一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用与流程

本发明属于生物，涉及一种干细胞无血清无饲养层培养基、制备方法及应用。

背景技术：

1、多能干细胞(pluripotency stem cell，psc)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种apsc多能细胞。维持多能干细胞多能性和自我更新并不容易，常需要多种细胞因子和化合物才能达到一定的效果。相应地，出现了多种含有这些细胞因子和化合物的培养基。传统的多能干细胞培养基往往需要引入小鼠胚胎成纤维细胞(mef)作为滋养层细胞和血清作为多能干细胞的营养成分，然而其批间差、动物源性、各类感染源性、成分不确定性等影响实验研究的判断和进一步深入地应用研究。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的技术问题，提供以下技术方案：

2、本发明第一方面提供了一种干细胞培养的体系，所述体系命名为hpsm，所述hpsm由基础培养基和培养基添加物组成，所述基础培养基命名为hpsm1，所述培养基添加物命名为hpsm2；

3、所述hpsm1包括l-丙氨酸、l-精氨酸、l-精氨酸·盐酸、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺·水、l-半胱氨酸·盐酸、l-半胱氨酸·2盐酸、l-谷氨酸、谷氨酰胺、l-组氨酸、l-羟脯氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸、谷胱甘肽、d-生物素、d-泛酸、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素b12、硫辛酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、硝酸钙、磷酸氢钠、硫酸镁、酚红、硫酸亚铁、硝酸铁、硫酸铜、硫酸锌、丙酮酸钠、葡萄糖、硫酸卡那霉素、腐胺·2盐酸、对氨基苯甲酸、亚油酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶中的至少一种；

4、所述hpsm2亚硒酸钠、维生素c、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、fgf2-g3、tgfβ3、nrg1中的至少一种。

5、进一步，所述hpsm1为l-丙氨酸、l-精氨酸、l-精氨酸·盐酸、l-天冬氨酸、l-天冬酰胺·水、l-半胱氨酸·盐酸、l-半胱氨酸·2盐酸、l-谷氨酸、谷氨酰胺、l-组氨酸、l-羟脯氨酸、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸、l-缬氨酸、谷胱甘肽、d-生物素、d-泛酸、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素b12、硫辛酸、氯化钠、氯化钾、氯化镁、磷酸二氢钠、碳酸氢钠、硝酸钙、磷酸氢钠、硫酸镁、酚红、硫酸亚铁、硝酸铁、硫酸铜、硫酸锌、丙酮酸钠、葡萄糖、硫酸卡那霉素、腐胺·2盐酸、对氨基苯甲酸、亚油酸、次黄嘌呤、胸腺嘧啶的组合。

6、进一步，所述hpsm2为亚硒酸钠、维生素c、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、fgf2-g3、tgfβ3、nrg1的组合。

7、进一步，所述hpsm1包括l-丙氨酸2.225mg/l、l-精氨酸50mg/l、l-精氨酸·盐酸94.75mg/l、l-天冬氨酸8.325mg/l、l-天冬酰胺·水16.2525mg/l、l-半胱氨酸·盐酸7.88mg/l、l-半胱氨酸·2盐酸45.5725mg/l、l-谷氨酸8.675mg/l、谷氨酰胺549.65mg/l、l-组氨酸19.375mg/l、l-羟脯氨酸23.165mg/l、l-异亮氨酸5mg/l、l-亮氨酸65.935mg/l、l-赖氨酸68.225mg/l、l-蛋氨酸92.175mg/l、l-苯丙氨酸19.87mg/l、l-脯氨酸37.99mg/l、l-丝氨酸13.625mg/l、l-苏氨酸55.525mg/l、l-色氨酸9.76mg/l、l-酪氨酸42.36mg/l、l-缬氨酸54.825mg/l、谷胱甘肽0.25mg/l、d-生物素0.05185mg/l、d-泛酸2.1825mg/l、氯化胆碱6.24mg/l、叶酸2.575mg/l、肌醇16.85mg/l、烟酰胺2.25925mg/l、吡哆醛2mg/l、吡哆醇0.2655mg/l、核黄素0.2595mg/l、盐酸硫胺2.335mg/l、维生素b12 0.34125mg/l、硫辛酸0.0525mg/l、氯化钠6599.75mg/l、氯化钾355.9mg/l、氯化镁30.515mg/l、磷酸二氢钠62.5mg/l、碳酸氢钠3000mg/l、硝酸钙25mg/l、磷酸氢钠235.51mg/l、硫酸镁61.055mg/l、酚红6.56mg/l、硫酸亚铁0.2085mg/l、硝酸铁0.005mg/l、硫酸铜0.000625mg/l、硫酸锌0.216mg/l、丙酮酸钠110mg/l、葡萄糖2500mg/l、硫酸卡那霉素100mg/l、腐胺·2盐酸0.04025mg/l、对氨基苯甲酸0.25mg/l、亚油酸0.021mg/l、次黄嘌呤1.02mg/l、胸腺嘧啶0.1825mg/l中的至少一种。

