一种基于PCNPs的pH响应型仿生纳米制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药，具体说是一种基于pc nps的ph响应型仿生纳米制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

1、动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)是脑卒中、心肌梗死和冠状动脉疾病等cvd最常见的病因，其发生发展多种细胞相互作用的结果。as的发病机制为氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,ox-ldl)损伤血管内皮细胞导致局部炎症反应，损伤部位分泌细胞因子募集循环系统单个核细胞并分化为巨噬细胞内化富含胆固醇的脂蛋白生成泡沫细胞。泡沫细胞分泌细胞外基质，进一步促进脂蛋白的保留，以及促炎因子、单核细胞、t细胞和中性粒细胞的募集。随着炎症和其他细胞毒性因子刺激泡沫细胞，泡沫细胞发生凋亡，并形成坏死核心。凋亡细胞释放细胞炎性内容物，形成正反馈调节，加速as的进展及不稳定斑块的形成，引起心梗等临床致死性并发症的发生随着as的进展。

2、正常机体为维持自我平衡，通过“胞葬作用”清除这些凋亡细胞。胞葬作用是通过吞噬细胞如巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞和成纤维细胞等将凋亡坏死细胞清除的过程，保护周围组织免受凋亡细胞内部有毒的酶、氧化物等细胞内容物的损害。在as早期，胞葬作用处于正常状态，能迅速清除凋亡细胞，防止继发性坏死，还可以诱导抗炎因子的产生，以及清除炎性巨噬细胞，阻止其向泡沫细胞变化。随着as的进展，泡沫细胞不断堆积形成坏死核心，巨噬细胞吞噬凋亡细胞后，胞内急剧增加的胆固醇使得巨噬细胞外排功能受损，进而导致胞葬作用严重受损，加重as进展。因此，恢复巨噬细胞的胞葬作用是缓解as的切实可行策略。

3、匹伐他汀(通常作为钙盐)是他汀的降血脂降低药物类别的成员。有报道指出，匹伐他汀通过激活巨噬细胞erk5通路增强其胞葬作用，进而清除坏死核心。然而，长期口服用药血药浓度低，清除快，为达到疗效需采用高剂量治疗，这种缺乏靶向性的药物容易产生肝肾损害。因此，如何克服传统给药方式所具有的缺陷，实现病人的个体化治疗具有非常广阔的发展前景。

4、随着纳米技术的快速发展，纳米医学发展也取得了长足的进步。纳米医学是指利用纳米级材料，如具有良好生物相容性的纳米颗粒(nanoparticles,nps)或纳米机器人进行生物诊断和药物递送等，以实现精准治疗。nps是一种尺寸在几百纳米以下的材料总称，这种尺寸极小的材料因其能够穿越各种生物屏障，并将包裹药物靶向释放于特定组织而受到生物医学领域的广泛关注。pc母核结构式与茶多酚中的egcg相似，均是多酚黄酮类，基于这一理化特点，pc在一定条件下可以发生聚合，形成线性多酚寡聚分子。随着浓度提高，线性多酚寡聚物在氢键、疏水作用和π-π相互作用下逐渐聚集形成中空的多酚nps。之后，通过溶剂转换实现nps的溶解与再组装，并借助pc主要的官能团(酚羟基)对蛋白和部分药物分子间强烈的结合作用，构建具有高载药率的pc-药物nps。此nps具有效率高、产量大和调控灵活等特性。为解决他汀类药物高剂量治疗产生的肝肾损伤的问题，本研究用pc合成的中空线性多酚寡聚物包裹匹伐他汀(pc@pita)，以减少他汀类药的毒性。有研究表明，与pc相似的egcg自组装形成多酚nps之后依然保留了多种生物活性，因此，pc在形成线性多酚nps之后也会保留多种生物活性，多酚nps的形式可以提高pc的生物利用度，增强治疗效果。为了进一步提升nps的递送效率和释放效应，nps和药物必须进一步进行功能性修饰，使其可以在特定靶向病变部位微调并释放药物，达到杀伤病变细胞的效果。目前已有一些对各种生化或物理信号敏感的纳米载体用于靶向亚细胞器或病变部位的药物运输和缓释的报道。因此，我们在pc@pita外层连接一层ha以靶向斑块区域的炎性巨噬细胞并实现药物积累。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种基于pc nps的ph响应型纳米制剂及其制备方法和应用，该ph响应型纳米制剂能够实现药物共同递送、减少载体的影响、增强靶向能力以及在病变部位的可控释放。

2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于pc nps的ph响应型仿生纳米制剂，所述ph响应型纳米制剂包括原花青素自组装纳米颗粒(pc nps)、疏水性药物和具有靶向作用的透明质酸，所述疏水性药物负载于pc nps内，具有靶向作用的透明质酸修饰于负载有疏水性药物的pc nps的外层；

