一种pH响应电荷翻转纳米递药系统的构建及其应用

本发明属于医药，具体涉及一种ph响应电荷翻转纳米递药系统的构建及其应用。

背景技术：

1、光热疗法(photothermic therapy,ptt)是通过光照射的形式在癌症治疗中同时发挥诊断和治疗的作用，由于其具有无创性、较小的副作用以及对边缘组织损伤性低等特点，在肿瘤治疗中得到广泛关注。其中，作为第一个近红外窗口的近红外光(nir-i，700-900nm)比可见光(400-700nm)具有更低的组织吸收度和更深的组织穿透性。第二个近红外窗口(nir-ii，1000-1700nm)显示进一步降低的光子吸收率，并显著增强成像深度和效率。然而，使用单一的ptt仍然有不足，这限制了ptt在肿瘤治疗中的应用。最近，ptt已经与常规癌症化疗相结合，以根除弥漫性微癌，并尽量减少肿瘤复发的可能性。此外，ptt可以触发抗癌免疫，从而提高化疗的效率。因此，开发用于ptt/化学联合治疗的近红外触发多功能纳米平台获得协同治疗效果是非常可取的。

2、奥沙利铂(oxaliplatin，oxa)属于二价铂类抗肿瘤药物，适应症广，抗肿瘤效果良好，已被广泛应用于多种恶性肿瘤的临床治疗。但是奥沙利铂靶向性差，有强烈的剂量限制性毒性，严重限制了其临床应用。奥沙利铂前药设计是提高铂类药物对肿瘤组织低选择性的一种非常有前景的方法，以减少对健康组织的影响，从而降低严重的毒副作用。因此，为了提高奥沙利铂在肿瘤治疗过程中的用药安全性，研究者们构建了一系列奥沙利铂前药纳米递药系统，有效的改善了奥沙利铂药物的靶器官分布特性，提高了其疗效并降低毒副作用。比如，有研究构建了二元协同的奥沙利铂前药纳米载药系统(bcpn)，该bcpn由两亲性奥沙利铂前药和nlg919的同源二聚体共同构成，bcpn具有ph/酶双重响应特性，在肿瘤组织中能够顺利释放奥沙利铂和nlg919，从而增强肿瘤化疗/免疫治疗效果。而且，该bcpn可高效蓄积到肿瘤组织，诱导肿瘤细胞发生icd效应并克服ido-1酶引起的免疫抑制，从而有效抑制乳腺癌的增长和肺部转移。然而，二价铂类(ii)药物对肿瘤组织具有低选择性，而四价铂类(iv)前药设计是提高二价铂类(ii)药物对肿瘤组织低选择性的一种非常有前景的方法，有利于减少对健康组织的影响，从而降低严重的副作用。

3、铁死亡(ferroptosis)是近年来新发现的一种细胞死亡方式，不同于其他类型的细胞死亡，铁死亡的过程中伴随着脂质过氧化物的累积和活性氧(reactive oxygen,ros)的产生铁死亡是一种以铁依赖性、脂质过氧化为特征的自噬性细胞死亡形式。在分子水平上，由于铁累积导致自由基、脂质过氧化物的生成，谷胱甘肽及谷胱甘肽过氧化物酶4活性的下降，造成细胞内氧化还原失衡和细胞膜严重损伤，导致细胞发生铁死亡。铁自噬与铁死亡的关系体现为：铁自噬正向调控铁死亡、铁死亡以潜在机制调控铁自噬。铁自噬是铁死亡的上游调控机制，铁自噬的过度激活会促进铁死亡的发生。铁自噬释放的铁不仅会与膜磷脂发生链式反应生成脂质过氧化物，还会与h2o2发生芬顿反应生成大量ros，造成严重的细胞损伤，诱导细胞铁死亡的发生。铁自噬作为铁死亡级联反应中的上游调控靶点，可通过影响自噬相关蛋白、ncoa4和铁蛋白水平来影响铁的释放量，进而影响铁死亡的发生。铁自噬与铁死亡关系密切，诱导或参与铁死亡的相关蛋白可潜在调控铁自噬通路。因此，铁死亡的研究不仅可以不断深化、丰富铁自噬的机制研究，还能潜在调控、影响自噬的激活程度及发展进程，从而对铁自噬全面深入的研究起促进作用。

4、近年来，采用多种治疗方式联合应用治疗恶性肿瘤的策略受到了越来越广泛关注，光热疗法联合免疫疗法对于肿瘤的杀伤作用不容忽视，已成为肿瘤联合治疗的重要手段之一。免疫疗法作为辅助癌症治疗手段，在肿瘤治疗领域亦取得了突破性进展。其中，在应用纳米递药系统治疗恶性肿瘤的过程中，表面电荷扮演了非常重要的角色。因此，电荷翻转型纳米递药系统在恶性肿瘤治疗中受到人们广泛关注。纳米递药系统在治疗肿瘤的不同阶段，其最适合的表面电荷也是不同的，例如在血液循环中，纳米递药系统的表面应带负电荷，这样不易与带负电的蛋白组分发生反应，从而减少被内皮网状系统的清除，提高纳米递药系统机体稳定性。在接近肿瘤组织时，表面带正电荷的纳米递药系统能够促进肿瘤细胞的胞吞作用，进而使其深入渗透到肿瘤组织的内部；在大面积地接触肿瘤细胞后，表面荷正电的纳米递药系统又能迅速被荷负电的肿瘤细胞所摄取，并能在进入溶酶体后通过“质子海绵效应”进行逃逸，从而将纳米递药系统释放到细胞质，发挥治疗作用。因此，在恶性肿瘤的治疗过程中，如果纳米递药系统到达肿瘤部位后能够响应性发生电荷翻转，表面带正电荷，有利于提高纳米递药系统的机体稳定性，并促进其被肿瘤细胞摄取，有利于发挥药物的最佳治疗效果。

