过继细胞转移与溶瘤病毒组合疗法

发明领域本技术涉及癌症的组合免疫治疗方法。

背景技术：

0、发明背景

1、癌症和常规癌症治疗剂目前造成很大的社会经济负担，表现在精神/身体压力、失去生命和增加的医疗保健成本方面。常规疗法显示出一些有益的临床结果，但具有往往会降低患者的生活质量的有害副作用[1]。需要更有效的癌症疗法，其具有更少和更轻的有害副作用。

2、众所周知，免疫系统可以有效地消除恶性肿瘤，而免疫疗法代表了一种有前景的癌症替代疗法[2]。

3、免疫细胞(例如对肿瘤相关抗原(taa)具有特异性的t细胞)具有摧毁肿瘤的潜力。由于天然肿瘤细胞更新或通过施用治疗性疫苗，可以在癌症患者中诱导这些细胞。但是，当这些细胞渗入肿瘤时经常被证明是无效的，并且它们通常表现出耗尽的(exhausted)和/或功能失调的表型，并且由于肿瘤诱导的局部免疫抑制而缺乏减少或破坏肿瘤所必需的细胞溶解功能[3-5]。因此，免疫抑制性肿瘤环境仍然是阻碍常规癌症免疫治疗剂诱导的反应的重要障碍。

4、基于检查点抑制剂的疗法已被用来减轻对肿瘤浸润淋巴细胞(til)的抑制性信号传导并激活内源性抗肿瘤反应[6,7]。检查点抑制剂在临床试验中已显示出疗效，但未在所有治疗的受试者中均观察到反应[8]。检查点抑制剂治疗依赖于既有的taa特异性t细胞的活化，但一些患者没有足够的既有taa特异性t细胞以在治疗诱导的再激活后导致肿瘤完全消退[9,10]。

5、taa特异性t细胞的过继细胞转移(act)是用于治疗恶性肿瘤的检查点抑制剂疗法的优异替代方案(见综述[11])。act用从癌症患者分离并离体生长的肿瘤反应性t细胞进行。当从肿瘤施加的免疫抑制环境中移除后，这些细胞在转移回患者之前被激活并增殖至高数量。实质上，离体培养将少量具有很少或没有细胞溶解活性的功能失调的t细胞转化为数十亿个能够有效归巢和破坏同源肿瘤细胞的全功能t细胞。act的淋巴细胞来源于包括外周血单核细胞(pbmc)和til在内的一系列来源。act是灵活的，因为它可以利用通过其天然受体识别taa的淋巴细胞，或者淋巴细胞可以通过用编码taa特异性t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)的转基因转导来修饰[12,13]。

6、临床证据表明act在非实体癌(如b细胞淋巴瘤)中具有良好的抗肿瘤功效。事实上，人乳头瘤病毒反应性t细胞的输注也可以诱导hpv阳性转移性宫颈癌的消退[14]。该策略正在扩展至靶向非病毒肿瘤相关抗原，但仍有待改善以提高肿瘤浸润和实体瘤消退。

7、先前涉及act的工作已经表明，act的治愈潜力要求转移的细胞以足够的量和长期持久性渗入肿瘤才能杀死所有恶性细胞。临床证据表明，这些要求可以通过高剂量的过继转移的细胞(数十亿)来实现，这些细胞具有维持复制能力的最小分化表型[15]。但是，这两个目标相互冲突；产生高剂量的t细胞需要大量的体外扩增，这也会导致t细胞的终末分化和复制衰老[16]。实际上，常规act疗法使用终末分化的效应t细胞，并且需要对患者进行预先放疗或化疗以耗竭淋巴细胞群并允许更好地移植需要输注的数十亿细胞[17,18]。此外，需要进行il2治疗，以维持输注细胞的持久性和活化[19]。

8、最近的研究表明，较低分化的细胞(如中枢记忆t细胞)在act中显示出更好的成功率，表现在移植细胞的持久性和临床结果方面[15,20]。已经发表了一种从pbmc样品中产生taa特异性中枢记忆t细胞培养物的方法[21]，但该方案需要临床级细胞分选仪(这是劳动力密集型的和资源密集型的)以富集抗原特异性细胞(也参见美国专利申请公开号us2015/0023938)。本发明提供了一种产生抗原特异性中枢记忆t细胞的大的离体扩增的方法和一种从针对表达该抗原的肿瘤细胞的该抗原特异性中枢记忆t细胞引起侵袭性细胞溶解反应的体内方法。结合起来，这些方法构成了用于治疗癌症的过继性细胞疗法，其不需要使用细胞分选器或耗尽受试者的内源性t细胞群，因此代表了对现有疗法的显著改善。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供一种治疗哺乳动物(例如人)的癌症的方法，其包括过继性细胞转移以及随后进行的溶瘤病毒疫苗施用。在一些实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中治疗癌症的组合疗法，其包括(i)将肿瘤抗原特异性中枢记忆t(tcm)细胞过继细胞转移到受试者中，然后(ii)用表达被过继细胞转移(act)t细胞靶向的相同抗原的重组溶瘤病毒(ov)疫苗接种受试者，以诱导癌症破坏和消除。在优选的实施方案中，对act t细胞进行遗传修饰以表达对肿瘤抗原特异的一种或多种重组t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，act t细胞是源自待治疗受试者的自体t细胞。优选地，该组合疗法不包括受试者被免疫耗竭(immunodepleted)的步骤。

