本发明属于生物，涉及一种外泌体富集支架的制备方法及其应用。
背景技术：
1、皮肤创面的再生修复仍然是一个挑战。伤口愈合是一个复杂的生物学过程，包括出血、炎症、增殖和重塑，受到各种细胞、细胞因子和细胞外基质(ecm)的影响。大量研究表明，人脐带间充质干细胞(huc-msc)具有促进组织修复的潜力，包括皮肤、肌肉和骨骼。旁分泌效应已成为这些细胞生物活性的主流理论，它是通过外泌体(exosomes)介导的，外泌体是一种由脂质双层膜包裹的亚细胞结构，大小从40nm到160nm，由大多数细胞类型释放。这些外泌体由多种生物分子组成，如蛋白质、脂质、dna、mrna和mirna，对细胞分化、增殖、血管生成、应激反应和免疫信号传导至关重要。越来越多的证据表明，间充质干细胞来源的外泌体具有加速伤口愈合的再生潜力。这些外泌体通过诱导表观遗传改变影响受体细胞，正向调节其生理状态，促进增殖或抑制凋亡，从而导致组织修复和再生。然而，由于外泌体在体内的快速清除导致生物活性降低，且分离方法复杂，成本高且耗时，因此其临床应用仍然具有挑战性。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的技术问题，提供了以下的技术方案：
2、本发明提供了一种外泌体富集支架的制备方法，所述制备方法包括对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架。
3、进一步，所述制备方法包括如下步骤：
4、1)壳聚糖溶于弱酸中，混匀，使其充分溶解；
5、2)-20℃冷冻3小时，通过-80℃下冷冻干燥24小时，得到壳聚糖-海绵复合多孔支架；
6、3)对壳聚糖-海绵复合多孔支架进行10min-30min恒温干燥热改性，所述恒温温度为160℃-180℃，获得最终产物酸不溶性支架。
7、术语“热改性”是指使用环境温度对复合支架进行改造的过程，特指的，环境温度为高于常温的温度，“热改性”后支架的表面性质发生改变。
8、在一些实施方案中，所述恒温干燥热改性的过程持续10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min。在一些实施方案中，所述恒温温度的范围包括160℃、161℃、162℃、163℃、164℃、165℃、166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃、174℃、175℃、176℃、177℃、178℃、179℃、180℃。
9、进一步，所述步骤1)中弱酸包括乙酸、碳酸、亚硝酸、次氯酸。
10、进一步，所述步骤1)中弱酸为乙酸。
11、进一步，所述步骤1)中乙酸为1％v/v。
12、进一步，所述步骤1)中壳聚糖溶液终浓度为1％-3％。
13、在一些实施方案中，所述壳聚糖溶液终浓度为1％、1.5％、2％、2.5％、3％。
14、进一步，所述步骤1)中混匀包括搅拌混匀、震荡混匀，所述混匀时间为3h。
15、进一步，所述步骤3)中干燥包括鼓风干燥。
16、进一步，所述外泌体包括干细胞外泌体。
17、进一步，所述外泌体包括间充质干细胞外泌体。
18、进一步，所述外泌体包括细菌产生的外泌体。
19、进一步，所述外泌体包括体细胞产生的外泌体。
20、术语“外泌体”是指由体内几乎所有细胞类型分泌的内吞衍生的纳米囊泡。外泌体或外泌体样囊泡包括蛋白质、核酸(尤其是mirna)和脂质。在实践中，可以根据本领域技术人员已知的任何合适的方法，或由其改进的方法，分离和/或纯化外泌体或外泌体样囊泡。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为干细胞，更具体地，所述细胞为间充质干细胞。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为体细胞。在某些具体的实施方案中，所述分泌外泌体的细胞为细菌。
21、术语“支架”是指可用于将目标载荷或任何其它化合物(例如，aso)在ev(细胞外囊泡，例如，外泌体)的腔表面上或外表面上锚定至ev的分子。在某些方面中，支架包含合成分子。在一些方面中，支架包含非多肽部分。在其它方面中，支架包含天然存在于ev中的脂质、碳水化合物或蛋白质。在一些方面中，支架包含不天然存在于ev中的脂质、碳水化合物或蛋白质。可用于实施例中的其它支架的非限制性实例包括：氨基肽酶n(cd13)；脑啡肽酶，aka膜金属内肽酶(mme)；外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成员1(enpp1)；神经纤毛蛋白-1(nrp1)；cd9、cd63、cd81、pdgfr、gpi锚蛋白、乳凝集素(mfge8)、lamp2和lamp2b。
