Ptprj激动剂在制备预防和/或治疗肾脏纤维化的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种医药领域，具体涉及ptprj激动剂在制备预防和/或治疗肾脏纤维化的药物中的应用。

背景技术：

1、慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，ckd)是一种以渐进性和不可逆的肾功能丧失或持续性肾损害为特征的长期疾病[1]。预计到2040年，它将成为全球第五大死因。ckd高发病率、高死亡率的特点已使其成为全球性的公共卫生问题。无论是何种病因导致的ckd，其共同的病理表现都是肾脏纤维化。它的特点是过度产生/沉积的细胞外基质(extracellular matrix，ecm)[2]，导致组织重塑和肾实质瘢痕形成。在此过程中，成纤维细胞的增殖和活化，是肾纤维化的明确效应和驱动因素[3]。ckd的病理生理机制较为复杂，临床上也缺乏有效且特异的防治手段。因此，深入探讨肾脏纤维化背后的分子机制，寻找有效靶点，是延缓肾脏病慢性进展、阻断肾脏纤维化的关键所在。

2、蛋白酪氨酸磷酸酶受体j(protein tyrosine phosphatase receptor j,ptprj)是一种220kda的跨膜蛋白，属于受体型蛋白酪氨酸磷酸酶家族，参与多种信号通路[4]。ptprj在造血细胞、内皮细胞、成纤维细胞、甲状腺细胞和乳腺细胞等多种细胞类型中均有表达。其结构由单个胞内催化ptp结构域、跨膜结构域和由9个纤连蛋白iii型重复序列组成的胞外结构域组成，通过去磷酸化或者参与其他蛋白酪氨酸激酶去磷酸化，从而调节多种细胞过程，包括细胞生长、分化、有丝分裂和致癌转化[5-7]。研究发现：纤维化涉及多条途径，pdgf信号转导是其中的中心介质之一。ptprj既可以下调pdgfrβ磷酸化水平，对细胞增殖和迁移也有负向调控作用[8-10]。ptprj在肾脏纤维化中的作用尚不明确。

3、gj103是一种通读化合物，cas号为1459687-89-8，结构式为：

4、

5、gj103可以诱导过早终止密码子的通读，在无义突变引起的遗传病中具有研究潜力。作为gj072类似物，gj103在具有纯合tga突变和纯合taa突变的at153la细胞中可诱导atm激酶活性。目前gj103在肾脏疾病中暂无研究。

6、参考文献如下：

7、1.zhong,j.,h.c.yang,and a.b.fogo,a perspective on chronic kidneydisease progression.am j physiol renal physiol,2017.312(3):p.f375-f384.

8、2.bulow,r.d.and p.boor,extracellular matrix in kidney fibrosis:morethan just ascaffold.j histochem cytochem,2019.67(9):p.643-661.

9、3.falke l l,gholizadeh s,goldschmeding r,et al.diverse origins of themyofibroblast-implications for kidney fibrosis[j].nat rev nephrol,2015,11(4):233-244.

10、4.keane m m,lowrey g a,ettenberg s a,et al.the protein tyrosinephosphatase dep-1is induced during differentiation and inhibits growth ofbreast cancer cells[j].cancer res,1996,56(18):4236-4243.

11、5.grazia lampugnani,m.,et al.,contact inhibition of vegf-inducedproliferation requires vascular endothelial cadherin,beta-catenin,and thephosphatase dep-1/cd148.jcell biol,2003.161(4):p.793-804.

12、6.schwarz,m.,et al.,disrupting ptprj transmembrane-mediatedoligomerization counteracts oncogenic receptor tyrosine kinase flt3 itd.frontoncol,2022.12:p.1017947.

13、7.hendriks,w.,et al.,proteinaceous regulators and inhibitors ofprotein tyrosine phosphatases.molecules,2018.23(2).

14、8.sala m,spensiero a,scala mc,et al.design,synthesis,biologicalactivity,and structural analysis of lactam-constrained ptprj agonistpeptides.chemmedchem 2018；13:1673-1680.