8、进一步，所述hpsm2包括亚硒酸钠14μg/l、维生素c 64mg/l、肝素钠100μg/l、胰岛素19.4mg/l、转铁蛋白10.7mg/l、fgf2-g 340μg/l、tgfβ3 0.1μg/l、nrg1 0.1μg/l中的至少一种。

9、进一步，所述hpsm1为l-丙氨酸2.225mg/l、l-精氨酸50mg/l、l-精氨酸·盐酸94.75mg/l、l-天冬氨酸8.325mg/l、l-天冬酰胺·水16.2525mg/l、l-半胱氨酸·盐酸7.88mg/l、l-半胱氨酸·2盐酸45.5725mg/l、l-谷氨酸8.675mg/l、谷氨酰胺549.65mg/l、l-组氨酸19.375mg/l、l-羟脯氨酸23.165mg/l、l-异亮氨酸5mg/l、l-亮氨酸65.935mg/l、l-赖氨酸68.225mg/l、l-蛋氨酸92.175mg/l、l-苯丙氨酸19.87mg/l、l-脯氨酸37.99mg/l、l-丝氨酸13.625mg/l、l-苏氨酸55.525mg/l、l-色氨酸9.76mg/l、l-酪氨酸42.36mg/l、l-缬氨酸54.825mg/l、谷胱甘肽0.25mg/l、d-生物素0.05185mg/l、d-泛酸2.1825mg/l、氯化胆碱6.24mg/l、叶酸2.575mg/l、肌醇16.85mg/l、烟酰胺2.25925mg/l、吡哆醛2mg/l、吡哆醇0.2655mg/l、核黄素0.2595mg/l、盐酸硫胺2.335mg/l、维生素b12 0.34125mg/l、硫辛酸0.0525mg/l、氯化钠6599.75mg/l、氯化钾355.9mg/l、氯化镁30.515mg/l、磷酸二氢钠62.5mg/l、碳酸氢钠3000mg/l、硝酸钙25mg/l、磷酸氢钠235.51mg/l、硫酸镁61.055mg/l、酚红6.56mg/l、硫酸亚铁0.2085mg/l、硝酸铁0.005mg/l、硫酸铜0.000625mg/l、硫酸锌0.216mg/l、丙酮酸钠110mg/l、葡萄糖2500mg/l、硫酸卡那霉素100mg/l、腐胺·2盐酸0.04025mg/l、对氨基苯甲酸0.25mg/l、亚油酸0.021mg/l、次黄嘌呤1.02mg/l、胸腺嘧啶0.1825mg/l的组合。

10、进一步，所述hpsm2为亚硒酸钠14μg/l、维生素c 64mg/l、肝素钠100μg/l、胰岛素19.4mg/l、转铁蛋白10.7mg/l、fgf2-g 340μg/l、tgfβ3 0.1μg/l、nrg10.1μg/l的组合。