22、术语“壳聚糖”是指由氨基葡萄糖(脱乙酰单位)和n-乙酰葡糖胺(乙酰单位)随机分布，并透过β-(1-4)糖苷键组合而成的线性多糖。壳聚糖通过壳多糖的脱乙酰化来制备。术语“壳聚糖”涉及壳聚糖、壳聚糖衍生物以及壳聚糖与壳聚糖衍生物的混合物。
23、本发明提供了一种根据前面所述的制备方法制备的外泌体富集支架。
24、在一些实施方案中，所述富集是指从大量母体物质中搜集欲测定的痕量元素至一较小体积，从而提高其含量至测定下限以上的这一操作步骤。试样中含量少于0.01％的痕量物质，如果它的含量低于分析方法的测定下限，就必须采用预富集的方法。在一个具体的实施方案中，所述富集的目的物为外泌体。
25、本发明提供了一种富集外泌体的方法，所述方法如下的步骤：
26、1)将外泌体溶液与mes缓冲液以1:4的比例进行混合，调整ph值，然后添加前面所述的外泌体富集支架，冰上混匀，得到结合到外泌体富集支架上的外泌体；2)使用碱性溶液洗涤释放外泌体富集支架上的外泌体，得到外泌体富集产物。
27、进一步，所述ph值包括5.8-6.2。
28、在一些具体的实施方案中，所述ph值调整到5.8、5.85、5.9、5.95、6.0、6.05、6.1、6.15、6.2。
29、进一步，所述冰上混匀时间为30min，混匀方式为震荡混匀。
30、进一步，所述碱性溶液包括磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸铵、磷酸二氢铵、和/或磷酸氢二铵配制的溶液。
31、进一步，所述碱性溶液为nahco3溶液。
32、进一步，所述nahco3溶液ph值包括8.0-10.6。
33、在一些实施方案中，所述碱性溶液nahco3溶液ph值包括8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6。
34、进一步，所述mes缓冲液ph值为6.0。
35、进一步，所述mes缓冲液浓度为100mm。
36、进一步，所述外泌体溶液还包括初步除杂的步骤。
37、进一步，所述初步除杂的步骤包括：对外泌体溶液使用过滤器去除死细胞与细胞碎片。
38、进一步，过滤器包括直径为0.2μm的过滤器。
39、术语“过滤器”是指在过滤过程中能够通过外泌体，但阻挡死细胞或细胞碎片或其他大体积物质的过滤器。
40、进一步，所述富集外泌体的方法的步骤可不断重复进行。
41、在一些实施方案中，所述富集外泌体的方法可在同一含有外泌体溶液中不断富集外泌体，也可将多份不同来源的外泌体溶液中的外泌体富集到一起。在一个具体的实施方案中，所述富集外泌体的方法包括如下步骤：1)对外泌体溶液使用过滤器去除死细胞与细胞碎片。2)将过滤溶液与mes缓冲液(ph＝6.0)按1:4的比例混合，将ph值调整为5.8-6.2。然后将t-cs支架加入混合物中，放在冰上摇晃30min。3)将与外泌体结合的t-cs直接用于动物实验、分析、冷冻干燥或经nahco3(ph＝8.0-10.6)洗涤后释放的外泌体收集。
42、术语“碱性溶液”意味着在常温状态下ph大于7.0的溶液，也可理解为溶液中氢氧根浓度大于氢离子浓度。术语“酸性溶液”意味着在常温状态下ph小于7.0的溶液，也可理解为溶液中氢离子浓度大于氢氧根浓度。
43、本发明提供了一种外泌体保存运输的方法，所述方法将前面所述富集外泌体的方法中步骤1)结合到外泌体富集支架上的外泌体整体进行冻干，然后直接室温下运输和/或储存。
44、进一步，所述冻干状态下的外泌体在室温下运输和/或储存均不损害其分子完整性。
45、术语“冻干”是指“冷冻干燥”过程，其包含使水从冷冻状态转化为气态而不经过液态。冷冻干燥过程去除含水材料中的水分，同时材料保持冷冻状态。冻干的基本过程包含以下步骤：冷冻、初级干燥(升华)和二级干燥(脱附)。首先，将溶解和/或悬浮物质在低温(例如，-60℃)下冷冻。缓慢冷冻产生更大的晶体，使升华物质逸出。一些产物形成玻璃状材料，并且在冷冻过程中可能需要退火。退火是指首先降低温度，再提高温度，然后再次降低温度，将成分锁定于原位，然后使晶体生长。冷冻时间可在1小时至24小时的范围内，具体取决于应用。在步骤2(初级干燥)中，然后经由真空提取水或稀释剂，从而产生多孔的干燥的“饼状物”。升华在真空下发生，产物温度低于其临界温度。这通常是耗时最长的过程。在初级干燥循环结束时，产物将具有3％至5％的水分含量。采用最终干燥步骤(二级干燥)来去除残留的未冷冻的水分子。该过程通过加热产物来完成。二级干燥可导致水分含量为约0.5％。
46、本发明提供了一种前面所述富集外泌体的方法制备的组合物，所述组合物包括外泌体富集支架及结合到其上的外泌体，和/或收集到的外泌体。