2、本文描述的方法可用于治疗哺乳动物的癌症。本文所用的术语“癌症”包括任何癌症，包括但不限于黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤、癌、脑癌(例如神经胶质瘤)、乳腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、前列腺癌和白血病。在一些方面，所述癌症是实体瘤。在其他方面，癌症是转移癌。

3、本文所使用的术语“哺乳动物”是指人类以及非人类哺乳动物，术语“过继性细胞转移”意在包括通过离体培养从外周血或肿瘤组织样本中提取的淋巴细胞而产生的细胞产物的输注。

4、在一个实施方案中，提供了产生肿瘤抗原特异性中枢记忆cd8+t细胞的方法，其包括离体细胞培养步骤，该步骤包括在存在肿瘤抗原、抗原呈递细胞(如树突细胞)、il21、il15和雷帕霉素并且优选不存在il12的条件下，培养来自pbmc或til的淋巴细胞。优选地，在培养之前从pbmc中除去cd25+细胞(调节性t细胞和活化的t细胞和b细胞)。肿瘤抗原可以是例如肿瘤相关抗原(taa)，它是肿瘤细胞中产生的在哺乳动物中引发免疫应答的物质。在一些实施方案中，肿瘤抗原是自身抗原。在其他实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原，其对于该肿瘤是独特的并且不在正常细胞中表达或在正常细胞中以非常低的量表达(例如新生抗原(neo-antigen))。

5、在相关实施方案中，肿瘤抗原是组织特异性肿瘤抗原，与正常细胞相比，其在癌细胞中具有更高的表达，其非限制性实例包括酪氨酸酶、mart-1、gp100、trp-1/gp75和trp-2蛋白。在其他实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性共有抗原，其在肿瘤和睾丸中表达但在其他正常组织中不表达或以非常少的量表达(肿瘤睾丸抗原或ct抗原)，其非限制性实例包括bage、camel、mage-a1和ny-eso-1。在其他实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤特异性独特抗原(新生抗原)，其仅在肿瘤细胞中表达，其非限制性实例包括cdk4、连环蛋白、半胱天冬酶-8、mum-1、mum-2、mum-3、mart-2、os-9、p14arf、gas7、gapdh、sirt2、gpnmb、snrp116、rbaf600、snrpd1、prdx5、clpp、ppp1r3b、ef2、actn4、me1、nf-yc、hla-a2、hsp70-2和kiaa1440。在其他实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过表达的过表达肿瘤抗原。肿瘤相关抗原的实例包括癌胚抗原(如甲胎蛋白(afp)和癌胚抗原(cea))、表面糖蛋白(如ca 125)、癌基因(如her2)、黑素瘤相关抗原(如多巴色素互变异构酶(dct)、gp100和mart1)、肿瘤睾丸抗原(如mage蛋白和ny-eso1)、病毒癌基因(如hpv e6和e7)、在肿瘤中异位表达且通常限于胚胎或胚外组织的蛋白(如plac1)。如本领域技术人员将理解的，可以基于使用本发明方法治疗的癌症类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适合用于治疗某些癌症。例如，对于黑素瘤的治疗，可以使用黑素瘤相关抗原(如dct)。

6、在一些优选的实施方案中，为了产生肿瘤抗原(例如taa)特异性cd8+t细胞，本方法包括对离体培养的细胞(例如从受试者获得的自体pbmc或具有与受试者组织相容性表型的pbmc)进行遗传修饰以表达一种或多种重组tcr或car以赋予肿瘤抗原特异性。在存在肿瘤抗原、抗原呈递细胞(如树突细胞)、il21、il15和雷帕霉素的条件下离体培养转导的细胞。car是由抗体衍生的胞外单链可变片段(scfv)与抗原识别部分和胞内t细胞激活结构域组成的融合蛋白。重组tcr包含α链和β链，并且可以识别例如hla-a2/肽复合物。细胞可以用携带支持所选的tcr/car表达的转基因盒的载体(如慢病毒载体或逆转录病毒载体)转导。将转基因盒引入载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。通常，修饰载体以表达tcr/car。在这方面，使用公认的重组技术将编码所选择的tcr/car的核酸序列引入所选择的载体中。在一些实施方案中，tcr或car特异于mart-1、gp100、ny-eso-1或mage家族的成员(例如mage-a3)。有利的是，通过本文描述的方法产生的肿瘤抗原(例如taa)特异性cd8+t细胞不需要纯化(或进一步富集)，例如在扩增(例如用抗cd3抗体、抗cd28抗体和il2进行快速扩增)前使用四聚体标记和临床级分选器。因此，在优选的实施方案中，提供了过继细胞转移的方法，包括(i)在存在肿瘤抗原负载的抗原呈递细胞(apc，例如自体树突细胞)、il21、il15和雷帕霉素并且优选不存在il12的情况下，培养从患有癌症的受试者获得的pbmc或til，以产生富含肿瘤抗原特异性cd8+t细胞的细胞群，(ii)用抗cd3抗体、抗cd28抗体和il2扩增肿瘤抗原特异性cd8+t细胞，和(iii)将细胞重新引入该受试者，其中该方法不包括在步骤(i)和(ii)之间进行纯化(或进一步富集)t细胞的步骤，例如分选四聚体+细胞。

