双层水凝胶微球及其应用

本发明涉及生物，具体涉及双层水凝胶微球及其应用。

背景技术：

1、骨关节炎(oa)是一种退行性疾病，由多种因素引起，如衰老、肥胖、劳损、创伤、先天性关节畸形、关节畸形、关节软骨恶化以及关节边缘和软骨下骨过度生长。oa的病因通常与血管灌注不足、炎症和软骨细胞退变有关。oa的发病机制中最重要的炎性因子白介素-1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)。它们可通过激活大量信号通路，进而激活其他细胞因子和病理过程。这一过程部分是由趋化因子介导，当受到细胞因子刺激时，趋化因子将炎症细胞募集到关节，进一步促进更多炎症因子的分泌，导致疾病的进展。此外，软骨细胞会转变为分泌基质降解酶的分解代谢细胞，包括基质金属蛋白酶(mmps)，如mmp-9和mmp-13。mmp分泌增加加重了软骨细胞的细胞外基质(ecm)降解，最终导致软骨损伤。因此，针对局部微环境的反应，抑制炎症微环境和促进软骨细胞恢复是治疗oa的潜在有效方法。

2、目前，oa的治疗方法包括体重管理和适当运动等非药物疗法，口服或局部给予的药物疗法，关节内注射皮质类固醇，以及新兴的基于细胞的疗法。然而，这些治疗方法并未表现出很好的治疗效果。目前治疗方法失败，可能归因于患者依从性差和与系统性药物相关的频繁不良反应。由于关节腔内注射的局部疗效较好，且全身不良反应小，这给药方法可提供更有效的治疗结果。当药物直接注射到关节时，药物的剂量会迅速降低。因此，新型药物缓释技术的发展是至关重要的，使关节内的药物可持续长时间释放。这种微球可以是上述弊端得到明显改善。

3、脂质体是由磷脂双分子层组成的囊泡，它们可以通过高度水合的磷酸胆碱头形成水合润滑层，从而具有润滑作用。此外，脂质体可以装载水溶性和脂溶性药物，因此在生物润滑领域备受关注。然而，使用脂质体进行生物润滑和治疗存在两个主要问题。(1)作为纳米尺寸的物质，脂质体本身以及包载的药物很容易从注射部位扩散开来，这将降低局部脂质体浓度和药物浓度，从而影响润滑和治疗效果；(2)脂质体在体内易被降解，且易被网状内皮系统清除，这将降低脂质体在生物体内的停留时间。因此，提高脂质体的稳定性和延长脂质体在体内的停留时间是是当下急需突破的瓶颈。

4、近年来，可注射型水凝胶以其良好的生物相容性和可控的药物传递行为被开发出来。可用于载脂质体，避免脂质体的快速扩散。水凝胶广泛用于治疗oa，主要是利用胶原、明胶、软骨素等生物相容性材料合成，修复软骨缺损。为了获得治疗效果，这些材料可以与脂质体、药物及间充质干细胞一起负载到水凝胶中。之前开发了一种甲基丙烯酰明胶(gelma)水凝胶，它可以自我募集内源性tgf-β1来促进软骨再生。由于水凝胶形状不均匀、尺寸较大，直接注射可能会损伤健康组织；此外，外科手术植入创伤较大，给患者带来不适。可注射水凝胶微球结构稳定性高、粒径一致、具有良好的可注射特性等显著改善了上述缺点。局部向关节腔内注入微球，滚珠轴承的作用可以增加关节润滑。微球内的脂质体在关节剪切力作用下会在微球表面形成水合润滑层，进一步发挥润滑作用。载药微球具有稳定、持续释放药物的特点，可通过抗氧化、促进自噬等方式用于oa治疗。然而，目前水凝胶微球仅作为药物载体工具治疗oa，药物释放缓慢是通过微球的自然降解实现，而不是对骨关节炎微环境做出反应。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了双层水凝胶微球及其应用。

