一种温度响应性纳米抗体偶联物及其制备方法和应用

本发明涉及纳米抗体类药物，尤其涉及一种温度响应性纳米抗体偶联物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、随着对单克隆抗体类药物的深入研究，其局限性也逐步被发现，例如单克隆抗体类药物的分子量较大，稳定性低，对肿瘤组织的穿透性差，只能针对分泌型和细胞膜表面的抗原发挥作用；单克隆抗体中的片段可结晶区(fc)往往需要人源化处理，以降低其免疫原性；而且fc受体普遍存在，也降低了单克隆抗体与目标受体的结合几率；另外，单克隆抗体的表达往往借助于真核系统，纯化依赖于色谱纯化技术，因此其生产纯化的成本较高。

2、纳米抗体作为一种替代传统单克隆抗体的抗体形式，弥补了传统单克隆抗体的不足。纳米抗体来源于单克隆抗体的重链可变区，是目前已知的最小的抗体片段，但其仍保持了较高的与受体结合的能力，并且与单克隆抗体相当。由于纳米抗体分子量较小，其对组织的穿透能力较强，可以识别致密组织或者实体瘤内部隐藏的抗原表位。除此之外，与单克隆抗体相比，纳米抗体有着免疫原性较低，稳定性高的优势，并且纳米抗体的表达仅需要借助微生物体系，更易于生产。

3、尽管有着诸多优势，纳米抗体最主要的缺点是其半衰期较短，更容易通过肾脏的过滤功能被清除，极易被代谢和降解。而由于免疫疗法往往需要高剂量来达到临床疗效，易被快速清除的纳米抗体往往需要更高的注射剂量，采用多次注射的方式来达到临床效果，因此限制了其实际应用。目前已有多种策略来解决纳米抗体半衰期短的问题，如来源于igg片段的fc修饰，聚乙二醇修饰(polyethylene glycol，pegylation)，糖基化修饰及白蛋白偶联等。然而，这些修饰也存在明显的不足之处，如修饰后蛋白的活性降低、被修饰蛋白的结构发生改变、理化性质发生变化、纯化过程变得复杂、免疫原性升高、多态化、需要借助于真核表达系统，成本高昂等。因此，需要开发能够显著改善纳米抗体半衰期短、生物利用率低等问题的纳米抗体类药物。

技术实现思路

1、为解决纳米抗体类药物在临床应用中存在的代谢快、半衰期短的技术问题，本发明提供一种温度响应性纳米抗体偶联物及其制备方法和应用。

2、具体地，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供一种温度响应性纳米抗体偶联物，所述纳米抗体偶联物包含纳米抗体类药物和温敏性类弹性蛋白多肽；所述温敏性类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包含(gxgvp)n，其中，x为除脯氨酸以外的任意一种天然氨基酸，n为不小于10的整数。

4、类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides，elps)来源于哺乳动物的弹性蛋白原，是一类对温度敏感的生物大分子，具有温敏可逆相变的特性，可作为生物材料，具有生物相容性、无毒无免疫原性、可生物降解、对温度敏感、精准设计和可快速纯化等优势。可逆相变是指类弹性蛋白在可溶和聚集两相之间，在一定温度时的相平衡压力下发生的相变化，也就是说，若环境温度低于其相变温度，该多肽在水溶液中高度可溶；在环境温度高于相变温度时，富含甘氨酸的多肽开始聚集，形成elp的聚集物，并且该相变过程是可逆的。水溶液中的elps在相转变温度(transition temperature，tt)附近可发生可逆的聚集溶解。当温度低于tt时，elps呈现可溶的状态；当温度高于tt时，elps发生聚集，形成不溶的聚集状态，经注射可在原位形成药物储库，进而达到药物缓慢释放的目的。elp的相变温度可随x氨基酸的极性和重复单元的数量而发生改变，规律如下：重复单元数量(n)数量越多，相变温度(tt)越低；x氨基酸的极性越高，相变温度(tt)越低。

5、本发明发现，将类弹性蛋白多肽与半衰期较短的纳米抗体类药物进行偶联，能够实现纳米抗体类药物的温度依赖性可控释放，可显著改善纳米抗体类药物半衰期短、生物利用率低等问题。与传统的fc修饰相比，elp融合可提高纳米抗体类药物对肿瘤的穿透能力及富集能力，其生物安全性也得到显著提升。

