一种雾化调理液的制备及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种雾化调理液,还包括该雾化调理液的应用。

背景技术：

0、技术背景

1、慢性呼吸系统疾病(chronic respiratory disease，crd)是指影响包括肺部在内的中下呼吸道健康的一类疾病，包括慢性阻塞性肺病(copd)、哮喘、尘肺、间质性肺病和肺结节病(pulmonary sarcoidosis)等。

2、联合国可持续发展目标之一是在2030年前将非传染性疾病导致的过早死亡率降低1/3。慢性呼吸系统疾病(crd)是全球第三大致死原因——2019年导致了近400万人死亡，患病人数为4.546亿例。1990—2019年，全球因crd导致的死亡人数和患病人数分别增加了28.5％和39.8％，年龄标准化率分别下降了41.7％和16.9％[global burden of chronicrespiratory diseases and risk factors,1990-2019:an update from the globalburden of disease study2019.eclinical medicine,2023.59:p.101936.]。

3、2019年，全球分别有470万例和2420万例间质性肺病和肺结节病(pulmonarysarcoidosis)新发病例。女性中调整失能生存期(dalys)和死亡率的年龄标准化率略低于男性，而患病率和发病率相当。在全球范围内，1990—2019年，间质性肺病和肺结节病的患病率和发病率的年龄标准化率分别增加了9.4％和14.1％，死亡率和dalys的年龄标准化率相对不变。

4、2019年，安第斯拉丁美洲和南亚地区间质性肺病和肺结节导致的调整失能生存期(dalys)和死亡率的年龄标准化率最高，而东欧和东亚的数值最低。亚太地区和北美地区高收入国家的患病率和发病率的年龄标准化率最高。高社会发展指数国家的患病率的年龄标准化率更高，而中等和中高社会发展指数国家的调整失能生存期(dalys)和死亡率的年龄标准化率较低[global burden of chronic respiratory diseases and risk factors,1990-2019:an update from the global burden of disease study 2019.eclinicalmedicine,2023.59:p.101936.]。

5、肺结节是指直径小于3厘米、密度均匀、边缘光滑的肺部影像，可以是单个也可以是多个，以非干酪肉芽肿为病理特征的系统性疾病，肺结节也被视为是肺癌的“癌前特征”。据统计，全球肺结节的患病率大约在20％左右，其中，50岁以上人群的患病率较高。而在我国，根据不同地区的调查结果，肺结节的发病率在7％-52％之间。另外，男性比女性更容易患上肺结节，而吸烟、环境污染等因素也会增加肺结节的发病率。

6、目前全世界缺乏控制肺结节病的有效手段。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种能够改善慢性呼吸系统疾病控制肺结节的雾化调理(nebulizatical regulatory)液。

2、本发明提供了一种雾化调理液的应用，所述的雾化调理液在制备治疗慢性呼吸系统疾病的药物或者试剂中的应用；所述的雾化调理液含有雾化调理组合物，所述的雾化调理组合物包含间充质干细胞培养中分泌出的生物膜包裹的囊状体。

3、本发明的雾化调理液含有的雾化调理组合物，能够对肺结节病的科学研究和调理缓解起到积极的促进作用。本发明采用的雾化调理组合物，经过雾化吸入后，作用于调理者的下呼吸道，调理气息，疏通阻塞，瓦解瘀滞，赋能免疫，能够有效缓解肺结节病引起的背部疼痛、睡眠质量差和醒后难以入睡，给使用者带来轻松畅快的生活体验。本发明的雾化调理液使用方法简单，组装好雾化装置后即可开始，雾化过程约20-30分钟。制备全过程为无血清培养体系，不含任何动物血清成分，无需其它额外复杂危险的操作，在安全性方面相当可靠。

4、动物雾化吸入本发明的组合物后，进行终末解剖并按照方案进行了相关组织脏器采集，目前已在进行病理制片。根据已有数据，所有动物均存活至计划解剖(d15)，一般观察、体重、血液学和凝血、血清生化各项指标均未见明显异常。另外，剖检结果未见异常脏器或组织。

5、优选地，所述的治疗慢性呼吸系统疾病的药物或者试剂是改善呼吸或者行动能力的雾化药物或者试剂。

6、本发明的雾化调理组合物加入肺癌细胞，例如a549或者ncih460等，肺癌细胞的数量并没有显著降低，但是作为雾化药剂或者与其他呼吸道药物联合用药后，却能够显著降低肺结节体积。

7、优选地，所述的治疗慢性呼吸系统疾病的药物是控制或者减小肺结节体积的药物。

8、优选地，所述的治疗慢性呼吸系统疾病的药物是抑制肺部赘生物生长的药物。

9、本发明的雾化调理液的制备方法包括以下步骤：

10、s1，获取在培养基质中培养的间充质干细胞；

11、s2，收集间充质干细胞的培养基质，获取上清液；

12、s3，将收获的上清液与lasco按1:1-9:1的比例(体积比)混匀后，过滤，收集精纯液；

13、s4，对精纯液进行冻干，然后溶解于8ml纯水。

14、优选地，所述的获取在培养基质中培养的间充质干细胞包括：

15、s1.1，在无菌条件下取得含有间充质干细胞的组织，清洗并去掉残留的血细胞；

16、s1.2，将其切成片段并剔除血管；

17、s1.3，取出其中的凝胶状组织，将其剪成组织块，然后置于细胞培养瓶中；

18、s1.4，2-10小时后，加入完全培养基，放置在co2培养箱中培养；

19、s1.5，2-4天后半量换液，5-7天后再次换液，此后每隔2-4小时换液1次；当细胞达80％-90％融合度时，传代并将组织块转移到一个新的培养瓶中，获得第一次组织块贴壁培养的细胞，以此记为p1代；

