一种石莼多糖裂解酶及其编码基因、发酵方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种石莼多糖裂解酶及其编码基因、发酵方法和应用。

背景技术：

1、多糖裂解酶（polysaccharide lyase，pl）主要作用于阴离子多糖，通过β消除机制降解糖苷键，形成在232 nm处有吸收的c4-c5双键不饱和寡糖。石莼多糖裂解酶作为一种重要的海藻工具酶，是多糖裂解酶的一种，定向断裂3-硫酸鼠李糖与葡萄糖醛酸或3-硫酸鼠李糖与艾杜糖醛酸之间的糖苷键，生成含有不饱和己糖醛酸残基和新的还原端的二糖、三糖、四糖等小分子石莼寡糖结构单元。研究表明，石莼寡糖具有溶解度好、生物利用度高、抗凝血、抗肿瘤、免疫调节等多种生理活性，在保健食品、医药领域、化工领域具有重要的应用价值。

2、酶法降解是制备石莼寡糖的主要方法之一，具有反应高效温和、产物结构均一、活性基团保持良好、底物专一性好、能耗低且无污染等优势。在cazy数据库中，石莼多糖裂解酶根据降解特性和氨基酸序列相似性分为五个家族：pl24、pl25、pl28、pl37和pl40。综合cazy数据库收录和已经报道过的石莼多糖裂解酶的基因信息，目前仅有17条序列被表征，重组表达的石莼多糖裂解酶数量总体较少。因此，有必要挖掘新的石莼多糖裂解酶基因并实现工程化重组表达，扩充石莼多糖裂解酶家族的数量，并为石莼多糖的开发利用及特征性石莼寡糖的制备奠定重要的基础。

3、酶的异源表达及高密度发酵是提高酶活力及催化效率的重要技术手段。枯草芽孢杆菌是工业应用中的一种“明星微生物”，被美国食品药品监督管理局（fda）评为生物安全（generally regarded as safe，gras）菌株，具有培养条件简单、代谢机理明确、生长特点鲜明等特性。目前关于石莼多糖裂解酶的异源表达及发酵工艺研究均是在大肠杆菌进行，未见通过枯草芽孢杆菌发酵及制备石莼多糖裂解酶的相关报道。

技术实现思路

1、本发明提供了一种石莼多糖裂解酶及其编码基因、发酵方法和应用。本发明通过目的基因克隆、重组质粒构建及基因工程菌构建，获得高产石莼多糖裂解酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，其中石莼多糖裂解酶的酶活力高达801 u/ml，其属于pl24家族，是新型的石莼多糖裂解酶，具有优良的酶学性质，在石莼多糖的开发利用及特征性石莼寡糖的制备方面应用前景广阔。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种石莼多糖裂解酶，其具有下列氨基酸序列之一：

4、（1）如seq id no.1所示的氨基酸序列；

5、（2）由seq id no.1所示的氨基酸序列经一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加，且具有与seq id no.1所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

6、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的适宜反应温度为25℃~37℃。

7、进一步的，所述石莼多糖裂解酶在37℃以下具有良好的温度稳定性。

8、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的适宜反应ph为7.0~8.0。

9、进一步的，所述石莼多糖裂解酶在ph 6.0~8.0具有良好的ph稳定性。

10、本发明还提供了所述的石莼多糖裂解酶的编码基因，其具有下列核苷酸序列之一：

11、（1）如seq id no.2所示的核苷酸序列；

12、（2）与seq id no.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与seq id no.1所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

13、本发明还提供了一种用于检测或鉴定所述的编码基因的引物对，其核苷酸序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。

14、本发明还提供了含有所述的编码基因的重组载体。

15、进一步的，所述重组载体为枯草芽孢杆菌表达载体pp43nmk。

16、本发明还提供了一种胞外分泌石莼多糖裂解酶的基因工程菌，其含有所述的编码基因。

17、进一步的，所述基因工程菌选用的是枯草芽孢杆菌wb800。

18、本发明还提供了一种胞外分泌发酵石莼多糖裂解酶的方法，其包括以下步骤：

19、（1）根据如seq id no.2所示的核苷酸序列，设计引物并克隆获得石莼多糖裂解酶的编码基因；

20、（2）对载体进行酶切，将所述编码基因和酶切后载体进行连接并转化至感受态细胞，经筛选和测序后，获得含有石莼多糖裂解酶编码基因的重组载体；

21、（3）将所述重组载体转化至枯草芽孢杆菌感受态细胞中，获得含有石莼多糖裂解酶编码基因的基因工程菌；

22、（4）将所述基因工程菌先后接种到种子培养基、发酵培养基中培养，获得发酵液，离心收集上清液，获得石莼多糖裂解酶。

23、进一步的，所述步骤（4）中基因工程菌在种子培养基中的培养条件为：温度35℃~37℃、转速180~200 rpm、时间10~12 h；基因工程菌在发酵培养基中的培养条件为：温度35℃~37℃、时间20~28 h。

24、进一步的，按重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：酵母膏2.2%~2.4%，蛋白胨1%~1.2%，甘油0.4%~0.6%，葡萄糖0.4%~0.6%，蔗糖0.2%~0.4%，氯化钠0.6%~0.8%，磷酸二氢钾0.2%~0.25%，磷酸氢二钾0.9%~1%，硫酸镁0.03%~0.05%，柠檬酸铁铵0.12%~0.15%，氯化锌0.03%~0.05%，氯化钙0.02%~0.04%。

25、优选的按重量百分比计，所述发酵培养基的配方为：酵母膏2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，葡萄糖0.5%，蔗糖0.2%，氯化钠0.6%，磷酸二氢钾0.22%，磷酸氢二钾0.92%，硫酸镁0.03%，柠檬酸铁铵0.12%，氯化锌0.04%，氯化钙0.04%。

26、进一步的，所述粗酶液的酶活力大于720 u/ml。

27、本发明还提供了所述的石莼多糖裂解酶在制备石莼寡糖中的应用。

28、进一步的，所述石莼多糖裂解酶的酶液用量为石莼多糖溶液的10%~20%，酶解时间不少于2 h。

29、进一步的，所述石莼多糖裂解酶制备得到的石莼寡糖分子量小于3000 da。

30、与现有技术对比，本发明的优点和有益效果：

31、本发明通过氨基酸序列的分析与基因的特异性克隆，获得石莼多糖裂解酶编码基因，该基因全长1986 bp，编码661个氨基酸，为石莼多糖裂解酶uly。所述的石莼多糖裂解酶属于pl24家族，其氨基酸序列与已报道的石莼多糖裂解酶氨基酸序列相似性最高仅为66.81%，差异显著，属于一种新型的石莼多糖裂解酶。

32、本发明不仅实现了新型的石莼多糖裂解酶重组载体的构建及枯草芽孢杆菌的高效表达，还实现石莼多糖裂解酶的规模化生产，扩充石莼多糖裂解酶家族的数量。本发明提供的石莼多糖裂解酶酶活力高达801 u/ml，适宜反应温度为25℃~37℃，适宜反应ph为7.0~8.0，是一种嗜温性且ph稳定性良好的中性酶，能实现室温条件下高效催化降解石莼多糖，从而有效节省能源，具有良好的工业应用前景。