一种靶向线粒体调控巨噬细胞M2型极化的纳米药物及其制备方法与应用

本发明涉及治疗类风湿性关节炎的纳米药物材料，尤其涉及一种靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物及其制备方法与应用。

背景技术：

1、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，ra）是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的慢性、全身性的自身免疫性疾病，是临床常见的风湿免疫性疾病之一，可发生于任何年龄段。根据先前的流行病学调查显示，ra的发病率在全球范围内达到0.5-1.0%。若不对其进行及时有效的干预，会极易导致关节畸形和关节功能的丧失，严重情况下可伴发关节外的系统受累，具有较高的致残率，严重威胁着患者的健康。

2、巨噬细胞在ra的病理生理反应中起着至关重要的作用。巨噬细胞的功能具有很强的异质性和可塑性，根据其表面分子的表达、细胞因子的分泌等特点，可以将巨噬细胞分为m1型和m2型。 m1型巨噬细胞是经典活化型巨噬细胞，可分泌多种促炎性细胞因子，促进炎症的发展, 加速细胞外基质降解和细胞凋亡；而m2型巨噬细胞是选择活化型巨噬细胞，高表达抗炎细胞因子，发挥抗炎作用。巨噬细胞对不同的微环境信号刺激表现出明显的异质性。而ra患者表现出了明显的炎症反应，说明滑膜内的巨噬细胞主要呈现出促炎性的极化表型，即m1巨噬细胞占据了主导地位。

3、最近的研究发现，巨噬细胞极化可能与线粒体的功能、稳定性以及活性氧（ros）的产生等因素相关。当巨噬细胞受到外界环境的刺激后，细胞内的线粒体中的氧化磷酸化的过程会受到调整，从而促进细胞释放抑炎因子，促进巨噬细胞向m2表型极化。由于线粒体还是细胞内ros的主要来源场所，线粒体ros的水平也会影响巨噬细胞的表型。正常情况下，细胞中的电子传递到线粒体后会进一步进行氧化磷酸化形成atp，若进入的电子过多，超出了电子传递链的承受范围，多余的电子就会直接与氧结合，进而形成氧自由基。氧自由基是一种能量较高的物质，很容易与细胞中的蛋白质或者dna反应，从而引起线粒体内dna损伤。目前研究表明，在脂多糖（lps）或者细菌的刺激下，巨噬细胞内的tlr4通路会被激活，诱导产生过量的ros，活性氧和一氧化氮产生协同效应，激活缺氧诱导因子(hif-1)，促进巨噬细胞分泌促炎细胞因子并向m1型极化。相对的，当线粒体内的ros水平下降，则巨噬细胞会表现出向m2表型极化的趋势。

4、目前ra的治疗手段主要是外科治疗和药物干预。但是，ra往往表现为多个关节的慢性炎症，单一的手术治疗难以从根本上解决这种全身性炎症的发展。因此，药物干预治疗仍然是目前治疗ra的主要方法。另外，纳米材料在ra治疗的研究中越发耀眼。首先，纳米材料可以作为一种优秀的药物载体，通过高效靶向的方法提高药物的作用效果，减少副作用的发生。纳米材料可以凭借其纳米级别的大小通过被动靶向选择性的积聚在发生炎症的关节组织中，提高了给药的效果。另外，由于炎症微环境中ph，酶等成分与正常组织微环境有所不同，纳米材料也可以根据这些特点进行设计，从而靶向进入到炎症微环境，并在微环境的作用下释放装载的药物或者发挥纳米材料本身的治疗效果。

5、光热疗法（ptt）是一种利用光热转换剂吸收特定波长的光之后，通过非辐射衰减的方式将吸收的能量转化为热量，使周围环境温度升高，对细胞造成不可逆转的损伤；因此，光热疗法也可以通过杀死炎症部位的炎症细胞来减轻炎症反应；近年来，各种光热剂已被证明能产生良好的光热效应用于风湿性关节炎的治疗；此外，ptt可加速抗ra药物在关节炎关节的释放，增强对ra的治疗效果；ptt可精确控制激光照射位置、激光波长、照射时间、光强等参数，具有较高的选择性。

技术实现思路

1、本发明解决的问题在于提供一种靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物及其制备方法与应用，克服抗炎药物长期使用的副作用，提高抗炎药物的治疗效果，提供一种靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物；所述纳米药物递送系统利用目前较为成熟的多孔材料为主要载体，将抗炎药物装载到多孔材料中；同时，利用叶酸（fa）以及4-羧丁基三苯基溴化膦（tpp）修饰的天然多酚与高价态金属离子发生络合反应形成金属-多酚网格结构（mpn）对装载了抗炎药物的多孔材料进行封装制得；叶酸能够被活化的巨噬细胞表达的叶酸受体识别，从而将纳米系统吞噬入胞内；另外，三苯基溴化膦携带的正电荷可以与线粒体膜发生静电吸附，进而使纳米药物从胞质中到达巨噬细胞的线粒体部位；而mpn具有光热作用可以引发m1型巨噬细胞凋亡；该药物递送系统所装载的抗炎药物能在线粒体原位释放出来，进而清除过量产生的ros；随着ros的减少，剩余的m1巨噬细胞能够重新极化成m2巨噬细胞，进而转为释放抗炎细胞因子，起到减轻ra炎症反应的作用。

