一种疫霉菌产孢的培养方法

本申请属于真菌培养，具体涉及一种疫霉菌产孢的培养方法。

背景技术：

1、由烟草疫霉菌(phytophthora nicotianaebreda dehaan)引起的烟草黑胫病是一种毁灭性世界病害。1896年van breda de haan在印度尼西亚的爪哇首次发现，此后该病流行蔓延迅速，1922年便成为美国的佛罗里达、堪萨斯州烟区的严重病害。1924年后，该病己遍布于全世界温带、亚热带和热带地区烟田，平均发病率为5％～12％，严重田块发病率高达75％，甚至造成绝收。烟草疫霉的寄主范围很广，可以侵害数百种植物，病害通常在潮湿、多雨条件下发病重，潜育期短，可多次再侵染，传播与蔓延迅速，常造成寄主植物成片死亡。该病属于维管束系统性病害，一旦发生就很难控制，对烟草威胁极大，并常与其他烟草根茎部病害混合发生，给病害的诊断造成困难，而生产上则常因不明发病原因，难以有针对性的防治措施，故造成更为严重危害。因此建立烟草疫霉菌快速培养体系获得烟草疫霉菌孢子囊和游动孢子，有助于科研人员早日攻克该病害，对预测病害发生情况、采取有效的防治措施控制病原菌的传播和流行、减少经济损失都具有重要的理论和实际意义。

2、目前现有技术中常见的获得烟草疫霉菌孢子囊和游动孢子的方法主要是培养诱导法和新鲜寄主植物材料诱导法。培养诱导法利用燕麦平板培养菌丝、0.1％kno3溶液浸润，可以诱导烟草疫霉产生游动孢子囊但对于不同来源的菌株，诱导后低温处理释放游动孢子的差异较大，有些菌株甚至不释放游动孢子。还可以采取：烟草疫霉在燕麦培养基上生长菌丝后，滴加土壤浸出液的皮氏培养液诱导产生游动孢子囊，经低温处理后，再适温培养、产生大量游动孢子，但是由于土壤浸出液未经严格灭菌、皮氏培养液湿热灭菌，诱导产生游动孢子囊的效果不稳定、也容易污染。而新鲜寄主植物材料诱导法则是将活化好的疫霉菌接种到新鲜寄主植物的子叶或果实中，培养一段时间后即可诱导产生孢子囊，经低温处理后产生游动孢子。该方法所需要的时间虽然短，但是更容易遭受细菌的污染，而且合适的植物材料亦较难获得。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新型的疫霉菌产孢的培养方法，该培养方法全程花费时间短，方法简便易操作，不易有污染，还有成本低的优势，可用于烟草疫霉菌致病力测定，烟草黑胫病生防资源筛选及烟草品种对烟草疫霉菌的抗病性鉴定等研究。

2、为了达到上述目的，本发明提出了了以下技术方案：

3、本发明提供了一种疫霉菌产孢的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：

4、(1)活化疫霉菌：将疫霉菌接种于v8培养基上进行活化培养得到活化的疫霉菌；

5、在本发明中，所述步骤(1)中活化培养的温度为25℃，所述活化培养的环境为黑暗培养，所述活化培养的时间为5～7d；

6、在本发明中，所述疫霉菌的来源优选包括低温保存的疫霉菌和从病株上分离得到的疫霉菌；

7、(2)制备产疫霉菌孢子囊的诱导液：高温灭菌基质，灭菌结束后使用无菌水稀释基质得到基质溶液，浸提基质溶液，浸提操作结束后过滤基质溶液，待过滤液中无固态杂质后灭菌得到诱导液；

8、在本发明中，所述步骤(2)中的基质由烟草漂浮育苗基质和土壤组成；

9、所述烟草漂浮育苗基质和土壤的体积与质量比为3：1；

10、所述高温灭菌的温度为121℃，高温灭菌的时间为2h；

11、在本发明中，所述步骤(2)中的基质溶液的体积浓度为26.67％～33.33％；进一步的，所述基质溶液的体积浓度为30％，在实际操作中，本发明将80ml经过灭菌的基质与200～220ml无菌水混合得到基质溶液；

