一种可控释放一氧化碳的纳米颗粒及其制备方法和应用

本发明涉及纳米药物，尤其是涉及一种可控释放一氧化碳的纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、一氧化碳(co)是一种气体信使分子，具有丰富的生物学效应，对许多疾病具有治疗潜力。作为一种生物活性物质，co在许多生理和病理方面具有调节作用，这主要是因为co能够和铁质血红蛋白(hb)等呼吸链复合物结合，从而影响它们的功能并引发级联效应。co的调节血管张力效应可以活血化瘀，抗氧化作用可以减少氧化应激缓解炎症，抗凋亡作用可以抑制线粒体途径的细胞凋亡，促修复作用可以促进组织再生，因此co是一种理想的疾病治疗活性剂。正是由于co的诸多作用，一氧化碳(co)气体治疗成为了一种新兴的医疗技术，已逐渐应用于多种疾病的治疗，如心血管疾病、败血症、休克、急性肺、肾和肝损伤、微生物感染及癌症等。

2、气态的co难以储存和运输，它的扩散性使其在体内的浓度和位置不可控，容易引起无效或中毒风险。并且co气体治疗的疗效取决于co的浓度及体内位置，浓度过低没有明显治疗作用，浓度过高则会带来中毒风险，同时co漫无目的地扩散到全身各处后也容易引起全身毒性，co的可控精准释放至关重要。

3、因此co气体治疗必须依托于特定的平台，以实现按需精准释放。产气平台的构建对于co气体治疗的应用至关重要，而纳米材料由于其种类多样性、结构多变性和功能多样化而成为一种理想的选择，目前已有脂质体、水凝胶、多肽、蛋白质和金属有机框架等材料用于产气纳米平台(ggns)的构建。依托于特定的ggns，通过调节纳米粒子的结构、形状、大小和表面修饰等实现co的控制释放，同时ggns本身也可实现功能多样化，如进行联合治疗、协同治疗和影像指导等。ggns的构建为co气体治疗的发展和普及提供了有价值的思路。

4、co释放分子(corms)是一种产气纳米平台，可以释放出co气体的物质，它们可以作为储气瓶在体内或体外释放co气体。常见的corms有：金属卟啉配合物、有机化合物和单核铁卟啉类化合物等。羰基金属是过渡金属(镍、钴、钌、钒、铬、锰和铁)与co形成的配合物，可以在特定的条件下释放co。考虑到金属代谢物的安全性，羰基锰和羰基铁比较适合生物应用，在这些化合物中，十二羰基三铁(fe3(co)12)的储气量最高，因此是一种理想的co供体。但这些化合物的水溶性很差，生物相容性，以及co释放的可控性，有待提升。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种可控释放一氧化碳的纳米颗粒，能够有效提高一氧化碳的负载量、纳米颗粒的生物安全性强及一氧化碳的可控释放，从而可实现高效低毒co气体疗法。

2、本发明还提供了上述纳米颗粒的制备方法。

3、本发明还提供了上述纳米颗粒的应用。

4、根据本发明第一方面的实施例，提供了一种可控释放一氧化碳的纳米颗粒(简称fe3(co)12@croc-peg)，所述纳米颗粒包括十二羰基三铁(fe3(co)12)和包覆所述十二羰基三铁的croc-peg，所述croc-peg为croc(克酮酸菁染料)和mpeg-nh2(端氨基取代的聚乙二醇)的缩合产物；所述croc的分子式为：

5、

6、根据本发明实施例的纳米颗粒，至少具有如下有益效果：

7、(1)fe3(co)12是一种储气量较高的羰基金属，可在光热刺激下释放co，且其中的金属元素铁是人体必需微量元素，采用fe3(co)12作为co供体，具有较高的在co载量、生物安全性，以及可控释放co的潜力；但是其水溶性和生物相容性很差。