11、进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。

12、进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。

13、在一些具体的实施方案中，所述hpsm1基础培养基包括硫辛酸、谷胱甘肽、对氨基苯甲酸。在一些更加具体的实施方案中，所述hpsm1中生物素、吡哆醇、酪氨酸和磷酸盐的浓度进行了特别的调整。在一些具体的实施方案中，为了防止细胞增殖过快导致的酸中毒，增加了碳酸氢钠的含量。

14、在一些实施方案中，所述hpsm2中组分简单明确，不含有异源蛋白质。在某些具体的实施方案中，所述hpsm2中包括亚硒酸钠、维生素c、肝素钠、胰岛素、转铁蛋白、成纤维细胞生长因子(fgf2-g3)、转化生长因子β3(tgfβ3)、神经调节蛋白1(nrg1)。在一些具体的实施方案中，为了克服多次传代后多能干细胞会出现的发散性分化的情况，引入tgfβ3，从而达到长期培养并稳定多能干细胞的目的。在一些具体的实施方案中，所述hpsm2中添加fgf2-g3，用于克服培养基中成纤维细胞生长因子热不稳定的情况。

15、本发明第二方面提供了一种无血清无饲养层培养基的制备方法，所述制备方法包括将前面所述的hpsm2添加到已溶解于水的前面所述的hpsm1中，混匀后调整ph值与渗透压，最后灭菌获得最终产物。

16、进一步，所述混匀温度为25℃。

17、进一步，所述ph值包括7.1-7.5。

18、在一些实施方案中，所述ph值为7.1、7.12、7.14、7.16、7.18、7.2、7.22、7.24、7.26、7.28、7.3、7.32、7.34、7.36、7.38、7.4、7.42、7.44、7.46、7.48、7.5。

19、进一步，所述ph值为7.4。

20、进一步，所述渗透压包括290mosm/kg～340mosm/kg。

21、在一些实施方案中，所述渗透压的范围包括290mosm/kg、292mosm/kg、294mosm/kg、296mosm/kg、298mosm/kg、300mosm/kg、302mosm/kg、304mosm/kg、306mosm/kg、308mosm/kg、310mosm/kg、312mosm/kg、314mosm/kg、316mosm/kg、318mosm/kg、320mosm/kg、322mosm/kg、324mosm/kg、326mosm/kg、328mosm/kg、330mosm/kg、332mosm/kg、334mosm/kg、336mosm/kg、338mosm/kg、340mosm/kg。

22、进一步，所述渗透压为340mosm/kg。

23、进一步，所述灭菌为滤膜过滤灭菌。

24、进一步，所述滤膜过滤灭菌包括通过0.22μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。

25、进一步，所述水包括去离子水或超纯水。

26、本发明第三方面提供了一种由前面所述的制备方法制备出的无血清无饲养层培养基。

27、本发明第四方面提供了前面所述的体系、前面所述的制备方法在制备细胞培养基中的应用。

28、进一步，所述细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。

29、进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。

30、本发明第五方面提供了前面所述的体系、前面所述的制备方法、前面所述的无血清无饲养层培养基在培养干细胞中的应用。

31、进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。

32、进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。

33、本发明第六方面提供了一种体外培养干细胞的方法，所述方法包括使用前面所述的无血清培养基培养干细胞的步骤。

34、进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。

35、进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。

36、本发明第七方面提供了一种培养干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前面所述的体系，配制说明书。

37、进一步，所述配制说明书中包括前面所述的制备方法。

38、进一步，所述干细胞包括多能干细胞、寡能干细胞、单能干细胞。

39、进一步，所述多能干细胞包括胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胎盘干细胞、间充质干细胞。

40、本发明第八方面提供了前面所述的体系、前面所述的制备方法在制备自动化生产无血清无饲养层的系统或装置中的应用。

41、进一步，所述系统或装置包括一个或多个储存器，一个或多个处理器。

42、进一步，所述系统或装置由储存在储存器中的计算机程序控制操作。

43、进一步，所述处理器用于处理计算机程序提供的操作程序。

44、本发明的有益效果：

45、本发明的培养基体系成份明确，无血清、无异源蛋白，适合培养产品的临床转化。且培养的细胞代次多，增殖能力强，状态好符合临床转化的基本要求。