15、9.buhl em,djudjaj s,klinkhammer bm,et al.dysregulated mesenchymalpdgfr-beta drives kidney fibrosis.embo mol med 2020；12:e11021.

16、10.chen yt,chang fc,wu cf,et al.platelet-derived growth factorreceptor signaling activates pericyte-myofibroblast transition in obstructiveand post-ischemic kidney fibrosis.kidney international 2011；80:1170-1181.

技术实现思路

1、发明目的：本发明的目的是提出ptprj激动剂gj103在制备预防和/或治疗肾脏纤维化的药物中的应用，为gj103提供了一种新的制药用途，同时，为慢性肾脏疾病提供一种新的治疗策略。

2、本技术揭示了主动上调ptprj可明显抑制tgf-β1引起的成纤维细胞的增殖与活化，而敲除ptprj则加重uuo引起的肾脏纤维化病变以及促进成纤维细胞的激活。作为ptprj小分子激动剂，gj103治疗不仅明显抑制了tgf-β1诱导的肾脏成纤维细胞激活，也显著改善了梗阻和缺血引起的肾组织病理损害和减少细胞外基质的沉积。

3、具体地，本技术首先发现了ptprj在ckd患者肾组织中的表达及定位，通过免疫组化发现：ptprj在正ptprj常肾组织中表达水平较低，但在ckd患者的肾小管和间质中表达显著升高。进一步通过ptprj和fsp1的双重染色也证实了间质中其表达增加。开展体内外实验探讨ptprj在ckd中的潜在功能，我们在体外培养的大鼠成纤维细胞(nrk49f)中过表达ptprj，显著抑制tgf-β1诱导的collagen i、collagen iii的mrna表达和fn1、vimentin的蛋白表达，同时也抑制了成纤维细胞活化指标α-sma的表达。通过构建ptprj杂合子敲除鼠，更深入明确ptprj在ckd中的功能。qrt-pcr分析显示，ptprj敲低可加重细胞外基质成分fn1的沉积，western blot显示检测fn1、collagen i和collagen iii蛋白表达也明显增加。在uuo小鼠中，ptprj敲低后，以α-sma高度表达为特征的成纤维细胞的增殖和活化能力也随之升高。同样我们发现：与对照组相比，ptprj敲低使纤维化病变的肾脏中pdgfrβ磷酸化水平升高，这表明ptprj可能通过pdgfrβ调节肾脏纤维化。

4、上述数据提示我们靶向ptprj在ckd分子干预机制中具有治疗潜力。因此，我们通过分子对接筛选有效的ptprj激活剂，并通过检测ptprj对pdgfrβ的去磷酸化活性进一步筛选对接得分较高的小分子激动剂。首先用10个小分子刺激nrk49f细胞后，我们发现as252424和gj103显著抑制了pdgfrβ的磷酸化水平，与tgf-β1共同刺激后，也促进了pdgfrβ的去磷酸化。接着通过体外对pdgfrβ去磷酸化，我们发现gj103能更好地激活ptprj。最后利用表面等离子体共振(spr)定量分析发现：gj103与ptprj重组蛋白具有较高的亲和力。

5、为进一步验证gj103在ckd肾纤维化中的保护作用，我们用5、10、20、40μm不同浓度的gj103预处理nrk49f细胞2h后，tgf-β1刺激nrk49f细胞。实验结果表明，当gj103浓度高于20μm时，pdgfrβ的磷酸化水平被显著抑制。随着p-pdgfrβ表达的降低，纤维化标志物fn1的蛋白水平也进一步下降。随后在动物模型中验证gj103的功能。研究结果表明：gj103高剂量(30mg/kg/天)可以明显改善uuo和uiri诱导的肾纤维化。主要表现为：肾间质胶原沉积和细胞外基质减少以及成纤维细胞的激活被抑制。在uuo和uiri模型中，治疗剂量的gj103对肾、肝、心或全身没有明显毒性。

6、综上结果表明，gj103及其钠盐在制备用于预防和/或治疗慢性肾脏疾病的药物中具有巨大潜力，可以有效地减轻慢性肾脏疾病导致的肾纤维化。