6、本发明的纳米抗体类药物在偶联类弹性蛋白多肽后，在给药部位可形成“药物储库”。“药物储库”是指纳米抗体偶联物经高温触发析出，在给药部位形成富含elp的聚集体。给药部位可以根据疾病种类、治疗部位和蛋白药物种类等及进行选择，包括但不限于皮下给药、腹腔给药或者肿瘤内部给药。

7、上述温度响应性纳米抗体偶联物中，x为缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸中的任意一种，10≤n≤200；

8、优选地，所述类弹性蛋白多肽的响应温度为20-36℃。

9、优选地，上述温度响应性纳米抗体偶联物中，x为缬氨酸，30≤n≤150。

10、本发明发现，针对纳米抗体，采用包含(gvgvp)n序列的类弹性蛋白多肽更有利于延长纳米抗体的半衰期，改善其药代动力学，提高其生物利用率。

11、进一步优选地，上述温度响应性纳米抗体偶联物中，x为缬氨酸，60≤n≤120。

12、在本发明的一些实施方式中提供一种温度响应性纳米抗体偶联物，其包含纳米抗体类药物和温敏性类弹性蛋白多肽；所述温敏性类弹性蛋白多肽的氨基酸序列包含(gxgvp)n，其中，x为缬氨酸，n＝90。

13、本发明所述的类弹性蛋白多肽可采用基因工程领域常规的合成方法制备和表达。

14、本发明中，所述纳米抗体类药物为轻链缺失的重链抗体(hcab)、重链抗体可变区(vhh)或单域抗体(sdab)。

15、优选地，所述纳米抗体类药物的分子量为1-300kda。

16、进一步优选地，所述纳米抗体类药物的分子量为12-300kda。分子量为12-300kda的纳米抗体类药物的分子量较小，容易被体内蛋白酶降解和经肾脏排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，尤其适合与前述的温敏性类弹性蛋白多肽进行偶联，避免蛋白酶降解和肾脏排出，延长药物的半衰期。

17、优选地，所述纳米抗体类药物的靶点为选自白细胞分化抗原3(cd3)、白细胞分化抗原19(cd19)、白细胞分化抗原20(cd20)、白细胞分化抗原47(cd47)、人表皮生长因子2(her2)、表皮生长因子受体(egfr)、血管内皮细胞生长因子(vegf)、血管内皮细胞生长因子受体(vegfr)、细胞毒性t淋巴细胞抗原(ctla-4)、b细胞成熟抗原(bcma)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白细胞介素-1(il-1)、白细胞介素-2(il-2)、白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-6受体(il-6r)、白细胞介素-12(il-12)、白细胞介素-17(il-17)、白细胞介素-23(il-23)、整合素(integrin)、程序性死亡受体(pd1)、程序性死亡受体配体(pdl1)、sars-cov-2中的至少一种。

18、进一步优选地，所述纳米抗体类药物是与免疫检查点特异性结合并具有高亲和力的抗体片段，例如，免疫检查点pd1、pdl1、表皮生长因子受体her2、egfr、cd47、cd3等的纳米抗体片段。

19、上述温度响应性纳米抗体偶联物中，所述纳米抗体类药物与所述温敏性类弹性蛋白多肽直接连接或通过连接体连接。

20、优选地，所述纳米抗体类药物与所述温敏性类弹性蛋白多肽通过连接体连接。

21、优选地，所述连接体为富含甘氨酸和丝氨酸的寡肽。

22、在本发明的一些实施方式中，所述连接体的氨基酸序列为gsgggs(seq id no.3)。

23、本发明发现，采用上述连接体连接纳米抗体类药物与温敏性类弹性蛋白多肽，可更好地保证纳米抗体类药物与类弹性蛋白多肽的两个肽段间不会发生功能区的折叠和遮挡，不会显著影响纳米抗体类药物与靶位点的结合，能够最大程度地保持纳米抗体类药物和类弹性蛋白多肽的活性和功能。

24、本发明对偶联的操作方法并没有特别的限定。本领域技术人员可以采用本领域常规使用的手段进行纳米抗体类药物和elp的偶联，只要能够获得本发明所述的温度响应性纳米抗体偶联物即可，例如根据本发明的一种优选的具体实施方式，利用基因工程技术将elp的n末端或c末端与纳米抗体类药物融合表达，得到温度响应性纳米抗体偶联物。

