一种新型透明质酸酶的酶法制备特定分子量透明质酸的方法、透明质酸酶和应用

本发明属于生物化工，涉及特定分子量透明质酸制备，尤其是一种新型透明质酸酶的酶法制备特定分子量透明质酸的方法、透明质酸酶和应用。

背景技术：

1、透明质酸(hyaluronic acid)是一种酸性粘多糖，在脊椎动物和一些荚膜细菌中较为常见，因其具有高度粘弹性、持水保湿的作用，可将其运用在医疗、生物、食品、化妆品等生活中常见的领域中。但是不同分子量的透明质酸展现出不同的生物学活性。有研究表明高分子量透明质酸主要用于眼科手术、关节腔内注射等，但是在肿瘤相关运用方面高分子量透明质酸会促进肿瘤细胞向其他脏器的转移，而中低分子量透明质酸很好的抑制了肿瘤的生长。一般称10-50kda的ha为低分子量透明质酸，低分子量透明质酸由于其有较高的保湿性和润滑性，在医疗运用方面发挥很大的作用：中分子量透明质酸可以用在药物缓解方面，广泛用在滴眼液、化妆品、皮肤烧伤愈合及术后防粘连；小分子透明质酸可刺激主动脉及毛细血管血管内皮细胞的增生与迁移达到促进新生血管的生成的作用、低分子量ha能够渗透到真皮层，清除氧自由基，保护肉芽组织免受氧自由基的破坏，同时可促进炎症因子的表达，进而促进血管的生成达到实现促进伤口愈合的目的。目前可以通过加热、机械剪切、紫外线、超声波等物理方法；水解和氧化降解等化学方法实现不同低分子量透明质酸的制备。物理方法降解时随着透明质酸的分子量降低，机械的剪切作用会使透明质酸分子量的下降变慢；通过加热也会导致溶液变黄使得后续产品的处理变得困难；化学方法通过加酸、加碱、氧化剂等化学法得到低分子量透明质酸，但是这样会使得后续试剂中残留有有毒化学试剂；据cn107200789a利用均质机控制不同压力和循环次数可以改变透明质酸分子量，该方法避免了效率会逐渐降低，溶液变黄及其他物理降解方法一些负面影响，但是均质机只能采用1-2mg/ml的透明质酸底物，过高和过低的浓度都会导致操作不便或仪器的破坏。cn 104059166a一种从透明质酸发酵液制备寡聚透明质酸的方法报道了一种通过醇沉、脱水、复溶、过滤后，滤液进行碱降解至一定分子量的透明质酸，该方法可以直接用透明质酸发酵液进行降解，但是大量的乙醇用来醇沉使其不适合高粘度，高表达量的透明质酸；本发明可以通过加入酶液制备低分子量透明质酸，酶法反应具有温和、专一性强、产物单一无其他有毒害副产物等优点。据cn 104178539 a一种规模化制备特定分子量小分子透明质酸报道了用透明质酸酶降解高分子量透明质酸得到特定分子量透明质酸，避免了物理化学等方法降解对产物的影响，但是其方法在降解得到4000da的透明质酸时需要在45℃700rpm的高速搅拌及12.5h的长时间反应，这极大地增加了仪器的投入成本。本发明通过在高浓度高分子量透明质酸中添加委内瑞拉来源的透明质酸酶的方法来降解ha，在37℃200rpm的易得反应条件下反应较短的时间不但可以得到低分子量透明质酸与透明质酸寡糖；还可以通过控制添加的酶液及反应的时间得到特定分子量的透明质酸。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种新型透明质酸酶的酶法制备特定分子量透明质酸的方法、透明质酸酶和应用。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

3、一种新型透明质酸酶编码基因rs20745，所述基因rs20745来源于委内瑞拉链霉菌streptomyces venezuelaeatcc 10712sequence id:cp029197.1，其基因序列为seq idno.1，其氨基酸序列为seq id no.2。

4、如上所述的基因rs20745编码的透明质酸酶。

5、进一步地，所述透明质酸酶具有32.4kda的分子量，属于透明质酸裂解酶类。

6、一株高产透明质酸酶的链霉菌工程菌株，所述工程菌株应用链霉菌高拷贝载体pkc1139载体，应用了gapdh启动子驱动透明质酸酶编码基因rs20745的表达，用xlnc信号肽控制成熟透明质酸酶的分泌，以变铅青链霉菌(streptomyces lividans tk24)作为底盘细胞；