47、术语“组合物”是指富集到的外泌体和结合其的外泌体富集支架的组合物。组合物的物理形式不受限制。例如，术语“组合物”涵盖并公开了一种粉末，其中所述列举的物质各自以粉末形式存在。作为另一示例，术语“组合物”还涵盖并公开了一种液体溶液，其中所述列举的物质各自以可溶性形式存在。作为另一示例，术语“组合物”还涵盖并公开了一种乳液，其中存在列举的物质。作为另一示例，术语“组合物”还涵盖并公开了一种悬浮液，其中存在列举的物质。
48、本发明提供了前面所述的制备方法在制备外泌体富集支架中的应用。
49、如本文所用，术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的各个值的通常误差范围。本文中涉及的“约”某值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。
50、本发明提供了前面所述的制备方法、前面所述的外泌体富集支架、前面所述富集外泌体的方法、前面所述的组合物在制备产品中的应用。
51、进一步，所述产品包括创口修复产品、脑损伤治疗产品、组织再生产品、组织重建产品、抑制炎症产品、免疫调节产品、旁分泌调控产品、毛囊再生产品、促进细胞增殖产品、促进细胞迁移产品、促进细胞管状结构形成产品、促进血管化产品。
52、如本文使用的术语“一个”、“一种”和“该”包括单数指代和复数指代，除非上下文另外明确指明。术语“基本上由......组成”用于定义包括所列举要素但排除其他要素的脂质组合物，即，该术语脂质组合物用于限定基本上仅由脂质组成的组合物。“由......组成”因而意指排除其他要素的超过痕量的要素。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案在本发明的范围内。
53、本发明提供了前面所述的制备方法、前面所述的外泌体富集支架、前面所述富集外泌体的方法在制备富集外泌体的系统或装置中的应用。
54、本发明中所使用的术语“系统”指具有将多台计算机、多个硬件、装置等经由例如网络等通信介质(包括以一对一的方式建立的通信连接)彼此相连的构造的系统，或指由一台计算机、一个硬件、一个装置等来实现的系统。另外，术语“系统”不限于多个组件或特定实施例。例如，一种系统可以在一个或多个印刷电路板或其他基板上实现，并且可以具有可移动或静态的组件。尽管以下描述和示例使用术语“系统”来描述本发明的各个方面，但是术语“系统”不限于对象的特定配置，类型或数量。
55、本发明提供了一种外泌体富集的系统或装置，所述系统包括前面所述的制备方法、前面所述富集外泌体的方法，所述制备方法或方法由计算机存储程序自动执行。
56、进一步，所述计算机存储程序自动执行通过操作装置进行，所述操作装置包括存储器和处理器。
57、进一步，所述存储器中存储有计算机程序。
58、术语“存储器”指代任何类型的长期、短期、易失性、非易失性或其它存储器，且不应限于任何特定类型的存储器或任何特定数目的存储器或存储存储器的媒体的类型。术语“存储器”可以是任何合适的存储器元件(例如，随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、可擦除可编程rom(eprom)、电可擦除可编程rom(eeprom)、专用集成电路(asic)等)、软件、硬件、固件、或者在适当的情况下并基于特定需要的任何其他合适的组件、设备、元件或对象。
59、术语“处理器”是指任何类型的处理器，诸如微处理器、嵌入式处理器、数字信号处理器(dsp)、网络处理器、或用于执行代码的其他设备，可以包括多于一个处理器，例如多核设计或每个处理器具有多核设计的多个处理器。处理器可以被配置成执行计算机程序指令的序列，例如存储在存储器中的那些指令的序列，以执行根据本发明的内容的示例性实施方式的各种操作、处理和方法。
60、在本说明书和所附权利要求书全文中，除非上下文另外要求，否则词语“包含”以及变化形式如“包含的”应理解为暗示包括陈述的整体或步骤或者整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或者整体或步骤的组。例如，包括一系列元素的组合物、混合物、过程、方法、物品或装置不一定仅限于那些元素，而是可以包括未明确列出的或这样的组合物、混合物、过程、方法、物品装置固有的其他元素。
61、本发明的优点和有益效果：
62、本发明建立了一种简单有效的利用壳聚糖在不同ph值下富集外泌体的方法。开发的方法允许通过生物活性海绵支架自动捕获和释放外泌体。体外和体内研究表明，外泌体通过促进细胞增殖、迁移和管状结构形成，抑制炎症，促进血管化和促进毛囊再生来促进再生愈合。