7、在优选的实施方案中，来自pbmc或til的淋巴细胞在存在肿瘤抗原、apc(例如树突细胞)、il21、il15和雷帕霉素且优选不存在il12的条件下离体培养约1至约4周，例如，约一周、约两周、约三周、约四周或其间的任何范围，可在之后在存在il21、il15和雷帕霉素而不存在肿瘤抗原和抗原呈递细胞的情况下，培养约1周至约2周、约1周或约2周。在一个特别优选的实施方案中，在存在肿瘤抗原肽负载的树突细胞、il21、il15和雷帕霉素的情况下，将来自pbmc的淋巴细胞离体培养约2周，并在存在il21、il15和雷帕霉素且不存在肿瘤抗原肽负载的树突状细胞的情况下培养约1周。有利的是，可以将根据本文所述方法产生的肿瘤抗原特异性cd8+t细胞引入哺乳动物中，而不需要淋巴细胞耗竭(lymphodepletion)，并且不需要向受试者施用il-2。因此，在一些实施方案中，提供了过继细胞转移的方法，其包括(i)在存在肿瘤抗原、抗原呈递细胞(如树突细胞)、il21、il15和雷帕霉素的情况下离体培养来自pbmc或til的淋巴细胞以及(ii)将所产生的肿瘤抗原(例如taa)特异性cd8+t细胞施用至哺乳动物，而不通过化疗或放疗方法破坏该哺乳动物中的现有淋巴细胞(淋巴细胞耗竭或淋巴细胞清除(lymphoablation))，并且不向受试者施用il-2。

8、根据本文所述的组合疗法，在过继转移肿瘤抗原特异性cd8+t细胞后，将表达肿瘤抗原的溶瘤病毒施用于受试者。肿瘤抗原特异性cd8+t细胞的过继转移可以通过任何合适的方法完成，包括本文所述的方法和美国专利申请公开号us2015/0023938中描述的方法，其内容通过引用并入本文。

9、在一些实施方案中，所述组合疗法包括(i)在存在载有肿瘤抗原肽的抗原呈递细胞(apc)和il21的条件下离体培养来自患有肿瘤的受试者的tils，在培养物中扩增所述细胞并将它们重新引入受试者，以及(ii)向受试者施用表达相同肿瘤抗原的溶瘤病毒。

10、在其他实施方案中，所述组合疗法包括(i)在存在载有肿瘤抗原肽的apc、il21、il15和雷帕霉素的条件下离体培养来自患有肿瘤的受试者的tils，在培养物中扩增所述细胞并将它们重新引入受试者，以及(ii)向受试者施用表达相同肿瘤抗原的溶瘤病毒。

11、在其他实施方案中，所述组合疗法包括(i)在存在载有肿瘤抗原肽的apc和il21的条件下离体培养来自受试者的pbmc，在培养物中扩增所述细胞并将它们重新引入受试者中，以及(ii)向受试者施用表达相同肿瘤抗原的溶瘤病毒。

12、在其他实施方案中，所述组合疗法包括(i)在存在载有肿瘤抗原肽的apc、il21、il15和雷帕霉素的条件下离体培养来自受试者的pbmc，在培养物中扩增所述细胞并将它们重新引入受试者体内，以及(ii)向受试者施用表达相同肿瘤抗原的溶瘤病毒。

13、在相关实施方案中，在离体培养之前，用对所述肿瘤抗原特异的重组tcr或car转导pbmc。

14、在一些实施方案中，在转移肿瘤抗原特异性cd8+t细胞约8至72小时后，将表达所述肿瘤抗原的溶瘤病毒施用于哺乳动物。在优选的实施方案中，在转移肿瘤抗原特异性cd8+t细胞约12至48小时后、约20至28小时后、或约24小时后，将表达所述肿瘤抗原的溶瘤病毒施用至受试者。

15、表达肿瘤抗原的任何具有复制能力的溶瘤病毒都可根据本文所述的组合疗法施用。在一些优选的实施方案中，复制型溶瘤病毒是弹状病毒，例如vsv或maraba弹状病毒，其优选包含一种或多种遗传修饰以增加病毒对癌细胞的选择性。

16、复制型溶瘤病毒疫苗可以通过一种或多种途径给药。在一些实施方案中，复制型溶瘤病毒是弹状病毒，并通过静脉内途径给予哺乳动物。在其他实施方案中，复制型溶瘤病毒是痘苗病毒(vaccinia virus)，并且通过静脉内(iv)、肌肉内(im)、腹膜内(ip)或肿瘤内(it)途径给予哺乳动物。如本领域技术人员所理解的，复制型溶瘤病毒(例如弹状病毒或痘苗病毒)将在合适的载体(例如盐水或其他药学上合适的缓冲液)中施用。