一种人胎盘来源自然杀伤细胞制剂及其制备方法与流程

本发明涉及细胞培养，具体是指一种人胎盘来源自然杀伤细胞制剂及其制备方法。

背景技术：

1、nk细胞在1975首次被科学家发现，由于其发挥杀伤活性不需要预先刺激，因此在人类恶性肿瘤细胞免疫治疗中具有很大潜力。nk细胞起源于骨髓中共同淋巴祖细胞，之后广泛分布在淋巴和非淋巴组织，包括骨髓、淋巴结、脾、外周血、肺、肝、脐带血、胎盘等。

2、过继性nk细胞免疫治疗是通过将体外激活扩增的自体或异体免疫细胞输注肿瘤宿主体内的一种肿瘤治疗方法。自然杀伤(natural killer，nk)细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，杀伤机制包括:fasl与fas相互作用、穿孔素/颗粒酶作用、借助表面cd16与肿瘤特异性igg发生的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(adcc)、肿瘤凋亡相关因子(tnf-α、ifn-γ)的分泌作用。nk细胞除对靶细胞具有溶解杀伤作用外，nk细胞还在机体免疫反应中具有重要功能。nk细胞可通过对mφ、粒细胞、树突状细胞的调节作用而控制天然免疫力。

3、目前，临床上成熟的nk细胞主要来源于外周血、新生儿胎盘和脐带血，自身nk细胞受放化疗、年龄等因素影响，细胞的数量、活力诱导后细胞杀伤效应严重影响临床疗效。自体采血后细胞制备周期较长，患者未能及时应用，而异体nk细胞，尤其是新生儿围产组织胎盘中，数量充足、增殖能力更强、低免疫原性，可以临床异体使用，并且可以作为现货产品，大大节省人力、物力和财力。胎盘组织属于产后废弃物，归产妇所有。因此胎盘组织有望成异体nk细胞的主要来源之一。

4、nk细胞作为临床细胞治疗的关键成分，细胞的活性、毒性和均一性对发挥治疗效果尤其重要。生理盐水、葡萄糖注射液、人血白蛋白、右旋糖苷等单一成分作为细胞的输注介质，由于营养单一和缓冲能力差，细胞活性在12h内下降至90％以下，细胞的毒性不足，均一性不稳定，导致临床研究应用存在安全隐患和疗效不佳。而冻存的nk细胞虽能保证细胞活性，但冻存液中常含有dmso等冷冻保护剂，且需要液氮低温冷连运输、化冻复苏等弊端，并且复苏后的细胞毒性、杀伤性仍有待进一步的研究。因此发明一种成分明确，临床输注安全，有效长时间维持输注nk细胞的活性、毒性和均一性的制剂就成为了临床治疗亟需解决的问题。

5、人血白蛋白为细胞提供营养，维持细胞活性，同时可以增强单个细胞的稳定性，避免聚团，防止回输过程引起栓塞。

6、维生素c是一种强大的抗氧化剂，可以通过清除自由基，减少炎症反应，并促进组织修复。另外维生素c还可以调节免疫系统的功能，有研究发现维生素c可以增加nk细胞的活性。

7、il-15是il-2最有前途的替代品，相较于il-2，il-15拥有不激活treg的优点。体外研究表明il-15可以增强tme中耗竭状态的nk细胞的功能，并且在缺氧条件下能够增强nk细胞释放颗粒酶b、ifn-γ的能力。几种重组il-15已用于临床治疗(hteil-15/niz985、n-803/alt-803)

8、胸腺肽(thymic peptide)是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一类多肽激素，有效组分包括：胸腺素α1、胸腺生成素、腺体液因子、血清胸腺因子等。胸腺肽是一种免疫调节剂，主要有增强免疫功能的作用，能诱导淋巴细胞分化、增殖与成熟，提高自然杀伤细胞(nk细胞)的活性并可增强巨噬细胞吞噬和抗原递呈功能。

9、右旋糖酐40葡萄糖注射液：血容量扩充剂，静注后能提高血浆胶体渗透压，吸收血管外水分而增加血容量，升高和维持血压。它可使已经聚集的红细胞和血小板解聚，降低血液粘滞性，改善微循环，防止血栓形成；葡萄糖是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。

10、辅酶q10(coenzyme q10)是细胞线粒体中电子传递链和有氧呼吸的参与物质之一,通过保护细胞免受自由基氧化损伤和降低细胞凋亡从而在细胞抗氧化系统中发挥重要作用，可以显著提高细胞活性，研究发现，辅酶q10能激活nk细胞，t细胞，巨噬细胞的吞噬能力，对免疫系统有极大的推动作用。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术的不足，提供一种能够有效维持nk细胞的活性、毒性和均一性、且成分明确、不含异源动物血清、安全性能高的自然杀伤细胞制剂。