2、本发明提供了双层水凝胶微球及其应用。本发明提供的双层水凝胶微球，可对oa的微环境进行响应，时序性释放不同的药物，从而达到更好的治疗效果。

3、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

4、本发明提供了双层水凝胶微球，包括chsma内层微球和包载有药物脂质体的gelma外壳；

5、所述包载有药物脂质体的gelma外壳中的脂质体包括脂质；

6、所述脂质包括卵磷脂、胆固醇和十八烷基胺；所述卵磷脂：胆固醇：十八烷基胺的质量比为20：5：2。

7、在本发明的一些具体实施方案中，其制备方法包括：

8、步骤①、通过油相将制备获得的chsma水相分割，交联，获得所述chsma内层微球；

9、步骤②、制备获得gelma溶液后，与包载药物的脂质体混合，获得所述包载有药物脂质体的gelma外壳；

10、步骤③、取所述chsma内层微球与所述包载有药物脂质体的gelma外壳混合，交联，获得所述双层水凝胶微球。

11、在本发明的一些具体实施方案中，所述chsma水相由硫酸软骨素、甲基丙烯酸酐和光引发剂制备获得；所述油相由肉豆蔻酸异丙酯和失水山梨醇油酸酯制备获得；

12、所述gelma溶液由明胶和甲基丙烯酸酐和光引发剂制备获得；

13、所述包载药物的脂质体由药物和所述脂质体制备获得。

14、在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括塞来昔布。

15、本发明还提供了所述双层水凝胶微球的制备方法，包括如下步骤：

16、步骤a：通过油相将硫酸软骨素、甲基丙烯酸酐和光引发剂混合得到的chsma水相分割，交联，获得所述chsma内层微球；

17、步骤b：取明胶、甲基丙烯酸酐和光引发剂混合，得到gelma溶液后与包载药物的脂质体混合，获得所述包载有药物脂质体的gelma外壳；

18、步骤c：取所述chsma内层微球与所述包载有药物脂质体的gelma外壳混合，交联，获得所述双层水凝胶微球。

19、在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括塞来昔布。

20、在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法具体包括如下步骤：

21、步骤1：取硫酸软骨素与甲基丙烯酸酐混合后，再与乙醇混合，透析，冻干，获得chsma冻干物；

22、步骤2：通过油相将所述chsma冻干物制成的chsma水相分割，交联，冷冻干燥获得所述chsma内层微球；

23、步骤3：取明胶与甲基丙烯酸酐混合，透析，冻干，得到gelma冻干物后与光引发剂混合，获得gelma溶液；

24、步骤4：取脂质和药物混合，旋转真空后与水混合，超声处理，挤压，获得包载药物的脂质体；

25、步骤5：取所述gelma溶液与所述包载药物的脂质体混合，获得所述包载有药物脂质体的gelma外壳；

26、步骤6：取所述chsma内层微球与所述包载有药物脂质体的gelma外壳混合，交联，获得所述双层水凝胶微球；

27、步骤2中所述油相包括肉豆蔻酸异丙酯和失水山梨醇油酸酯。

28、在本发明的一些具体实施方案中，所述药物包括塞来昔布。

29、在本发明的一些具体实施方案中，步骤1中所述透析的截留分子量为3000da。

30、在本发明的一些具体实施方案中，步骤2中所述chsma水相包括0.25％(w/v)光引发剂和chsma；所述光引发剂包括lap；

31、所述chsma水相的注射速率为0.5～1.5ml/h；

32、所述油相的注射速率为15～45ml/h；

33、所述油相和chsma水相的流速比为30:1；

34、所述油相中肉豆蔻酸异丙酯与失水山梨醇油酸酯的体积比为9:1。

35、在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述透析的截留分子量为10kda；

36、步骤3中所述光引发剂包括lap；所述光引发剂的浓度为1％；

37、步骤3中所述gelma溶液的浓度为7.5％。

38、在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述挤压采用的聚碳酸酯膜孔径为450nm和220nm；

39、所述旋转真空的温度为60℃；所述超声处理的时间为20min。

40、在本发明的一些具体实施方案中，所述交联采用6.9mwcm-2 uv，时间为1分钟。

41、在上述研究的基础上，本发明还提供了如下任意项在制备治疗骨关节炎的药物中的应用：

42、(1)、所述双层水凝胶微球；和/或

43、(2)、所述制备方法制得的双层水凝胶微球。

44、在本发明的一些具体实施方案中，所述治疗骨关节炎包括如下任意项：

45、(1)、抑制炎症；和/或

46、(2)、促进软骨细胞合成代谢和/或抑制分解代谢。

47、在本发明的一些具体实施方案中，所述抑制炎症包括抑制炎症因子；

48、所述促进软骨细胞合成代谢和/或抑制分解代谢包括包括抑制软骨细胞合成分解代谢因子。

49、在本发明的一些具体实施方案中，所述炎症因子包括tnf-α和il-6；

50、所述软骨细胞合成分解代谢因子包括agg、col2a1和mmp13。

51、本发明还提供了药物，包括如下任意项：

52、(1)、所述双层水凝胶微球；和/或

53、(2)、所述制备方法制得的双层水凝胶微球。

54、本发明提供了双层水凝胶微球及其应用。本发明利用微流控技术设计了一种可以响应oa微环境的双层水凝胶微球(chsma+clx@lipo@gelma)。首先，通过薄膜分散法将塞来昔布(celecoxib,clx)包裹成脂质体；其次，利用微流控技术制备甲基丙烯酰化硫酸软骨素(chsma)内层微球。最后，将冻干的chsma微球浸泡在clx@lipo@gelma中，使chsma微球表面形成一层clx@lipo@gelma外壳。外层gelma可响应oa微环境中mmps快速降解，释放载clx脂质体。在润滑的同时，释放的clx发挥抗炎作用，外层降解后内核结构chsma微球暴露并开始降解，促进oa关节损伤软骨的修复，治疗oa。