5、综上，有必要构建一种集化疗/光热/免疫治疗于一体的联合递药系统，以解决奥沙利铂在肿瘤治疗中存在的靶向性差、毒副作用大等问题以及调整肿瘤微环境存在的免疫抑制情况。

技术实现思路

1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了一种ph响应电荷翻转纳米递药系统的构建方法，所构建的纳米递药系统在ph较低的肿瘤微环境中，能够发生电荷翻转，提高了纳米制剂在肿瘤细胞内的摄取效率，同时能够有效诱导肿瘤细胞发生铁死亡并诱导icd效应，并结合多巴胺的光热效应实现化疗/光热/免疫三重抗肿瘤作用。

2、为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

3、本发明第一方面提供了一种ph响应电荷翻转纳米递药系统的构建方法，包括以下步骤：

4、s1、将f127、da和oxa-da加入到乙醇/水混合液中，搅拌至溶液完全澄清后再加入tmb溶液，搅拌反应30-40min后再加入氨水，室温反应6-12h，得oxa-da nps；

5、s2、将oxa-da nps分散于有机溶剂中，再加入ltb(铁死亡诱导剂)溶液，搅拌到溶剂挥发至三分之一处后，得oxa-da-ltb nps(odl nps)；

6、s3、将oxa-da-ltb nps分散于tris缓冲液中，再加入多巴胺，避光反应2-4h后经离心洗涤得到oxa-da-ltb@pda nps(odlp nps)；

7、s4、将oxa-da-ltb@pda nps分散于tris缓冲液中，再加入pegh8-nh2，室温反应10-15h后经离心、洗涤、干燥即得ph响应电荷翻转纳米递药系统oxa-da-ltb@pda-pegh8 nps(odlp-pegh8 nps)。

8、奥沙利铂被da成功修饰后，由二价铂类药物转化成四价铂类药物，其体内稳定性得到极大提高，本发明利用奥沙利铂前药作为递送载体，制备共载奥沙利铂和铁死亡诱导剂的复合纳米体系，并在其表面成功修饰功能肽pegh8，得到的odlp-pegh8纳米递药系统具有ph响应的电荷翻转功能，大大增加了肿瘤细胞的摄取效率，除此以外，该纳米递药系统能够有效诱导肿瘤细胞发生铁死亡和icd，增强了对肿瘤细胞杀伤效应的同是，改善肿瘤组织免疫抑制现象，预防肿瘤的复发和转移。

9、优选地，s1中，所述f127、da、oxa-da、tmb溶液和氨水的用量比为：0.1-0.3g：40-50mg：4-6mg：140-170μl：350-450μl。

10、优选地，s1中，所述oxa-da在乙醇/水混合液中的浓度为4-6mg/10-50ml，所述乙醇/水混合液中乙醇和水的体积比为1:1。

11、优选地，s2中，所述oxa-da nps在有机溶剂中的浓度为7-15mg/6-13ml。

12、优选地，s2中，所述ltb溶液的浓度为0.4-0.6mg/ml，所述ltb溶液与有机溶剂的体积比为1:3：6:10。

13、s2中，所述有机溶剂包括(但不限于)乙醇。

14、优选地，s3中，所述oxa-da-ltb nps在tris缓冲液中的浓度为8-12mg/4-8ml。

15、优选地，s4中，所述多巴胺使用前先制成140-160mg/ml的多巴胺水溶液，所述多巴胺水溶液与tris缓冲液的体积比为40-60μl：4-6ml。

16、优选地，s4中，所述oxa-da-ltb@pda nps在tris缓冲液中的浓度为4-6mg/3-5ml，所述oxa-da-ltb@pda nps与pegh8-nh2的质量比为4:6：6:9。

17、优选地，s3、s4中，所述tris缓冲液的ph为8.0，浓度为8-12mm。

18、本发明第二方面提供了第一方面所述的构建方法制备得到的ph响应电荷翻转纳米递药系统。

19、本发明第三方面提供了第二方面所述的ph响应电荷翻转纳米递药系统在制备抗肿瘤药物中的应用。

20、优选地，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌。更优选地，所述肿瘤包括但不限于由4t1肿瘤细胞引起的乳腺癌。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

22、为了解决奥沙利铂在肿瘤治疗中存在的靶向性差、毒副作用大等问题以及调整肿瘤微环境存在的免疫抑制情况，本发明合成了多巴胺修饰的奥沙利铂前药(oxa-da)，利用oxa-da制备多孔纳米粒，将奥沙利铂镶嵌于纳米粒内部，提高了奥沙利铂在循环系统中的稳定性、改变机体组织分布并减少毒副作用。其次，将铁死亡诱导剂分散于纳米粒表面介孔内，并在纳米粒表面修饰ph敏感的功能肽pegh8，致使该纳米递药系统在肿瘤微环境中发生电荷翻转，增强纳米粒的摄取效率并实现细胞内溶酶体逃逸。该ph响应电荷翻转的纳米递药系统在肿瘤治疗中发挥一下功效：奥沙利铂作为作为常用的抗肿瘤药物具有较强的杀伤肿瘤细胞作用，结合光热治疗，增强肿瘤生长抑制的同时，有效诱导肿瘤细胞产生icd效应，进而产生抗肿瘤免疫应答，增强肿瘤免疫治疗效果；另外在纳米递药体系中载入铁死亡诱导剂，与奥沙利铂联合应用，发挥协同抗肿瘤作用，因此，该纳米递药系统有望发展作为新型抗肿瘤制剂用于恶性肿瘤的临床治疗。