一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用与流程

本发明属于生物发酵，具体涉及一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用。

背景技术：

1、芸香科植物的栽培品种丰富多样，部分品种的果实可被用作药材。陈皮、橘红和佛手都是传统的芸香科中药材。在中医理论中，陈皮、橘红和佛手都被认为是具有祛痰止咳效果的重要药材。目前研究表明，陈皮、橘红和佛手中含量丰富且复杂的挥发油及黄酮类物质可能是形成其特殊风味和药效的关键成分，其中橙皮苷是这些芸香科药材含量最丰富的黄酮类化合物，但橙皮苷的水溶性差，人体利用率低。

2、现有技术对橙皮苷的改性方法有很多，如高温酸水解等化学改性、外加α-l-鼠李糖苷酶和β-d-葡萄糖苷酶的酶促反应以及通过曲霉属菌和雪腐镰刀菌的微生物发酵等。曲霉属和雪腐镰刀菌具有丰富的酶系统，能够将橙皮苷转化为具有较高生物活性的橙皮素或橙皮素单葡萄糖苷等成分。专利公开号为cn102925364a公开了使用曲霉属和雪腐镰刀菌规模化转化橙皮苷为橙皮素单葡萄糖苷的方法，还能避免橙皮素单葡萄糖苷进一步转化为橙皮素。然而，目前这两类菌虽然广泛应用于食品工业，但尚未被列入可应用于食品的菌种名单，不能直接添加于食品，橙皮苷发酵产物需要后续的提纯处理。

3、专利公开号为cn116509966a公开了一种益生菌发酵中药制剂、其制备方法及应用。该方法以桔梗、金银花、陈皮、鱼腥草、芦根等为发酵原料，利用嗜酸乳杆菌发酵对药材进行生物转化，使得上述药材经发酵后与剩余药材结合既能提高药物的活性，又能保持益生菌的功效，从而使所述发酵中药制剂具有镇咳等功效。借助益生菌发酵来提高中药制剂的口味风味，改变黄酮类化合物的组成，此类应用已经非常广泛。可影响中药原料中黄酮类化合物组成的微生物有很多，但以芸香科药材为底物，只借助乳酸菌株的组合发酵以提高橙皮素的含量为目的，提高发酵产物的免疫提升效果还未见报道。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法，发酵组合物原料包括陈皮、橘红和佛手，采用植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种及嗜酸乳杆菌对组合物进行联合发酵，提高了陈皮、橘红、佛手中的橙皮素和总多糖的含量。

2、本发明的第二个目的在于提供一种组合物的复合乳酸菌发酵品，其由上述制备方法发酵所得。

3、本发明的第三个目的在于提供了上述的复合乳酸菌发酵品在营养健康品领域的应用。

4、为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

5、一种组合物的复合乳酸菌发酵品，其为以陈皮、橘红、佛手为原料，通过嗜酸乳杆菌菌株（ lactobacillus acidophilus）lfla-208、动物双歧杆菌乳亚种菌株（ bifidobacterium animalis subsp.lactis）lfbb-106、罗伊氏乳杆菌（ lactobacillus  reuteri）lflr-219、副干酪乳杆菌（ lactobacillus paracasei）lflp-202和植物乳杆菌（ lactobacillus plantarum）lflp-213发酵获得。

6、如上所述的复合乳酸菌发酵品，优选地，所述组合物按陈皮、橘红、佛手原料按4:1:5

7、一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法，其包括如下步骤：

8、s1、将原料陈皮、橘红、佛手进行泡水打浆，经胶体磨研磨后得到组合物原浆液；

9、s2、往组合物原浆液加入柠檬酸，对组合物原浆液进行酸水解处理，往处理后的组合物原浆液加入碳源、氮源，调ph值后灭菌作为发酵组合物培养基；

10、s3、将植物乳杆菌lflp-213接种到发酵组合物培养基中进行发酵；

11、s4、将步骤s3发酵后的发酵组合物培养基接种罗伊氏乳杆菌lflr-219和副干酪乳杆菌lflp-202，进行共同发酵；

12、s5、将步骤s4发酵后的发酵组合物培养基接种动物双歧杆菌乳亚种lfbb-106，同时补充碳源，进行发酵；

13、s6、将步骤s5发酵后的发酵组合物培养基接种嗜酸乳杆菌lfla-208，进行发酵；获得产品。

14、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s1中，将陈皮、橘红、佛手在冷水中浸泡1~2h后捞出打浆，按料液比为1:4~1:5加入冷水，获得浆液，原料可分开打浆或混合一起打浆。

15、如上所述的制备方法，优选地，陈皮、橘红、佛手的用量按质量比为1~5： 1~5：1~5。进一步优选地，所述组合物原浆液中陈皮、橘红、佛手分开进行打浆，按陈皮、橘红、佛手的浆液按质量比4:1:5混合，并经胶体磨研磨处理。