8、croc-peg，是一种聚合物状的功能克酮酸菁染料，呈现一端亲水(peg提供)一端疏水的结构特性，疏水结构可和fe3(co)12结合，亲水结构朝外，由此可形成croc-peg包覆fe3(co)12的核壳结构，解决了fe3(co)12不溶于水、生物相容性差和半衰期短的问题。实验验证，本发明提供的纳米颗粒可在多种生物介质(水、pbs、培养基和血清)中稳定存在；且纳米颗粒的组装稳定，在多次离心-悬浮的反复操作中，既不会发生fe3(co)12的析出，也不会发生croc-peg的游离。

9、(2)croc-peg主要分为两个部分：croc和peg。croc是染料核心部分，具有ph响应性荧光成像和光声成像性能，而很多疾病都是微酸性环境，因此可以用于疾病微环境的监测，还解决了fe3(co)12可控释放co的问题。具体的croc-peg在近红外(nir)激光照射下具有显著的光热升温效应；fe3(co)12在热作用下，可实现co的释放。因此，本发明提供的纳米颗粒可实现光热促进co释放的功能，同时自由基也会促进co的释放。因此，croc-peg是一种理想的递送载体，和fe3(co)12配合使用，可实现co的可控释放。

10、(3)croc-peg作为载体，具有良好的生物降解性和生物相容性，其上官能团种类丰富，便于修饰和改良，临床转化前景大。

11、综上，本发明提供的纳米颗粒，具有高负载、生物安全性强及可控释放co的作用，有望实现高效低毒co气体疗法。

12、根据本发明的一些实施例，所述mpeg-nh2的分子量为2k～5k。当mpeg-nh2的分子量为5k时，croc-peg称为croc-peg5k。其他分子量的参考此处简写。

13、mpeg-nh2分子量的长度和十二羰基三铁的包封率和所述纳米颗粒的粒径大小呈正相关关系。上述范围内的分子量，可制备得到粒径在100～200nm范围内，适合生物应用的纳米颗粒，且对十二羰基三铁的包覆率较高。实际生产中，可根据所需负载的十二羰基三铁调节所用mpeg-nh2的分子量。

14、根据本发明的一些实施例，所述十二羰基三铁，和所述croc-peg的摩尔比为5～6:1。例如具体可以是5.5～5.6:1。

15、根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒具有近球状结构。

16、根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒的平均尺寸为80～110nm。例如具体可以是约100nm。若无特殊说明，本发明中的平均尺寸，为采用dls测试所得图谱的峰位粒径。

17、根据本发明的一些实施例，所述纳米颗粒具有近红外光和自由基双重响应性。即在外源近红外光或内院自由基的作用下，均可促进氧化碳的释放。由此可通过多种途径实现氧化碳的可控释放，克服了co由扩散性导致的浓度不可控的技术难题，为co气体治疗的普及提供了技术指导。

18、根据本发明第二方面的实施例，提供了一种所述纳米颗粒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

19、s1.将所述十二羰基三铁分散在thf中，得分散液a；

20、将所述croc-peg分散在thf中，得分散液b；

21、s2.将所述分散液a和分散液b添加至水中，并混合；

22、s3.向步骤s2所得混合中鼓入保护气体，之后将所得混合物通过滤膜，超滤浓缩所得滤液。

23、根据本发明提供的制备方法，至少具有以下有益效果：

24、(1)由于croc-peg具有一端亲水一端疏水的特性，通过亲疏水作用力包裹fe3(co)12，制得具有核-壳结构的纳米颗粒fe3(co)12@croc-peg，该纳米颗粒可实现nir(近红外)激光和自由基双重响应释放co。

25、(2)由于croc-peg核fe3(co)12本身的亲疏水性质，在水溶液中，两者可自发装配形成核壳结构，因此本发明可通过简单的纳米共沉淀法制得具有核壳结构的纳米颗粒；该制备方法所用原料组分简单，制备工艺常规，重复性好，稳定性高，适用于批量及工业化生产。

