一种动态纳米酶水凝胶及其制备方法与应用

本发明属于功能水凝胶领域，具体地，涉及一种动态纳米酶水凝胶的制备方法、由该制备方法制得的动态纳米酶水凝胶，以及该动态纳米酶水凝胶的应用。

背景技术：

1、耐药性细菌引发的伤口感染是皮肤损伤难以修复的主要原因。传统的抗生素能抑制细菌繁殖和生长，起到杀菌作用，但是过度使用抗生素导致细菌耐药性上升，治疗效果急剧下降，严重威胁人类生命安全。近年来，新兴的纳米酶材料，因其类酶活性，具备广谱抗菌、无耐药性、成本低等优点成为新一代抗生素。基于纳米酶在微酸环境下的过氧化物酶活性，可以在短时间内催化极低浓度的过氧化氢产生自由基，有效杀死多种耐药性细菌，促进感染伤口愈合。目前，已经证明具有类酶活性的纳米酶材料，包括金属氧化物、贵金属纳米颗粒、金属硫族化合物和碳基纳米材料等可以有效抗菌。然而纳米酶的低催化活性以及生物相容性极大地限制了其在生物医用领域的应用。含有原子级分散的金属活性位点的单原子催化剂(sacs)因其金属原子利用率高、活性高、选择性好等优点在催化领域得到了广泛的关注。然而大多数单原子位点缺乏稳定、牢固的相互作用，其活性位点中心不稳定，容易失活。通常通过在金属-有机框架(mof)和共价-有机框架(cof)中平均配位金属氮碳(m-n-c)结构上锚定金属位点以解决上述问题。考虑到材料的生物相容性等问题，来源广泛、含有大量氮氧官能团能提供锚固位点的甲壳素具备极大优势。

2、此外，伤口敷料不仅仅是作为骨、皮肤缺损区域的生长因子、治疗药物等物质的运载工具，也是缺损区域的物理屏障，可以提供湿润的环境，吸收伤口渗出积液，维持缺损组织结构。目前，已经开发出各种形式的伤口敷料，如海绵、膜和水凝胶等。而水凝胶因其结构功能与细胞外基质高度相似，可有效促进伤口处血管生成、组织再生而受到广泛关注。在实际应用中，传统的水凝胶往往缺乏形状自适应性、黏附性和自愈性。因此，它往往无法处理形状不规则的损伤，并与伤口保持良好的接触。正常运动中，敷料与创面容易分离，会延长伤口愈合时间，导致治疗效果不理想。此外，敷料直接与伤口分离可能会损伤新形成的组织，造成继发损伤。因此，亟待开发微酸环境中可封装纳米酶，且具有匹配伤口愈合速率的可降解、自愈合水凝胶用于促进伤口修复。

3、综上，现有技术具有以下缺点：现有的负载金属纳米粒子的纳米酶材料制备过程复杂且催化活性低，活性位点分散不均匀，易聚集失活，严重影响制备产率以及催化效率等问题。且在伤口治疗过程中，单纯纳米酶材料难以为缺损区域提供物理屏障，保证湿润的环境，吸收伤口渗出积液，维持缺损组织结构。传统的伤口敷料往往缺乏形状自适应性、黏附性和自愈性，导致治疗效果不理想。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明利用来源广泛、含有大量氮氧官能团能提供锚固位点的甲壳素通过盐模板法制备锌单原子纳米酶，其中含有原子级分散的金属活性位点的单原子催化剂因其金属原子利用率高和活性好表现出高效抗菌性能。将纳米酶均匀分散在羧乙基甲壳素接枝己二酰二肼(cect-adh)中，与氧化葡聚糖(od)通过动态酰腙键制备了全生物质基锌单原子纳米酶水凝胶(zn-gel)。在微酸环境下(ph＝6.0)，单原子纳米酶表现出高效的类过氧化物酶活性，产生ros有效杀菌。生物粘附的自愈合水凝胶为伤口处细胞提供微环境，促进血管形成、肉芽组织生长，显著加速感染伤口的愈合。

2、为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种动态纳米酶水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

3、(1)甲壳素纳米纤维的制备：

4、将甲壳素粉末加入含有2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(tempo)和溴化钠的去离子水中，均匀分散后加入naclo，滴加naoh保持ph＝9.5～10.5，搅拌反应后对水透析；冰浴下，细胞破碎仪超声，离心收集上清液，旋蒸浓缩得到甲壳素纳米纤维；

5、(2)纳米酶的制备：

6、高速搅拌下，将锌盐溶液逐滴滴加到甲壳素纳米纤维悬浮液，冰浴下搅拌分散数小时，冷冻干燥得到zn2+络合的甲壳素纳米纤维复合物，将样品在惰性气氛下煅烧，然后在hcl中搅拌、洗涤、冻干得到负载锌的甲壳素衍生的多孔碳纳米片催化剂sacs-zn-pcn；