16、如上所述的制备方法，优选地，在步骤s2中，所述柠檬酸在原浆液中的浓度为0.25mol/l，所述碳源为葡萄糖，用量为组合物原浆液质量的8~15%；所述氮源为酵母浸膏，用量为组合物原浆液质量的1~3%，ph值为6.8；灭菌的条件为121℃灭菌20 min。

17、进一步地，先加入柠檬酸粉末调整浆液，使柠檬酸浓度为0.25 mol/l，90℃加热搅拌4 h，对组合物原浆液进行酸水解，降温再加入碳源、氮源。

18、进一步地，在步骤s6中，所述碳源为150 ~250 g/l葡萄糖溶液，用量为组合物原浆液质量的1~5%。

19、如上所述的制备方法，优选地，菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，所述嗜酸乳杆菌菌株lfla-208的保藏编号为cgmcc no. 25112，动物双歧杆菌乳亚种菌株lfbb-106的保藏编号为cgmcc no. 25111，罗伊氏乳杆菌lflr-219的保藏编号为cgmcc no. 25110，副干酪乳杆菌lflp-202的保藏编号为cgmcc no. 25109，植物乳杆菌lflp-213的保藏编号为cgmcc no. 25107。

20、如上所述的制备方法，优选地，所述嗜酸乳杆菌菌株lfla-208、动物双歧杆菌乳亚种菌株lfbb-106、罗伊氏乳杆菌lflr-219、副干酪乳杆菌lflp-202和植物乳杆菌lflp-213先进行活化，采用改良mrs液体培养基培养后获得一级种子液，再采用二级扩大培养基，接种一级种子液分别进行扩大培养获得二级种子液，利用上述菌株的二级种子液进行发酵。

21、进一步优选地，所述改良mrs液体培养基每升中含有大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g和吐温-80 1.0 ml，其ph值为6.2；

22、所述二级扩大培养基每升中含有陈皮干粉10.0 g、橘红干粉10.0 g、佛手干粉10.0 g、大豆肽20.0 g、酵母提取物4.0 g、葡萄糖20.0 g、乙酸钠5.0 g、柠檬酸二铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁0.2 g、硫酸锰0.05 g和吐温-80 1.0 ml，其ph值为6.2。

23、如上所述的制备方法，优选地，各菌种二级种子液的接种量为组合物培养基体积的0.5~2%，各菌种二级种子液的活菌数范围在1×108~5 ×108cfu/ml。

24、如上所述的制备方法，优选地，所有发酵均为厌氧发酵，发酵在转速50~100 rpm，37℃条件下进行；

25、在步骤s3中，发酵的时间为24 h；在步骤s4中，发酵的时间为48 h；在步骤s5中，发酵的时间为24 h；在步骤s6中，发酵的时间为48 h。

26、如上所述的制备方法，优选地，将步骤s6发酵后的产品加入赋形剂后或直接喷雾干燥，得到所述复合乳酸菌发酵品。

27、本发明还提供了由上述的制备方法获得的复合乳酸菌发酵品在制备提高免疫力制剂中的应用。

28、本发明的有益效果在于：

29、1. 本发明提供了组合物的复合乳酸菌发酵品，发酵使用了5种乳酸菌菌株，在乳酸菌-组合物的转化体系中，组合物陈皮、橘红、佛手浆液中复杂且丰富的活性成分经不同的乳酸菌依次进行代谢转化，相比于将菌株同时投放进行发酵，合理的设置乳酸菌的添加顺序可以充分发挥菌株的发酵特点，使发酵组合物中的有效成分、活性物质能最大限度地得以转化。同时，合理的添加顺序也可以顺应乳酸菌生长代谢的物质需要，更充分的发挥乳酸菌作用。

30、2. 经过对比实验发现，本发明所用菌株经特定添加顺序发酵出乎意料的显著提高了发酵液的橙皮素含量，其总多糖水平在长时间发酵下未下降且有显著性提高，表明本发明所用菌株的应用具有突出效果，在产品最终效果上可更显著的提高肺部粘膜免疫力水平。

31、3. 本发明优选了陈皮、橘红和佛手三种组合物作为原料。这种配伍方法可以充分利用三味同属芸香科原料的传统功效，并且通过橘红的添加弥补了陈皮中橙皮苷含量偏少的不足，通过添加佛手大大丰富了原料的粗多糖类物质，从发酵反应底物含量搭配的角度与乳酸菌形成协同配合。

32、4. 本发明所用的5株乳酸菌可以直接应用于食品工业使用，通过探索发酵程序，发现5株菌株按特定程序发酵可以出乎意料的、更好的提高乳酸菌对陈皮、橘红和佛手三味芸香科药材中橙皮素的含量，可以起到调节发酵液中黄酮类物质含量占比的作用；同时，5株菌株按特定程序发酵还显著增加了发酵液的总多糖含量。