一种ROS响应的仿生纳米囊泡的制备及在阿尔兹海默症治疗中的应用

本发明涉及生物医药，尤其涉及一种ros响应的仿生纳米囊泡的制备及在阿尔兹海默症治疗中的应用。

背景技术：

1、随着全球老龄化程度的加剧，与衰老密切相关的退行性疾病逐渐成为危害社会健康的一大严峻挑战。其中，阿尔茨海默病(alzheimer'sdisease,ad)作为典型的神经退行性疾病，主要特征表现为进行性认知障碍和记忆减退。国际阿尔茨海默病协会发布的《2021年世界阿尔茨海默病报告》显示，每3秒钟，全球就会有一位痴呆症患者产生。目前全世界约有5500多万痴呆患者，预计到本世纪中叶这一数字可能会增加到1.52亿以上，其中约70％为ad患者。目前该疾病每年造成的损失约为1万亿美元，预计到2030年这一数字将翻番。老龄化问题的不断加剧，使得ad的发病形势变得极为严峻。

2、由于ad发病机制的复杂性，人们提出了许多关于ad发病机制的假说，包括aβ级联假说、tau假说、胆碱能假说、神经炎症假说等。ad的病理特征主要表现为淀粉样版斑块淀粉样蛋白斑块(aβ)的沉积、磷酸化tau蛋白的聚集。沉积在脑实质中的细胞外斑块主要由淀粉样前体蛋白(app)衍生的淀粉样蛋白β(aβ)多肽组成，而nft则由神经元内聚集的过度磷酸化的tau蛋白组成。除了淀粉样蛋白的选择性沉积外，与小胶质细胞增生相关的神经炎症是许多神经退行性疾病的共同特征。迄今为止临床上无切实有效的ad治疗方法。没有一种药物能够阻止或者延缓ad病情的进展。因此，寻找新的ad药物靶点并研制靶向药物有着极其重要的经济和社会意义。

3、目前，使用乙酰胆碱酯酶抑制剂或n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂的临床治疗是姑息治疗选择，它们只能适度改善阿尔茨海默症患者的认知和行为，但不能减缓疾病的进展。已有一些研究利用aβ抗体治疗ad，但是由于效价不高以及难以穿越血脑屏障等问题，临床应用受限。因此，开发针对ad不同病理机制的治疗方法势在必行。

4、在ad中，小胶质细胞参与并调节神经炎症反应，实时监控周围环境，迁移并聚集到病灶部位，清除中枢神经系统中的aβ沉积和受损的神经元，从而改善ad症状，延缓进程。越来越多的证据支持髓样细胞中表达的触发受体2(trem2)介导的小胶质细胞功能维持在ad中起着十分重要的保护作用，因而trem2成为ad药物研发的新热门靶标。trem2是一种选择性表达于骨髓细胞(包括小胶质细胞)的膜蛋白。trem2的遗传变异和突变与早发性和迟发性ad相关。trem2通过其配体dap12(tyrobp)发出信号，调节小胶质细胞的关键功能，如代谢、增殖、存活、细胞因子释放和淀粉样斑块周围的积累。研究发现，提高trem2基因表达水平可重编程小胶质细胞反应性并改善阿尔茨海默病模型中的病理表型。同时有研究者开发了trem2激动型抗体在ad小鼠中显示了良好的治疗效果，可激活小胶质细胞吞噬斑块，改善小鼠认知功能。因此，激活trem2通路可能是治疗ad的一种有效选择。

5、β位淀粉样前体蛋白(app)裂解酶1(bace1)已被确定为大脑中淀粉样蛋白β(aβ)生成的中心启动子，这是ad的关键病理标志。然而，最近的研究提供的证据表明bace1在代谢调节中也起着至关重要的作用，通过sirna，在基因水平上敲低bace1酶，减少寡聚体aβ的产生，减少对神经元的进一步伤害，可以改善ad的症状。

6、基因治疗是治疗神经退行性疾病的一种重要的新兴策略，尤其适用于传统疗法无法治疗的经过充分验证的遗传靶点。现有的基因递送方法主要依赖于转基因技术或脑内注射病毒载体。这些方法遭受临床转化的不可避免的限制，例如遗传毒性、免疫或炎症反应以及患者不依从。

7、纳米技术和纳米医学的迅速发展，利用纳米材料其特有的物理、化学优势，包封药物或生物活性剂增强药物穿透血脑屏障的能力，使其在神经退行性疾病诊疗方面显示出广泛的应用前景。基因疗法与纳米技术的结合为克服这些障碍带来了一线希望。脂质体作为一种有效的纳米载体，在药物递送方面表现出高生物相容性、无毒性的特征，脂质体还具备良好的表面缀合能力，具有响应内部和/或外部刺激以可控地释放其有效负载的能力，可以封装药物并促进穿过血脑屏障(bbb)的靶向递送。外泌体作为携带蛋白质、脂质、rna、代谢物、生长因子和细胞因子的纳米级脂质双层封闭结构，是一种安全且多功能的天然膜性囊泡，进一步增强脂质体的载药性能，构建高负载率、性质稳定的脂质体纳米颗粒，实现小分子药物的精确脑部递送。ros响应性实现药物长途靶向递送，避免了在非特异性组织的积累和损失，保证了药物在病变位置的高度富集。

