一种含多巴的重组IV型人源化胶原蛋白的纯化生产方法与流程

本发明属于蛋白工程，涉及经发酵获得的重组iv型人源化胶原蛋白粗品料液的工业化分离纯化及多巴修饰方法。

背景技术：

1、胶原蛋白(collagen)是体内含量最多的一种蛋白质，约占蛋白质总量的25％～33％，其广泛分布于机体各个组织器官，如皮肤、骨骼、角膜、血管等，尤其在人体的皮肤和结缔组织中，含有大量的胶原蛋白。胶原蛋白作为一种结缔组织的粘合物质，对维护细胞、组织、器官的正常生理功能有重要作用。重组胶原蛋白以其低毒性、低抗原性、低免疫性，能引导细胞再生以及与人体相容的优点，而广泛应用于生物医药、化妆品、食品等行业中。

2、3,4-二羟基苯丙氨酸(dopa，多巴)，是贻贝粘蛋白所具有的结构成分，是利用酪氨酸酶对酪氨酸残基的修饰作用而形成。dopa残基由于氧化反应而相互交联，导致了贻贝粘蛋白和表面纤维形成强而持久的胶接，结合能力和寿命不受水的影响，且粘附作用对人没有毒性和免疫原性，具备广泛应用前景。iv型胶原蛋白氨基酸组成中含有酪氨酸残基，因此对来源于天然iv型胶原蛋白序列结构的表达产物进行多巴修饰再加工以获取含有dopa残基的重组iv型胶原蛋白，在扩展iv型胶原蛋白应用方面具有重要的意义。

3、目前关于制备含有dopa的重组iv型胶原蛋白纯品的工艺技术鲜有报道。已有的对在其他不同来源的重组蛋白表达中进行多巴修饰或在表达后进行多巴修饰的技术(例如cn115819627a、cn115894655a)，其纯化工艺一般需要使用层析柱对修饰后的重组蛋白进行分离，不仅导致工艺复杂，而且成品的纯度低。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种含多巴的重组iv型人源化胶原蛋白的纯化生产方法，通过对毕赤酵母工程菌发酵所得料液(即发酵液)进行纯化，高效获得具有多巴基团的重组蛋白纯品。

2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

3、该胶原蛋白的纯化生产方法，包括以下步骤：

4、在用于表达重组iv型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌发酵结束后进行发酵液预处理，得到含有重组iv型胶原蛋白的中间品料液；将所述中间品料液与磷酸盐、硫酸铜、酪氨酸酶及mmc复合阳离子交换填料(预先经纯化水冲洗以去除填料保存试剂等杂质)混合后用碱(例如氢氧化钠、磷酸氢二钠)调节ph至7.4～7.8，然后利用所述酪氨酸酶于液相进行酶促反应，酶促反应结束后用酸或酸溶液调节酶促反应所得原液为酸性，使经过酶促反应修饰后的重组iv型胶原蛋白(即含多巴的重组iv型胶原蛋白)置换至mmc复合阳离子交换填料上，然后用筛网分离mmc复合阳离子交换填料；用酸溶液淋洗截留在所述筛网上的mmc复合阳离子交换填料以去除残留的酪氨酸酶及其他杂质，然后用缓冲液对置换至mmc复合阳离子交换填料上的经过酶促反应修饰后的重组iv型胶原蛋白进行洗脱，将所得洗脱液进行后处理，得到含多巴的重组iv型胶原蛋白。

5、优选的，所述预处理具体包括以下步骤：发酵结束后放罐，得到含有所述毕赤酵母工程菌及其表达所得的重组iv型胶原蛋白的发酵液，将所述发酵液依次进行固液分离(例如经高速离心机离心后去除沉淀并收集上清液)、过滤澄清(例如经膜系统过滤上述离心所得上清液，其中膜系统为0.22或0.45μm中空纤维膜过滤系统)及超滤浓缩(超滤所得截留液即为上述中间品料液)。

6、优选的，所述毕赤酵母工程菌表达的重组iv型胶原蛋白，其序列结构包括一个或多个由选取自天然iv型胶原蛋白中的肽段的序列构成的融合序列单元(例如氨基酸序列如seq.id.no.1所示的包括多个相同的融合序列单元的重组iv型人源化胶原蛋白)。

7、优选的，所述发酵具体包括以下步骤：将所述毕赤酵母基因工程菌作为一级种子在发酵罐(例如10l)中培养(培养温度为25～28℃)，将经过培养后的菌体作为二级种子接种到发酵罐(例如100l)中进行培养(培养温度为25～28℃)，并在该培养过程进行上述重组iv型胶原蛋白的分泌表达；发酵结束后即可放出发酵液(即放罐)。

