱼，并放入培养箱中培养24h。

40、s1.16、取出斑马鱼，换水并挑去死鱼，置于培养箱中24h。

41、s1.17、取出斑马鱼，用ms222将其麻醉并用1％融化的琼脂糖固定在载玻片上。

42、s1.18、将固定完成的斑马鱼幼鱼置于共聚焦显微镜下，成像其轴突再生情况，并拍照统计各组长度。

43、其中，步骤s2的具体步骤为：

44、s2.1、将三条雌性t056品系斑马鱼与两条wt雄性斑马鱼分别置于同一产卵缸内，黑暗条件下过夜处理12h。

45、s2.2、早上将所有斑马鱼置于光亮场所下，并将雌雄斑马鱼混合。

46、s2.3、待斑马鱼产卵结束后回收斑马鱼，并收集产出的斑马鱼卵。

47、s2.4、将斑马鱼卵转移至玻璃大皿中，并挑去未受精与死亡的鱼卵，置于光亮培养箱中24h。

48、s2.5、取出斑马鱼卵，换水并挑去死卵，加入适量ptu以抑制色素的生成。置于培养箱中24h。

49、s2.6、取出斑马鱼卵，换水并挑去死鱼与死卵，加入适量ptu以抑制色素的生成。置于培养箱中48h。

50、s2.7、取出斑马鱼，换水并挑去死鱼，加入适量ptu以抑制色素的生成。置于培养箱中48h。

51、s2.8、取出受精后六天(6dpf)的斑马鱼幼鱼，用ms222将其麻醉并用1％融化的琼脂糖固定在载玻片上。

52、s2.9、将固定有斑马鱼幼鱼的载玻片置于配备有双光子激光器的共聚焦显微镜下，并寻找至泄殖孔附近的轴突位点，利用双光子激光器的高能量毁损轴突。

53、s2.10、释放出轴突损伤后的斑马鱼幼鱼，分别加入终浓度为10μm、20μm、50μm和100μm的rab5抑制剂cid-1067700中，并放入培养箱中培养24h。

54、s2.11、取出斑马鱼，换水并挑去死鱼，补充含有rab5抑制剂cid-1067700的水，置于培养箱中24h。

55、s2.12、收集部分斑马鱼(40条左右)，加入适量的含有1％的蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上超声裂解5-10min直至鱼体完全裂解；4℃离心，13000rpm，10min，收集上清；

56、s2.13、bca法蛋白定量；

57、s2.14、进行sds-page电泳，转膜后用5％bsa室温封闭1h；

58、s2.15、孵育一抗，用一抗稀释液稀释r-rab5(1:1000)，4℃摇床孵育过夜；

59、s2.16、1xtbst清洗三遍，每遍3min；

60、s2.17、用二抗稀释液稀释r-hrp(1:5000)，室温孵育1h；

61、s2.18、1×tbst清洗三遍，每遍3min；

62、s2.19、在膜上孵育ecl显色液，1-3min，显影并观察条带结果，保存在电脑上。

63、s2.20、利用抗体去除液处理30min以去除抗体；

64、s2.21、孵育一抗，用一抗稀释液稀释r-tubulin(1:1000)，4℃摇床孵育过夜；

65、s2.22、1×tbst清洗三遍，每遍3min；

66、s2.23、用二抗稀释液稀释r-hrp(15000)，室温孵育1h；

67、s2.24、1×tbst清洗三遍，每遍3min；

68、s2.25、在膜上孵育ecl显色液，1-3min，显影并观察条带结果，并保存在电脑上。

69、s2.26、取出斑马鱼，用ms222将其麻醉并用1％融化的琼脂糖固定在载玻片上。

70、s2.27、将固定完成的斑马鱼幼鱼置于共聚焦显微镜下，成像其轴突再生情况，并拍照统计各组长度。

71、其中，步骤s3的具体步骤为：

72、s3.1、将步骤s1与s2所得的斑马鱼取出，并置于搭建完成的高速摄影装置下。

73、s3.2、静置5分钟左右，直到斑马鱼适应环境并不再游动。

74、s3.3、播放刺激音频，引起斑马鱼的逃避反应，并用高速摄影机拍摄下斑马鱼转身的视频。

75、s3.4、重复上述步骤，保证每条斑马鱼拍摄一到两条完整的视频。

76、s3.5、利用软件处理高速摄影视频，并计算各组斑马鱼的最大转身角度与平均角速度。

77、定义

78、gal4/uas：gal4/uas是存在于酵母中的基因表达调控系统。uas是upstreamactivating sequence的缩写。gal4是转录调控因子，其结合结构域(bd)与uas序列结合后，其激活结构域(ad)和启动子区域结合，从而诱导基因的表达。gal4/uas系统的关键点在于：gal4与uas基因分别存在于两个转基因系中。gal4转基因系中有转录激活子，但没有靶基因，体系的建立需要组织特异性的启动子或增强子。在uas-靶基因系中，将需要的靶基因插入到uas下游，就可建立uas-转基因系。由于uas-靶基因系中，其转录激活不存在，因而靶基因处于沉默状态，只有将gal4转基因系与uas-靶基因系进行杂交，才可能产生特异表达靶基因的后代，既可以用于基因过表达，也可以用于基因敲除和细胞特异缺失。

79、mcherry：一种红色荧光蛋白，广泛用于生物技术作为示踪剂。其细胞毒性低，比其它荧光蛋白标签更优异。

80、cmv启动子：来自巨细胞病毒，是公认的启动真核基因表达的强启动子，被广泛用于构建高效真核表达载体。

81、试剂：本发明的试剂应做广义理解，其包括能够促进rab5表达的表达载体、质粒、功能性基因片段等。所述表达可以是基因的表达也可以是蛋白的表达。

82、本发明的上述技术方案的有益效果如下：

83、1、本发明以rab5作为蛋白干预靶点，过表达rab5促进斑马鱼毛特纳神经元的轴突再生。

84、2、本发明以rab5作为蛋白干预靶点，抑制rab5表达会导致斑马鱼毛特纳神经元的轴突再生减弱。

85、3、本发明提供的rab5可以通过促进斑马鱼毛特纳神经元的轴突再生，促进斑马鱼运动功能的恢复。有助于更好的理解rab5在神经轴突损伤修复过程中的重要作用，并为轴突损伤后的治疗提供新的靶点。