25、本发明中，所述纳米抗体偶联物的水合直径≤200nm。该纳米抗体偶联物具有通过高渗透性与滞留效应(epr)介导的被动靶向肿瘤优势。

26、优选地，所示纳米抗体偶联物的水合直径为10-100nm。更优选为10-50nm。

27、免疫检查点阻断(icb)疗法改变了传统的肿瘤治疗方式，在多种类型的肿瘤治疗中表现出显著的治疗效果。程序性死亡蛋白pd1和程序性死亡蛋白配体1(pdl1)是目前最受关注的一类免疫抑制检查点。肿瘤细胞通过高表达pdl1，可逃脱免疫系统的监控，进一步扩增和转移，因此阻断pd1/pdl1通路，激活免疫系统对肿瘤细胞的杀伤，是目前抗肿瘤药物研发的有效途径。到目前为止，几种针对pd1和pdl1的单克隆抗体(mabs)已被批准用于多种实体瘤的治疗，例如：抗pdl1的单克隆抗体阿妥丽珠单抗(atezolimab)已在2019年经美国食品与药品监督管理局(fda)批准，用于三阴乳腺癌(tnbc)的治疗。

28、本发明以pdl1纳米抗体为研究对象，针对该纳米抗体，开发偶联温敏性类弹性蛋白多肽的温度响应性纳米抗体偶联物。

29、在本发明的一些实施方式中，所述纳米抗体类药物为pdl1纳米抗体。所述温度响应性纳米抗体偶联物包含pdl1纳米抗体、连接体和温敏性类弹性蛋白多肽。

30、优选地，所述pdl1纳米抗体的c端或n端通过连接体与所述温敏性类弹性蛋白多肽的n端或c端连接。

31、优选地，所述连接体的氨基酸序列为gsgggs。利用该连接体将elp序列与纳米抗体偶联不会显著降低纳米抗体与靶点的结合能力。

32、优选地，所述温度响应性纳米抗体偶联物具有以下(1)-(3)中的任意一种氨基酸序列：

33、(1)如seq id no.1所示的氨基酸序列；

34、(2)如seq id no.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能的氨基酸序列；

35、(3)与如seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％相似性且具有相同功能的氨基酸序列。

36、上述如seq id no.1所示的序列包括顺次连接的如下序列：pdl1纳米抗体多肽序列、连接体序列、类弹性蛋白多肽序列，其中连接体的序列为gsgggs，该连接体可保证pdl1纳米抗体与类弹性蛋白多肽的两个肽段间不会发生功能区的折叠和遮挡，不显著影响纳米抗体与靶位点的结合，能够最大程度地保持pdl1纳米抗体和elp的活性和功能。

37、本发明针对pdl1纳米抗体提供一种能够响应温度刺激的温敏性纳米抗体偶联物，利用基因工程技术将pdl1纳米抗体的c端与温敏性elp多肽融合表达，得到pdl1纳米抗体-elp多肽偶联物。通过调控该偶联物中elp的重复单元序列和重复单元数量，确定了偶联物中的配合pdl1纳米抗体使用的最优elp序列，即(gvgvp)90，进一步确定了偶联物的序列，使得偶联物能够达到低于体温的适宜相变温度。在实际应用时，如腹腔注射后，pdl1纳米抗体-温敏性elp多肽偶联物会从溶液中析出并在注射部位形成药物储库。而且，由于elp相变温度具有浓度依赖性，储库中边缘的偶联物会在相当长的一段时期内逐渐溶解扩散释放进入血液循环系统，实现纳米抗体的超长释放，有效延长纳米抗体的循环半衰期，并能保证药物的生物利用度和组织渗透性。本发明的纳米抗体偶联物在给药物被缓慢释放到达肿瘤组织，进一步与靶点蛋白pdl1结合，阻断免疫检查点，激活免疫系统，达到免疫治疗的目的，具有半衰期长、特异性高、组织渗透性强以及生物安全性高等优势。

38、本发明提供的上述pdl1纳米抗体-elp偶联物的分子直径≤200nm。该纳米尺度的偶联物具有通过高渗透性与滞留效应(epr)介导的波动靶向肿瘤优势。本发明利用肿瘤模型验证了所述偶联物在肿瘤治疗中的功能，结果表明，仅需一次给药，pdl1纳米抗体-elp偶联物表现出显著增强的肿瘤聚集和渗透能力。