8、优选的，所述预处理中，超滤浓缩采用≤6kd卷式滤膜超滤系统，超滤至截留液电导率小于0.5ms/cm(防止截留液电导率过高影响上述酶促反应的效率)。

9、优选的，所述磷酸盐为十二水合磷酸氢二钠和二水合磷酸二氢钠，所述硫酸铜、酪氨酸酶、mmc复合阳离子交换填料、十二水合磷酸氢二钠及二水合磷酸二氢钠在所述中间品料液中的添加量依次为0.01～0.02g/l(硫酸铜)、100～200u/l(酪氨酸酶)、25％～30％(mmc复合阳离子交换填料，体积比)、0.9～1.1g/l(十二水合磷酸氢二钠)及0.32～0.35g/l(二水合磷酸二氢钠)。

10、优选的，所述酶促反应的具体条件为：于22～28℃(例如室温或常温)下搅拌3～4h，搅拌转速为100～200rpm。

11、优选的，所述酸(用于调节上述酶促反应所得原液为酸性)为盐酸、硫酸、柠檬酸、冰乙酸中的一种，其中以固体颗粒形式存在的酸，如柠檬酸可以避免其他液体酸或其溶液的刺激性、挥发性造成的操作风险；所述置换具体包括以下步骤：将酶促反应所得原液用酸(例如柠檬酸)或酸溶液调节ph至3.5～4.5后继续(例如室温或常温)搅拌1～2h(搅拌过程中，在酶促反应中结合至mmc复合阳离子交换填料上的杂质，如宿主毕赤酵母自身表达的蛋白会从填料表面解吸附，而经过酶促反应修饰后的重组iv型胶原蛋白会结合至填料表面，从而完成置换)。

12、优选的，所述淋洗采用的酸溶液为ph3.5～4的乙酸溶液或ph3.5～4的柠檬酸溶液，淋洗温度为室温或常温。

13、优选的，所述柠檬酸溶液或乙酸溶液在淋洗中的用量不小于截留填料(即截留在所述筛网上的mmc复合阳离子交换填料)体积的5倍。

14、优选的，所述洗脱的具体条件为：将经置换后形成的结合有经过酶促反应修饰后的重组iv型胶原蛋白的相应填料(具体指经过上述置换及淋洗后的mmc复合阳离子交换填料)浸泡于10～15mm、ph6.5～7的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中一次以上(例如浸泡次数不少于3次且每次缓冲液用量不小于截留填料体积)，每次浸泡时间≥30min(以保证经过酶促反应修饰后的重组iv型胶原蛋白在浸泡中从填料表面充分解吸附，浸泡时间过短，则该蛋白解吸附不充分，导致收率降低)，浸泡的温度为室温或常温。

15、优选的，所述置换完成后用不小于200目的筛网过滤，从而尽可能多的分离(截留)在上述中间品料液中添加的mmc复合阳离子交换填料；所述洗脱(具体指其中的浸泡)完成后经不小于200目的筛网过滤并收集滤液，即为洗脱液，从而无需在层析柱上进行洗脱，降低工艺成本。

16、优选的，所述后处理具体包括以下步骤：将所述洗脱液超滤浓缩后进行冷冻干燥，或者将所述洗脱液超滤浓缩后依次进行内毒素去除、冷冻干燥。即后处理中超滤所得截留液直接冻干，或者经内毒素去除后再冻干。

17、优选的，所述后处理中，超滤浓缩采用≤6kd卷式滤膜超滤系统，超滤至截留液电导率小于0.1ms/cm。

18、优选的，所述后处理中，内毒素去除采用强阴离子层析柱(例如qff层析柱，预先经纯化水平衡以避免其他杂质的引入，收集穿柱料液用于上述冷冻干燥)。

19、优选的，经冷冻干燥所得冻干粉为纯度大于95％的含多巴的重组iv型胶原蛋白成品(内毒素含量小于1eu/mg)，收率大于70％(每升发酵液产量大于0.8g/l)，且多巴含量大于0.3％。

20、本发明的有益效果体现在：

21、本发明提供的胶原蛋白纯化生产方法，以毕赤酵母基因工程菌发酵液作为原料，主要采用酶促反应和复合阳离子填料对诱导表达的重组iv型胶原蛋白进行多巴修饰和捕获，并且，本发明的纯化过程中于酶促反应前用碱调节ph至7.4～7.8，使得中间品料液中的杂质与填料充分结合，实现了在酶促反应中进行纯化(并促进酶促反应，从而提高多巴修饰效果)，再经填料与修饰后的蛋白结合完成捕获后利用酸溶液淋洗就可以实现除杂(无需在层析柱上进行)，不仅纯化工艺简单，而且成品蛋白的纯度高，适于工业化生产。

22、进一步的，本发明在酶促反应后通过用酸或酸溶液调节ph至3.5～4.5，使修饰后的蛋白(例如重组iv型人源化胶原蛋白)与填料充分结合(并避免蛋白降解)，并通过控制搅拌时间，避免搅拌时间过短导致的杂质与填料解离不充分(经过酶促反应修饰后的重组iv型人源化胶原蛋白与填料结合也不充分)，从而提高成品蛋白收率等。

23、进一步的，本发明通过对洗脱液超滤浓缩后采用强阴离子层析柱进行内毒素去除，可以降低成品蛋白的内毒素含量。