12、在本发明中，所述步骤(2)中的诱导液的体积浓度为30％；

13、在本发明中，所述步骤(2)中的浸提的温度为28℃，浸提的环境为黑暗环境，浸提的时间为16～24h，浸提时的转速为180rpm；

14、在本发明中，所述步骤(2)中的灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为1h；

15、具体的，本发明将基质溶液装于250ml三角瓶中，28℃、180rpm黑暗震荡16～24h进行浸提，双层纱布过滤，滤液用抽真空泵过滤2～3遍，过滤器中铺单层无菌滤纸，直至浸提液中无基质固态杂质得到过滤液，过滤液分装入250ml三角瓶中，50ml/瓶，121℃高压灭菌60min，放凉后备用即为诱导液；

16、(3)诱导产生孢子囊：取步骤(1)提供的活化的疫霉菌菌块接种于步骤(2)提供的诱导液中进行诱导，诱导产生孢子囊；

17、在本发明中，所述步骤(3)中的诱导的温度为28℃，诱导的环境为黑暗环境，诱导时的转速为180rpm，诱导的时间为1～3d；

18、具体的，本发明优选使用用1ml无菌枪头上端在步骤(1)提供的经过活化的疫霉菌菌落边缘打取直径8mm菌块30块，接种到步骤(2)提供的诱导液中，28℃、180rpm黑暗震荡培养1～3d，即可诱导产生大量的孢子囊；在实际操作中，经过诱导后在10倍镜下观察，一个视野中孢子囊数量为68±15.50个；

19、(4)孢子囊释放游动孢子：取步骤(3)经过诱导的疫霉菌进行再培养即可释放出大量的游动孢子；

20、在本发明中，所述步骤(4)中的再培养的温度为28℃，再培养的环境为黑暗环境，再培养时为静置培养，再培养的时间为1～3d；具体的孢子囊释放游动孢子的方法为：将步骤(3)经过诱导的疫霉菌在28℃的黑暗条件下继续静置培养1～3d，即可释放出大量的游动孢子，游动孢子的浓度约3.08×108个/ml。

21、在本发明中，所述疫霉菌包括烟草疫霉菌和樟疫霉。

22、上述培养方法的流程图如图1所示。

23、本发明提供的培养方法的优势如下：

24、(1)用时短：本发明在菌株活化好后，3～6d就可完成烟草疫霉菌孢子囊诱导及游动孢子释放过程，现用技术需10～14d；

25、(2)成本低：本发明使用的烟草漂浮育苗专用基质为标准号为(yc/t310-2009)的基质25000g，约20000ml，仅需25～30元，而常用的培养液v8不仅不易获得而且价格昂贵每340ml约20.8元；

26、(3)孢子囊和游动孢子产量大，孢子囊释放游动孢子彻底：本发明提供的培养方法培养结束后，孢子囊数量约为68±15.50个(10倍镜下)，释放游动孢子浓度为3.08×108个/ml；常规培养方法培养结束后，10倍镜下，一个视野中孢子囊数量仅为8±1.00个，释放游动孢子浓度为1.09×107个/ml；而且游动孢子诱导结束后，本发明观察到孢子囊基本空壳，而实验室所用的常规培养方法中仍有孢子囊未释放游动孢子。

27、(4)诱导液可长期保存备用：本发明提供的诱导液经可室温保存备用，即用即取，大大简化了诱导液的制备流程。

技术特征：

1.一种疫霉菌产孢的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化培养的温度为25℃，所述活化培养的环境为黑暗培养，所述活化培养的时间为5～7d。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的基质由烟草漂浮育苗基质和土壤组成；

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的基质溶液的体积浓度为26.67％～33.33％。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的诱导液的体积浓度为30％。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的浸提的温度为28℃，浸提的环境为黑暗环境，浸提的时间为16～24h，浸提时的转速为180rpm。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的灭菌的温度为121℃，灭菌的时间为1h。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的诱导的温度为28℃，诱导的环境为黑暗环境，诱导时的转速为180rpm，诱导的时间为1～3d。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(4)中的再培养的温度为28℃，再培养的环境为黑暗环境，再培养时为静置培养，再培养的时间为1～3d。

10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述疫霉菌包括烟草疫霉菌和樟疫霉。

技术总结
本申请属于真菌培养技术领域，具体涉及一种疫霉菌产孢的培养方法。本方法包括烟草疫霉菌的活化、制备产生孢子囊的诱导液、诱导产生孢子囊和释放游动孢子。本发明成本低、方法简便、快速、无污染，可用于烟草疫霉菌致病力测定，烟草黑胫病生防资源筛选及烟草品种对烟草疫霉菌的抗病性鉴定等研究。

技术研发人员：邱睿,李小杰,宋鹏宇,李彩虹,刘畅,张梦丹,张盈盈,李淑君
受保护的技术使用者：河南省农业科学院烟草研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17