26、(3)所述制备方法步骤s1中，选用thf作为溶剂，其具备溶解十二羰基三铁和croc-peg的能力，还可以和水互溶；由此方便制备得到所述纳米颗粒。

27、根据本发明的一些实施例，步骤s1中，所述croc-peg的来源包括外部购买，或实验室自制。

28、根据本发明的一些实施例，步骤s1中，所述croc-peg的合成方法(来源为实验室自制时)包括以下步骤：

29、d1.将4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应产物(简称中间产物)和克酮酸反应，得克酮酸菁染料(简称croc)；

30、d2.使所述克酮酸菁染料和mpeg-nh2发生酰胺缩合反应。

31、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的物质的量之比为1:1.5～2。例如具体可以是1:1.76。

32、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应，还需添加乙酸钠和乙酸。

33、所述4-羧基苯肼盐酸盐和乙酸钠的物质的量之比为1:2.5～3.0。例如具体可以是约1:2.75。

34、所述4-羧基苯肼盐酸盐的物质的量和乙酸的体积比为0.6～1mmol/ml。例如具体可以是0.81～0.95mmol/ml。

35、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应，在保护气氛中进行。例如具体可以在持续的氩气流中进行。

36、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应，温度为100～150℃。例如具体可以是约130℃。

37、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应，时长为5～10h。例如具体可以是约7h。

38、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应，在搅拌状态下进行。所述搅拌的速度等不进行严格限制，只要可以实现传质即可。

39、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，还包括在和所述克酮酸反应前，纯化所述中间产物。所述纯化的方式包括萃取。所述萃取采用的萃取剂包括二氯甲烷。所述萃取的o/a比约为1:3。所述纯化还包括去除所得负载有机相中的萃取剂；具体去除方法包括旋蒸和干燥。

40、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物，颜色为橙色；和/或，常温(约25℃)下的状态为固态。

41、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的反应，产率≥84％，例如具体可以是约84.5％。

42、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物和所述克酮酸的摩尔比为1.8～2.2:1。例如具体可以是2.0～2.1:1。

43、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物和所述克酮酸的反应，采用的溶剂包括正丁醇和甲苯。其中正丁醇和甲苯的体积比为1:0.8～1.2。例如具体可以是约1:1。本步骤反应中，所述克酮酸的物质的量和所述溶剂的体积比为0.3～0.5mmol/ml(0.3～0.5mmol/ml)。例如具体可以是0.35～0.45mmol/ml，进一步具体的可以是约0.4mmol/ml。

44、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物和所述克酮酸的反应，在保护气氛中进行。例如具体可以在持续的氩气流中进行。

45、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物和所述克酮酸的反应，温度为40～60℃。例如具体可以是约50℃。

46、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物和所述克酮酸的反应，时长为15～25h。例如具体可以是约20h。

47、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，所述中间产物和所述克酮酸的反应，在搅拌状态下进行。所述搅拌的速度等不进行严格限制，只要可以实现传质即可。

48、根据本发明的一些实施例，步骤d1中，还包括纯化所述克酮酸菁染料。所述克酮酸菁染料的纯化方式包括依次进行的冷却、固液分离和干燥。其中冷却包括依次进行的冷却至室温，和冷却静置。所述冷却静置的温度为-25～-10℃。例如具体可以是约-20℃。所述冷却静置的时长为8～15h，例如具体可以是约10h。所述冷却静置中，还包括添加乙醚。

49、根据本发明的一些实施例，所述克酮酸菁染料的颜色为墨绿色；和/或，其在常温下的状态为固态。

50、根据本发明的一些实施例，所述中间产物和所述克酮酸的反应，产率≥45％。例如具体可以是约48％。

51、根据克酮酸菁染料的结构式可知，克酮酸菁染料由中心克酮酸和对称性侧链组成，具有典型的给电子-吸电子-给电子(d-a-d)结构特点。

52、进一步结合克酮酸菁染料的结构式可知，步骤d2中，所述克酮酸菁染料和聚乙二醇发生酰胺缩合反应，制得的是一种聚合物染料，且酰胺缩合反应对反应条件的要求较为温和。