2、为实现上述目的，本发明提出的技术方案为：一种人胎盘来源自然杀伤细胞制剂，由胎盘来源的nk细胞和基质溶液组成；

3、所述基质溶液由右旋糖酐40葡萄糖注射液、5-10％人血白蛋白、0.01-0.05％维生素c、10-20ug/ml胸腺肽注射液、0.20-0.40ug/ml重组il-15、1-10um辅酶q10构成；

4、所述nk细胞是由人胎盘叶状绒毛组织经洗涤、酶消化分离获得单个核细胞，经体外诱导活化、扩增获得的高纯度、高活性的cd3-cd56+cd16+nk细胞。

5、优选的，nk细胞的浓度维持在0.8-1.2×107/ml，所述的右旋糖酐40葡萄糖注射液中右旋糖酐浓度为6％，葡萄糖浓度为5％。

6、优选的，nk细胞制备包括如下步骤：

7、步骤一：将新鲜采集的胎盘放到无菌托盘内，用含1-2％三抗+200-400iu/ml肝素锂的生理盐水冲洗胎盘外表面2-3次去除表面上的凝血污渍，剪掉脐带、羊膜、底蜕膜等组织；

8、步骤二：剪取胎盘叶状绒毛组织，转移至无菌玻璃皿中，用无菌剪刀将组织剪碎呈0.2-0.5mm3的组织块，每50ml组织块补充100ml生理盐水，将组织转移到200目筛网上过滤，并用200-400ml的生理盐水冲洗组织块，收集滤网上的组织块，每管20ml,加入等体积的1×组织消化液放入恒温摇床，37℃，150-180rpm,震荡消化10-20min；

9、步骤三：待组织消化均匀，加入3-4倍生理盐水稀释，将消化后的组织液过200目的筛网，滤液经2000-2500rpm离心10min，收集底部细胞沉淀，用生理盐水重悬细胞沉淀。将15-25ml细胞悬液加入到淋巴分离管内2000rpm，离心10min，取白膜层，补充生理盐水至50ml，2000rpm，离心8min，弃上清，将细胞沉淀用1640培养基+5％血清替代物重悬后，按1-5×107/ml密度接种于t75或t175培养瓶中，放于37℃5％co2培养箱中孵育2-3h,去除贴壁基质细胞，剩余细胞经2000rpm，离心8-10min，弃上清，底部沉淀即是单个核细胞，即mnc，取样计数，细胞用于诱导扩增或冻存；

10、步骤四：nk细胞体外诱导扩增。

11、优选的，所述组织消化液的配置方法为向100ml hepes-缓冲盐溶液中加入30gdispaseii,5g胶原酶p，100mg dnase i,混合均匀，过0.22微孔滤膜过滤除菌，制备成10倍浓度的母液(10×)，分装后冻存于-20或-80度冰箱备用。

12、优选的，所述nk细胞体外诱导扩增的方法为：将mnc细胞以0.8-1.2×106/ml密度接种到预先包被有cd16抗体和cd335抗体的培养瓶中，加入完全培养基中(x-vivo 15培养基(lonza)+1-5％的血清替代物+1-10ng/ml重组人flt3配体、10-20ng/ml g-csf、50-100ng/ml il-2、50-100ng/ml il-18)，37℃、5％co2环境中培养48h，之后每2天添液一次，当体积大于200ml时，将细胞转入到gt-t610(a)培养袋内继续培养，培养12-15天，待细胞密度达到3-3.5×106/ml时收获成熟的nk细胞用于检测和制剂的制备。

13、一种人胎盘来源自然杀伤细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：

14、步骤一：100ml基质溶液的制备，5-10ml人血白蛋白(20％)、25-125ul维生素c注射液(2.5ml:1g)、0.4-0.8ml胸腺肽注射液(2ml:5mg)、20-40ul重组il-15(1ml:1mg)、32-320ul辅酶q10(5mg/2ml)构成，用右旋糖酐40葡萄糖注射液补至100ml,放于微型振荡器充分震荡，180rpm,震荡30s-1min混匀，放于4℃环境下进行保存；

15、步骤二：将扩增的nk细胞倒入50ml离心管内，1800-2000rpm，离心5-8min,用生理盐水将细胞洗涤2-3次，经100目筛网过滤后，计数，细胞以0.8-1.2×107/ml的密度悬浮在基质溶液中，即制备成nk细胞制剂。

16、本发明与现有技术相比优点在于：本发明能够有效的从人胎盘组织中通过酶消化法获得大量的单个核细胞(mnc)，mnc经诱导、扩增获得大量高纯度、高活性和毒性的nk细胞。由nk细胞和基质溶液制备成的人自然杀伤细胞制剂能够很好的维持nk细胞的活性、毒性和均一性，本发明成分明确，不含异源动物血清，在4-15℃保存72h后，细胞形态均一，存活率保持在90％以上，nk细胞特异性表面标志cd3-cd56+cd16+高于90％，能够高水平的分泌ifn-r、tnf-a、gm-csf等因子，且在效靶比为10：1时对人结肠癌细胞ht-29的杀伤效率高于90％，为免疫细胞的临床应用研究的安全性和有效性提供保障。