7、(3)羧乙基甲壳素接枝己二酸二酰肼cect-adh的合成：

8、将cect溶解在去离子水中，将己二胺二酰肼、吗啉乙磺酸、碳二亚胺盐酸盐和羟基丁二酰亚胺加入上述溶液中，避光搅拌，经透析和冷冻干燥后得到终产物cect-adh；

9、(4)氧化葡聚糖od的合成：

10、将葡聚糖溶解于去离子水中，逐滴滴加naio4溶液，搅拌反应，随后加入乙二醇继续搅拌反应，终止反应后，经透析和冷冻干燥后得到终产物od；

11、(5)水凝胶的制备：

12、将cect-adh和od分别溶于ph＝5.5～6.5的pbs缓冲液中，形成cect-adh溶液和od溶液，将sacs-zn-pcn分散到所述cect-adh溶液中形成sacs-zn-pcn/cect-adh复合溶液，加入所述od溶液，然后涡旋快速混合均匀后转移至聚四氟乙烯模具中，熟化得到zn-gel水凝胶。

13、根据本发明一种优选实施方式，步骤(1)中，相对于1～10g甲壳素粉末，所述2,2,6,6-四甲基哌啶氧化的用量为8～96mg，所述溴化钠的用量为0.05～0.2g，所述naclo的用量为7～84ml；所述透析所用透析袋的截留量为7000～9000；细胞破碎仪超声的时间为20～40min。

14、本发明的甲壳素粉末可购得或通过如下方法制备得到：将虾壳原料浸泡于naoh溶液中除去蛋白质，然后分散到hcl溶液中除去残留的矿物质，再然后分散到h2o2溶液中进行氧化脱色，最后进行干燥，得到纯化后的甲壳素粉末。更具体地，首先将虾壳原料浸泡于5wt％naoh溶液中，在室温下搅拌48h除去蛋白质；然后分散到7wt％hcl溶液中室温搅拌48h除去残留的矿物质；再然后分散到4wt％h2o2溶液中，调节ph到8.0左右，80℃加热8h进行氧化脱色。每个步骤结束后用去离子水洗至中性，最后将甲壳素粉末进行干燥，纯化后的甲壳素粉末密封避光保存。

15、根据本发明一种优选实施方式，步骤(2)中，所述锌盐溶液的浓度为2～8mg/ml，用量为5～50ml；所述甲壳素纳米纤维悬浮液的浓度为0.1～2wt％，用量为100～150g；所述煅烧的升温速率为4～6℃min-1，温度为500～1000℃，时间为0.5～6h；所述hcl的浓度为1～6mol，在hcl中搅拌的时间为0.5～24h；所述洗涤采用去离子水、叔丁醇。

16、根据本发明一种优选实施方式，步骤(3)中，所述cect的用量为1.99～9.96mmol，cect的浓度为6～36mmol/l；所述己二胺二酰肼的用量为5.97～29.87mmol；所述吗啉乙磺酸的用量为10～50mmol；所述碳二亚胺盐酸盐的用量为1～2mmol；所述羟基丁二酰亚胺的用量为1～2mmol；所述避光搅拌的温度为20～30℃，时间为18～36h。

17、根据本发明一种优选实施方式，步骤(4)中，所述葡聚糖的用量为2～10mmol，葡聚糖溶液的浓度为6～36mmol/l；所述naio4的用量为3.3～16.5mmol；所述搅拌的温度为20～30℃，时间为0.5～24h；乙二醇的加入量为0.8～1.2ml，加入乙二醇搅拌2～4h终止反应。

18、根据本发明一种优选实施方式，步骤(5)中，所述熟化的温度为35～40℃。

19、本发明的第二方面提供由上述的制备方法制得的动态纳米酶水凝胶。

20、本发明的第三方面提供所述动态纳米酶水凝胶在制备用于感染伤口修复的药物中的应用。

21、本发明通过甲壳素纳米纤维配位络合金属zn盐后自组装形成纳米片，热解形成负载zn单原子的超薄多级孔碳纳米片(sacs-zn-pcn)。利用改性天然聚多糖cect-adh和od实现了全生物质基单原子纳米酶多功能水凝胶的构建(zn-gel)。sacs-zn-pcn具备类过氧化物酶活性，高效催化h2o2产生活性氧ros，有效杀菌避免细菌耐药性。同时单原子zn协同促进微酸环境下酰腙键的动力学反应，表现出动态特性，赋予水凝胶更好的自愈性、自适应性、可注射性。此外，丰富的氨基、羟基、羧基等基团使水凝胶在生物组织表面具有良好的粘附性能。在促进感染伤口愈合方面具有广阔的应用前景和市场价值，为制备智能生物医学材料开辟了一条新的途径。

22、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。