39、本发明提供的上述pdl1纳米抗体-elp偶联物的半衰期可长达一个月之久，半衰期显著延长，与未修饰的纳米抗体及传统fc修饰的纳米抗体相比，其半衰期分别延长了276.4和5.1倍，药代动力学参数表现优异，且具有良好的组织渗透性和活性，药物的疗效得以提高，毒副作用减少。

40、本发明提供的上述pdl1纳米抗体-elp偶联物的给药可采用不同的方式，当采用腹腔给药时，所述偶联物的浓度应大于5μm。在以大于5μm的浓度进行腹腔注射时，偶联物将从溶液中析出，在注射原位形成药物储库，并且由于储库边缘的低浓度溶解效应，偶联物分子会逐渐从储库释放扩散进入循环系统，实现药物的长效缓释。

41、在上述温度响应性纳米抗体偶联物的基础上，本发明还提供编码以上所述的温度响应性纳米抗体偶联物的核酸分子。

42、根据以上所述的温度响应性纳米抗体偶联物的氨基酸序列，本领域技术人员可以获得编码所述温度响应性纳米抗体偶联物的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，上述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码上述温度响应性纳米抗体偶联物的核酸分子均在本发明的保护范围内。

43、在本发明的一些实施方式中，编码所述温度响应性纳米抗体偶联物的核酸分子的核苷酸序列如seq id no.2所示。

44、本发明还提供包含所述核酸分子或表达所述温度响应性纳米抗体偶联物的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

45、其中，所述表达盒可由启动子与所述核酸分子可操作性地连接得到。根据表达需要以及表达盒上下游序列的不同，表达盒中还可包含终止子、增强子等其他转录、翻译调控元件。

46、所述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、转座子等，其中质粒载体包括复制型载体和非复制型载体。

47、本发明中，所述载体可以通过将所述核酸分子插入克隆载体或表达载体而得到，或者可以通过人工合成得到。所述载体优选为质粒或病毒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。病毒很容易转染到受体细胞中。本领域技术人员可以根据需要进行选择适宜的载体。

48、dna相对于rna而言，更稳定且易于操作，对于用于构建重组细胞的重组载体，优选所述核酸分子为dna。

49、所述宿主细胞包括微生物细胞或动物细胞，其中微生物包括原核微生物(例如大肠杆菌)和真核微生物(例如酵母)。

50、所述宿主细胞含有所述核酸分子或含有携带所述核酸分子的载体。

51、本发明提供以上所述的温度响应性纳米抗体偶联物的制备方法，所述方法包括：将编码所述温度响应性纳米抗体偶联物的核酸分子导入宿主细胞，表达所述温度响应性纳米抗体偶联物，再经提取和纯化制备得到。

52、在本发明的一些实施方式中，将所述核酸分子连入表达载体后导入宿主细胞中，表达所述温度响应性纳米抗体偶联物。

53、在本发明的一些实施方式中，所述表达载体为pet-24a，所述宿主细胞为大肠杆菌。

54、基于所述温度响应性纳米抗体偶联物的功能，本发明提供以上所述的温度响应性纳米抗体偶联物或所述核酸分子或所述生物材料在制备药物中的应用。

55、优选地，所述药物包括用于预防或治疗肿瘤、组织器官病变、免疫性疾病或代谢性疾病或病毒感染的药物。

56、在本发明的一些实施方式中，所述药物为抗肿瘤药物。

57、其中，所述肿瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体癌、骨肉瘤、乳腺癌等常见实体瘤。

58、本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含以上所述的温度响应性纳米抗体偶联物。

59、优选地，所述药物组合物为抗肿瘤药物。

60、所述药物组合物还可包含一种或多种药学上适宜的赋形剂。

61、本发明的有益效果至少包括：本发明提供的纳米抗体偶联物具有温度响应性，显著延长了纳米抗体类药物的半衰期，改善了纳米抗体类药物的药代动力学参数，该纳米抗体偶联物还表现出显著增强的组织渗透能力，显著提高了纳米抗体类药物的生物利用率，不仅可以减少给药频率，还可极大地提高治疗效果，同时降低毒副作用，极大地提高患者的生活质量。此外，该纳米抗体偶联物的制备所需设备简单、成本低廉、工艺操作方便，具有较好的推广应用价值和潜力。