一种提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法

本发明涉及微生物学，尤其是提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法。

背景技术：

1、质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区dna原有的能够自主复制的较小的dna分子，常用作将目的dna片段送进受体细胞中去进行繁殖和表达的载体工具。而大肠杆菌是领域内最普遍使用的受体细胞。大肠杆菌结构简单，发酵周期短，且遗传背景较为清晰。为实现目的产物的大量生产，一方面需要利用分子生物学技术使外源基因成功表达；另一方面，则必须实现重组菌的高密度发酵。高密度发酵可提高菌体的发酵密度进而大幅度提高产量，降低生产成本。

2、然而，在现有的发酵过程中，通常采用的补料策略有反馈补料法、恒ph补料法、恒溶氧补料法、恒比生长速率补料法与指数流加法等方法，但这些补料策略在产业化也就是放大的过程中，当放大到一定程度后，往往会出现发酵水平不稳定、导致发酵后质粒产量偏低等现象。

3、可见，现有的大肠杆菌发酵过程中，通常的补料方法在产业化的过程中会出现发酵水平不稳定、发酵后质粒产量偏低的技术问题。

4、因此筛选一种既适合大肠杆菌菌体生长又能有利于提高质粒产量的发酵方法十分必要。

技术实现思路

1、本申请的目的在于提供一种提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，旨在解决上述现有技术中的问题。

2、一种提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，包括以下步骤：

3、s1、将甘油保存的大肠杆菌接种入种子培养基中进行种子活化；所述种子培养基包括：酵母粉15-25g/l，甘油3-5g/l，mgso4·7h2o0.5-0.7g/l，kh2po4 2-4g/l，k2hpo4 10-15g/l，柠檬酸钠0.5-1.5g/l，硫酸铵4-6g/l；

4、s2、将活化后的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到含目的质粒的发酵液；所述发酵培养基包括：酵母粉20-30g/l，甘油10-20g/l，mgso4·7h2o 0.5-0.7g/l，kh2po4 2-4g/l，k2hpo4

5、10-15g/l，柠檬酸钠0.5-1.5g/l，硫酸铵4-6g/l，消泡剂0.1-0.3g/l。

6、进一步地，步骤s1中，种子活化步骤的培养温度为35-37℃，控制摇床转速200-220rpm，培养时间为10-12h。

7、进一步地，步骤s2中，发酵培养步骤的培养温度为30-37℃，搅拌速度为200-900rpm，通气量为1.2-2.0vvm，培养时间为20-28h。

8、进一步地，步骤s2中，还包括在发酵过程中加入补料培养基进行补料的步骤，所述补料培养基包括：补料a：酵母粉100-200g/l，mgso4·7h2o 10-15g/l，消泡剂0.1-0.3g/l；补料b：甘油400-600g/l。

9、进一步地，补料a为30-40ml/l/h的匀速补料，补料b为变速补料，控制起始补料速率为15-30ml/l/h，之后每2小时加快2-3ml/l/h。

10、本发明的有益效果是：本发明培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，仅利用现有技术中常规的大肠杆菌为发酵菌株，并通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了大肠杆菌的菌量，同时在无需对菌株进行基因工程改造的情况下，有效提高了发酵液中目的质粒的含量。

11、本发明所述方法在现有种子培养基的基础上，使用接近发酵培养基的配方进行种子液培养，有助于提高发酵菌株的发酵活力，使得大肠杆菌在后续发酵过程中获得更高的菌种密度，并累计更多的目标产物，所得目标产物的发酵量与现有技术基因工程菌的发酵量近似甚至更高。

技术特征：

1.一种提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，其特征在于，步骤s1中，种子活化步骤的培养温度为35-37℃，控制摇床转速200-220rpm，培养时间为10-12h。

3.根据权利要求1所述的提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，其特征在于，步骤s2中，发酵培养步骤的培养温度为30-37℃，搅拌速度为200-900rpm，通气量为1.2-2.0vvm，培养时间为20-28h。

4.根据权利要求1所述的提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，其特征在于，步骤s2中，还包括在发酵过程中加入补料培养基进行补料的步骤，所述补料培养基包括：补料a：酵母粉100-200g/l，mgso4·7h2o 10-15g/l，消泡剂0.1-0.3g/l；补料b：甘油400-600g/l。

5.根据权利要求4所述的提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法，其特征在于，补料a为30-40ml/l/h的匀速补料，补料b为变速补料，控制起始补料速率为15-30ml/l/h，之后每2小时加快2-3ml/l/h。

技术总结
本发明属于微生物学领域，一种提高质粒产量的大肠杆菌发酵方法包括：将用于种子活化的种子培养基：酵母粉，甘油，MgSO4·7H2O，KH2PO4，K2HPO4，柠檬酸钠，硫酸铵；用于发酵培养的发酵培养基：20‑30g/L酵母粉，甘油，MgSO4·7H2O，KH2PO4，K2HPO4，柠檬酸钠，硫酸铵，消泡剂。本发明培养大肠杆菌发酵生产质粒的方法，仅利用现有技术中常规的大肠杆菌为发酵菌株，并通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了大肠杆菌的菌量，同时在无需对菌株进行基因工程改造的情况下，有效提高了发酵液中目的质粒的含量。

技术研发人员：夏宇辰,王海啸,余涛
受保护的技术使用者：浙江大学绍兴研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17