3、所述pc nps是通过酚醛缩合+苯并恶嗪反应(酚+伯胺+醛)生成线性的多酚寡聚物，再随着浓度提高，多酚寡聚物在氢键、疏水作用和π-π相互作用下逐渐聚集形成的多酚纳米粒子；

4、所述ph响应型纳米制剂的粒径为140-200nm。

5、作为优选，所述疏水性药物为匹伐他汀。

6、本发明还提供了一种基于pc nps的ph响应型仿生纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

7、s1、将pc先与甲醛进行超声搅拌处理并避光反应5min，再滴加甘氨酸超声搅拌处理并避光反应2h得到乳液，所述乳液为pc nps；

8、s2、将疏水性药物匹伐他汀溶解后加入到所述pc nps中进行超声搅拌处理，所得溶液依次经透析、冷冻干燥得到负载疏水性药物的纳米制剂(pc@pita)；

9、s3、将所述负载疏水性药物的纳米制剂与透明质酸溶液超声搅拌处理混合后依次经透析、冷冻干燥得，得到ph响应型纳米制剂(ha@pc@pita nps)。

10、作为优选，所述步骤s1中，pc、甲醛、甘氨酸的浓度分别为2.5mg/ml，37％，10mg/ml。

11、作为优选，所述步骤s2中pc nps与所述疏水性药物的质量比为3mg：0.2mg，所述步骤s3中pc nps与所述透明质酸的质量比为3mg：0.05mg。

12、作为优选，所述步骤s2和s3中的透析均使用截留分子量为3.5kda的透析袋透析6h。

13、作为优选，所述步骤s1中，所述pc nps的具体制备过程为：

14、s101，将10mg pc溶于4ml ddh2o成浓度为2.5mg/ml红棕色溶液，加入浓度为37％的10μl hcho，搅拌速度为800rpm下避光反应5min；

15、s102，将8mg gly溶于0.8ml ddh2o成浓度为10mg/ml的无色透明溶液，滴加进入s101所得的溶液中，搅拌速度为800rpm避光反应2h；

16、s103，将s102所得的溶液在搅拌速度为13000rpm下离心10min，沉淀水洗三遍得到pc nps，按3mg/支分装，存储于-20℃。

17、作为优选，所述步骤s1、s2和s3中超声搅拌的搅拌转速均为800rpm，超声功率均为100w且超声时间均为2min。

18、本发明另外一方面还提供了基于pc nps的ph响应型仿生纳米制剂在制备预防和/或治疗动脉粥样硬化的药物中的应用。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、1、本发明设计了一种绿色、可生物降解的仿生纳米制剂，利用透明质酸和ph响应的设计特点，实现药物在病变部位的特异性聚集、渗透和可控释放。本发明酚醛缩合和苯并恶嗪反应实现原花青素自组装纳米颗粒(pc nps)，由于pc nps能在dmso中重组装，通过溶剂转换实现nps的溶解与再组装，并借助pc主要的官能团(酚羟基)对蛋白和部分药物分子间强烈的结合作用，构建具有高载药率的pc-药物nps。利用透明质酸修饰于pc-药物nps外层(ha@pc@pita nps)，实现纳米制剂的病变部位的靶向能力。当该ph响应型仿生纳米制剂到达病变部位后，利用ha和活化巨噬细胞表面受体cd44相互作用，成功实现ph响应型纳米制剂靶向进入活化巨噬细胞内。同时，利用微环境中的微酸(ph6.4-6.8)环境促进疏水性药物从ph响应型仿生纳米制剂中释放，进而实现药物在病变部位的可控释放；

21、2、本发明除了负载治疗和/或预防动脉粥样硬化的疏水性药物，且提供的这种具有微环境响应特性的仿生纳米制剂可以通过替代不同疏水性药物作为其他疾病治疗的替代平台，如肿瘤、类风湿关节炎等，因而本发明提供的刺激ph响应型仿生纳米颗粒拥有多种功能和优势来治疗多种疾病；

22、3、本发明提供的基于pc nps的ph响应型仿生纳米制剂，利用pita抗炎、促进自噬和增强胞葬等抗动脉粥样硬化效应，实现动脉粥样硬化防治效果的最大化；

23、4、本发明解决了动脉粥样硬化晚期治疗难逆转和毒副作用大的问题，同时又能改善药剂的斑块和活化巨噬细胞靶向效果以及ph响应的可控释放能力，为开发新型防治动脉粥样硬化的药剂及相关临床预防和治疗提供新理论支持，具有重要的科学意义、使用价值和经济价值。