20、s1.6，重复步骤s1.5，获得第二次组织块贴壁培养的细胞；

21、s1.7，培养中每2-3天时间半量换液一次；

22、s1.8，当细胞达80％-90％融合度时，采用1:2-1:3的比例进行胰酶消化传代；

23、s1.9，培养至至p6代次，将细胞用胰酶消化后按1x10e7/管加入无血清冻存液进行冻存。

24、优选地，所述的过滤包括粗滤、初纯或者精纯中的两种或者两种以上的组合。粗滤使用孔径不大于0.45μm的滤器过滤。初纯使用标称截留分子量不小于100kd的切向流膜包，例如本标称截留分子量为100kd、300kd|的切向流，待循环洗出至少3倍体积的废液。本发明的研究表明，标称截留分子量较小的情况下，即便所得雾化调理组合物的蛋白含量比较高，甚至多于4.0g/l，但是雾化后的效果并不太理想，不能有效缩小肺结节的体积。精纯使用孔径不大于0.1μm的滤器过滤。

25、优选地，将收获的上清液与lasco按4:1-6:1的比例(体积比)混匀。研究结果表明，在这个混合范围内，雾化调理液包括雾化调理组合物比较稳定，作为雾化药剂使用后，肺结节阴影减小比较显著。

26、冻干是在高真空下以冻结状态干燥，在此过程中水或其他冻干溶剂快速升华，剩下多孔固体。冻干所剩的固体成分相对容易保存，而且固体成分内包括各种蛋白质多肽的营养成分活性损失较少。优选地，所述的冻干包括：

27、s4.1，精纯完成后，分装至密封容器中；

28、s4.2，将分装完成的密封容器放密封置于盒中，不低于-50℃冷冻18-24小时；

29、s4.3，将冷冻完成的密封容器置于冻干机中，密封并抽真空，温度不高于-50℃，真空度不低于20pa，冻干过程持续至少48小时。

30、优选地，所述的溶解于8ml纯水包括：

31、s4.4，取孔径不大于0.1μm滤器过滤纯化水后，分装8ml/瓶至密封容器中，加塞，压盖，贴标签nr溶剂；以上操作过程需在至少百级洁净度条件下完成；

32、s4.5，对封装后的nr粉和nr溶剂检测外观、无菌、支原体、内毒素、渗透压、总蛋白、生物膜包裹的囊状体及其含量。

33、优选地，所述的雾化调理组合物是溶液，具有以下特征：

34、外观：淡黄色或无色透明液体；

35、菌群检测：阴性；

36、支原体：阴性；

37、内毒素：≤10eu/ml；

38、渗透压：280-330mosm/kg；

39、总蛋白：2.0-4.0g/l；

40、囊状体含量：1.0x10e9-1.0x10e10个/ml。

41、本发明中，干细胞是指来自于胚胎或生命体内具有在一定条件下自我更新与增殖分化能力的一。

42、本发明中，类细胞既能够产生表型与基因型与自身完全相同的子代细胞，也能够分化产生构成生命体的组织或器官的特化细胞。

43、本发明中，间充质干细胞是指来一种多能干细胞，具有干细胞的共性特征，具备自我更新的能力和多重分化的能力。

44、本发明中，生物膜包裹的囊状体是指细胞分泌的由双分子层生物膜包裹的镶嵌脂质的囊泡，直径约30-200nm，包含了蛋白质、脂质、多糖和核酸等多种物质，参与细胞间的转运和信息交流。

45、本发明中，lasco(生博生物1201228-001)是一种构象稳定剂。本发明中，完全培养基可以使用各种适于培养间充质干细胞的完全培养基，例如mscbm(mesenchymal stemcell basal medium)完全培养基。在本发明的一个优选实施例中，可以使用mscbm无血清培养基加血清或者血清替代物。相应的，无血清冻存液即在完全培养基基础上再加类似dmso(二甲基亚砜)的冻存剂。

46、优选地，本发明中的雾化调理组合物需要在无菌环境下制备。尤其是冻干及其后的步骤，最好在百级洁净度条件下完成。本发明采用的组合物由gmp级别的车间生产后，可用于人体临床实验。

47、本发明的有益效果包括：

48、1.本发明采用的雾化调理(nebulizatical regulatory)组合物，经过雾化吸入后，作用于调理者的下呼吸道，调理气息，疏通阻塞，瓦解瘀滞，赋能免疫，能够有效缓解肺癌以及肺癌手术后的呼吸急促、疲劳无力、行动不便、身体机能大幅度衰退，给使用者带来的回归正常生活的良好体验。

49、2.使用方法简单，组装好雾化装置后即可开始，雾化过程约20-30分钟，不占场地，无需其它额外复杂危险的操作。

50、3.制备全过程为无血清培养体系，不含任何动物血清成分，在安全性方面相当可靠。

51、可见，本发明所述的雾化调理组合物能够对肺癌的科学研究和调理缓解起到积极的促进作用。