2、本发明的目的是提供所述靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物的制备方法。

3、本发明另一目的是提供所述靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物在治疗类风湿性关节炎中的应用。

4、为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

5、一种靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物，所述纳米药物递送系统利用目前较为成熟的多孔材料为主要载体，将抗炎药物装载到多孔材料中；同时，利用叶酸（fa）以及4-羧丁基三苯基溴化膦（tpp）修饰的天然多酚与高价态金属离子发生络合反应形成金属-多酚网格结构（mpn）对装载了抗炎药物的多孔材料进行封装制得。

6、进一步的，所述多孔材料包括中空介孔二氧化硅（hmsns）、介孔二氧化锰（mno2）、介孔碳纳米球（mcs）、介孔氧化铝、介孔硅酸钙纳米材料（mcsn）、多孔纳米片等；优选的，使用的多孔材料是中空介孔二氧化硅（hmsns）。

7、更进一步的，所述抗炎药物包括具有多酚结构的表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）、甲氨蝶呤（mtx）、阿司匹林、布洛芬、来氟米特、羟氯喹等。优选地抗炎药物使用的是表没食子儿茶素没食子酸酯（egcg）。

8、进一步的，所述mpn中使用的天然多酚包括单宁酸、鞣花酸、表没食子儿茶素、没食子酸酯、没食子酸和花青素等。优选地，mpn薄膜中使用的天然多酚是单宁酸。

9、进一步的，所述mpn的高价态金属离子包括铁、钙、铝、钒、铬、锰、铜、锌等金属离子；优选的，mpn薄膜的高价态金属离子是铁离子。

10、一种靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物的制备方法，具体包括以下步骤：

11、s1、将叶酸（100mg,0.2mmol）溶于dmso，然后加入edc·hcl（57.5mg,0.3mmol）与nhs（34.5mg,0.3mmol），加热至45℃活化6h，随后加入氨基化的单宁酸（taa）（1.0g），氮气保护的条件下搅拌反应12小时；反应结束后用去离子水透析除去反应物，得到taa-fa溶液；

12、s2、将4-羧丁基三苯基溴化膦（tpp）（100mg,0.2mmol）溶于mes缓冲液（ph5.2）；将nhs（34.5mg,0.3mmol）与氨基化的单宁酸（1.0g）溶解在去离子水中，加入到上述缓冲溶液中，最后加入edc·hcl（57.5mg,0.3mmol），氮气保护的条件下搅拌反应12小时；反应结束后用去离子水透析除去反应物，得到taa-tpp溶液。

13、s3、称取抗炎药物40mg溶解在40ml去离子水中配制成1mg/ml的溶液，然后加入120mg多孔材料，超声分散，氮气保护下搅拌12小时；产物转移至离心管，10000rpm转速离心10min后用去离子水重悬保存，得到装载了抗炎药物的多孔材料；

14、s4、将s3得到的装载了抗炎药物的多孔材料分散至ta-fa与ta-tpp混合溶液（终浓度皆为2mg/ml），涡旋振荡1min，然后滴入配置好的fecl3·6h2o水溶液（2mg/ml），用tris缓冲溶液慢慢调节ph至9-10，涡旋振荡1min使封装完成；离心后用去离子水洗涤沉淀3次，得到最终的纳米药物。

15、上述靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化协同光热疗法治疗类风湿性关节炎的纳米药物的应用，该纳米药物通过靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化和mxene光热协同治疗类风湿性关节炎，实现了其靶向治疗类风湿性关节炎的效果；且该纳米药物生物相容性良好，生物安全性高，非常适合类风湿性关节炎的治疗。

16、本发明的有益效果是：该靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化的纳米药物，所述纳米药物中的叶酸能够被活化的巨噬细胞表达的叶酸受体识别，从而将纳米药物吞噬入胞内；当纳米药物进入细胞后，首先到达细胞溶酶体，在溶酶体中，由于三苯基溴化膦表现出的正电荷，使得纳米药物从溶酶体中逃逸出来到达胞质；同时，其携带的正电荷可以与线粒体膜发生静电吸附，进而从胞质中到达线粒体部位；在线粒体中，当纳米药物接收到光照射后，表面的金属-多酚网格能够将光能转换为热能，引起线粒体附近温度上升，打破稳态，进而引发细胞凋亡；部分未发生凋亡的m1细胞则保持较高的代谢活力，此时，随着线粒体内高水平ros对mpn的一个侵蚀，mpn逐步裂解，封装在多孔材料中的抗炎药物得以释放出来，与ros进行反应，从而清除多余的ros，使得线粒体微环境趋于稳定；当细胞接收到线粒体功能的恢复，ros水平显著降低，巨噬细胞就可以从促炎m1型转变为抗炎m2型；完成这一转变后，m2巨噬细胞就可以分泌抗炎细胞因子，缓解ra关节炎症；该纳米药物实现了靶向线粒体调控巨噬细胞m2型极化协同光热疗法治疗类风湿性关节炎的效果，且其相容性良好，生物安全性高，非常适合类风湿性关节炎的治疗。