53、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述克酮酸菁染料和聚乙二醇的物质的量之比约为2:1。由此可实现克酮酸菁染料上部分(约为一半)羧基和聚乙二醇反应，由此保留了所述克酮酸菁染料的疏水性，通过聚乙二醇的引入，还引入了部分亲水性，最终所得croc-peg同时具有亲水性和疏水性。

54、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述酰胺缩合反应中，还需要添加edc.hcl和hobt。所述克酮酸菁染料和所述edc.hcl的摩尔比为1:3～4；例如具体可以是约1:3.5。所述克酮酸菁染料和所述hobt的摩尔比为1:3～4；例如具体可以是约1:3.5。

55、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述酰胺缩合反应中，在溶剂中进行。所述酰胺缩合反应的溶剂包括无水dmf。所述酰胺缩合反应中，所述克酮酸菁染料物质的量和溶剂体积的比例为0.05～1mmol/l。例如具体可以是约0.07mmol/l

56、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述酰胺缩合反应，在保护气氛中进行，例如具体可以是在氩气流中进行。

57、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述酰胺缩合反应，温度为30～40℃。例如具体可以是约35℃。

58、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述酰胺缩合反应，时长为60～80h。例如具体可以是约72h。

59、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，还包括纯化所述croc-peg。此处纯化的操作和步骤d1中，所述克酮酸菁的纯化操作类似。

60、根据本发明的一些实施例，步骤d2中，所述酰胺缩合反应，产率≥75％。例如具体可以是约77％。

61、根据本发明的一些实施例，步骤s1中，所述croc-peg的颜色为黄绿色；和/或，其在常温下的状态为固态。

62、根据本发明的一些实施例，步骤s1中，所述分散液a的浓度为3.5～4.5mmol/ml。例如具体可以是3.9～4mmol/ml。

63、根据本发明的一些实施例，步骤s1中，所述分散液b的浓度为0.5～1mmol/ml。例如具体可以是0.7～0.75mmol/ml。

64、根据本发明的一些实施例，步骤s2中，所述分散液a和所述水的体积比为1:8～9。例如具体可以是约1:8.5。

65、根据本发明的一些实施例，步骤s2中，所述混合的时长为25～35min。例如具体可以是约30min。所述混合在超声条件下进行。

66、根据本发明的一些实施例，步骤s2中，包括先将所述分散液b滴加至水中，之后向所得混合物中滴加所述分散液a。croc-peg可溶于水，而十二羰基三铁不溶于水，如此设置可使croc-peg和十二羰基三铁充分接触混合，提升组装、包裹的均匀性。

67、步骤s2中，所述分散液b的滴加速度不进行严格限制，只要可以充分混合即可。

68、步骤s2中，所述分散液a的滴加速度为0.8～1.2ml/min。例如具体可以是约1ml/min。由此可为croc-peg和十二羰基三铁的混合、组装提供充分的时间。

69、步骤s2在超声条件下进行。

70、根据本发明的一些实施例，步骤s3中，所述滤膜的孔径约为0.22μm。具体可以是依次通过0.8μm、0.45μm和0.22μm的滤膜。由此降低过滤的难度，避免过多不溶物对滤膜孔径的堵塞。

71、根据本发明的一些实施例，步骤s3中，所述超滤浓缩所用超滤离心管的分子截止重量为10千道尔顿。

72、若无特殊说明，所述制备方法中，物料的添加顺序不进行限定，实际生产中可以直接进行混合、混溶或混合分散。

73、根据本发明第三方面的实施例，提供了一种所述纳米颗粒在制备治疗心血管疾病、败血症、休克、急性肺、肾和肝损伤、微生物感染、关节炎及癌症药物中的应用。

74、由于所述应用采用了上述实施例的纳米颗粒的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。

75、若无特殊说明，本发明的“约”实际表示的含义是允许误差在±2％的范围内，例如约100实际是100±2％×100。

76、若无特殊说明，本发明中的“在……之间”包含本数，例如“在2～3之间”包括端点值2和3。

77、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。