7、其中，所述gapdh启动子来自于迟缓埃格特菌(eggerthella lenta)甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，其核苷酸序列为seq id no.3；所述xlnc信号肽来自于s.lividans中的木聚糖酶c(xylanase c)，其核苷酸序列为seq id no.4。

8、如上所述的高产透明质酸酶的工程菌株生产制备得到的透明质酸酶。

9、利用如上所述的链霉菌工程菌株制备透明质酸酶的方法，包括如下步骤：

10、将构建好的链霉菌工程菌株在ms固体培养基上养孢5天后，洗下孢子接入种子培养基，28℃、200rpm发酵培养，种子液发酵48h后，以2％接种量转接至发酵培养基发酵3.5天，取发酵上清液，得到透明质酸粗酶液；

11、其中，ms培养基配方为：现磨豆粉20g/l、甘露醇20g/l；

12、种子培养基tsb的配方为：酪蛋白蛋白胨17g/l、大豆蛋白胨3g/l、nacl：5g/l，k2hpo4：2.5g/l，葡萄糖：2.5g/l；

13、发酵培养基yeme的配方为：酵母提取物3g/l、胰蛋白胨5g/l、麦芽提取物3g/l、蔗糖340g/l；使用前再向其中加入质量浓度50％葡萄糖20ml/l。

14、如上所述的透明质酸酶在酶切制备特定分子量透明质酸方面中的应用。

15、利用如上所述的透明质酸酶酶切制备特定分子量透明质酸的方法：包括如下步骤：

16、将大分子量透明质酸的水溶液与透明质酸酶溶液混合，37℃条件下，控制酶活在0-200u/ml及反应时间1-3h后加热煮沸5min终止反应，得到1.5kda-2500kda分子量的透明质酸。

17、进一步地，在反应1h后200u/ml酶活的反应体系得到了4.5kda分子量的透明质酸，100u/ml酶活的反应体系得到了40kda分子量的透明质酸，50u/ml酶活的反应体系得到了90kda分子量的透明质酸，40u/ml酶活的反应体系得到了160kda分子量的透明质酸，20u/ml酶活的反应体系得到了337kda分子量的透明质酸；而在反应3h后，200u/ml酶活的反应体系得到了1.5kda分子量的透明质酸，100u/ml酶活的反应体系得到了5.5kda分子量的透明质酸，50u/ml酶活的反应体系得到了59kda分子量的透明质酸，40u/ml酶活的反应体系得到了84kda分子量的透明质酸，20u/ml酶活的反应体系得到了169kda分子量的透明质酸。

18、进一步地，所述1.5kda-2500kda分子量的透明质酸还经过提取操作，具体的操作步骤如下：

19、将透明质酸加入三倍体积的无水乙醇，把不同分子量的透明质酸进行沉降提取，将沉淀的样品用去离子水溶解后过超滤装置，去除蛋白和核酸等杂质，将样品进行旋转蒸发浓缩后，放入真空冷冻干燥机冷冻干燥，得到特定分子量透明质酸干粉。

20、本发明取得的优点和积极效果为：

21、1、本发明运用链霉菌中发酵生产的透明质酸酶与透明质酸通过控制反应体系中酶活终浓度放入37℃恒温摇床反应，在反应不同的时间之后得到特定分子量的透明质酸，本发明相较于其他得到特定分子量透明质酸的方法具有操作简便，常温常压下即可发生反应的优势，其次只需要将高分子量透明质酸加入水中进行溶解，不需要任何其他缓冲液，在酶解反应过程中不需要加入任何盐离子及有机试剂，不会对环境造成污染。而且在反应后的产物易于纯化。基于以上分析，该发明在制备特定分子量透明质酸时具有非常广泛的应用价值。

22、2、本发明采用新发现的委内瑞拉来源的透明质酸酶，以水为反应介质，酶解高分子量透明质酸，实现了制备特定分子量透明质酸，适合工业化生产应用。

23、3、本发明所采用的新型透明质酸酶是通过委内瑞拉来源的透明质酸酶在变铅青链霉菌中进行异源表达，发酵完取发酵液上清即可用于酶切大分子量透明质酸，不用进行细胞破碎等纯化提取，节约了操作工序。