技术实现思路

1、为克服目前传统的抗ad药物由于效价不高和难以穿越血脑屏障的问题，以及解决单一药物可能无法达到足够的治疗效果和基因递送方法的上述缺陷，本发明提供了一种ros响应的仿生纳米囊泡作为联合给药系统，实现基因疗法与纳米技术的结合，并提供了其在神经退行性疾病治疗中的应用，具体
技术实现要素：
如下。

2、首先，本发明提供了一种ros响应的仿生纳米囊泡的制备方法，包括：

3、(1)将ang2多肽与dspe-se-se-peg-mal混合后反应，得到dspe-se-se-peg-ang2；

4、(2)将dspe-se-se-peg-ang2与dotap(2,3-二油酰基-丙基-三甲基铵-氯盐)、dppc(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、胆固醇溶于有机溶剂中，通过减压蒸发除去有机溶剂，得到脂质体膜；

5、(3)将所述脂质体膜与trem2质粒和bace1 sirna溶解于水相，在磷脂相变温度下，形成脂质体纳米颗粒；

6、(4)将所述脂质体纳米颗粒与外泌体混合后经挤压得到所述ros响应的仿生纳米囊泡。

7、本发明通过在脂质体纳米颗粒表面连接ang2多肽(angiopep-2)，同时将脂质体纳米颗粒与外泌体融合，使得制备的仿生纳米囊泡能够大幅提升穿透血脑屏障(bbb)的能力，从而协同提高基因治疗的给药效率。而且本发明选择trem2质粒和bace1 sirna作为负载药物组合，双管齐下，防止寡聚体aβ形成的同时，清除已经产生的毒性aβ斑块，减轻神经炎症，同时从源头上减少aβ斑块的形成以及清除已形成的毒性aβ斑块两条途径，最终保护海马神经元免受凋亡，协同发挥治疗或改善神经退行性疾病的作用。此外，本发明仿生纳米囊泡中dspe-se-se-peg-mal的“-se-se-”键，能够在h2o2(ros)环境下发生断裂，促使仿生纳米囊泡破裂、崩解，释放包封物质到目标位置，ros响应特性使得药物能在病变区域精准释放，进一步增加药物的疗效。

8、在一些实施方案中，所述ang2多肽的氨基酸序列为：tffyggsrgkrnnfkteeyc(seqid no.1)。angiopep-2(ang2)是一种多肽，能够通过血脑屏障上表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白(lrp)受体介导的内吞进入大脑。

9、优选地，所述外泌体为间充质干细胞外泌体。

10、在一些实施方案中，所述外泌体的制备方法包括：

11、通过差速离心法，提取间充质干细胞上清液中的外泌体，并利用western blot检测外泌体相关标记物(calnexin，cd9，cd63，cd81，hsp70，tsg101)，鉴定提取物质的成分，通过tem表征外泌体形貌。

12、在一些实施方案中，将所述脂质体膜与trem2质粒和bace1sirna溶解于水相，在磷脂相变温度下，制备成封闭的脂质体，然后将封闭的脂质体经过0.22μm的聚碳酸酯膜，形成脂质体纳米颗粒。

13、在一些实施方案中，步骤(3)具体包括：将所述脂质体膜与trem2质粒和bace1sirna溶解于水相，在磷脂相变温度下，脂质薄膜水化脱落，自组装形成封闭的脂质体，通过间断超声(优选地，超声3s间隔3s，持续时间5min)，并将脂质体经通过0.22μm的聚碳酸酯膜(优选3次)，形成脂质体纳米颗粒。

14、优选地，所述脂质体纳米颗粒的粒径大小在200nm以下。

15、优选地，ang2多肽与dspe-se-se-peg-mal的质量比为1：(1.5～2.5)。

16、本发明进一步发现，ang2多肽与dspe-se-se-peg-mal的质量比会同时影响到仿生纳米囊泡在ros环境下的药物释放效果以及仿生纳米囊泡穿透血脑屏障的能力，在上述配比下，能够使得两方面效果兼顾最佳。

17、优选地，以巯基化的ang2多肽为原料，通过michael加成反应得到dspe-se-se-peg-ang2。

18、优选地，dspe-se-se-peg-ang2、dotap、dppc、胆固醇的摩尔比为(2～4)：(18～22)：(12～18)：(28～32)。

19、优选地，所述有机溶剂为氯仿或无水甲醇。

20、和/或，所述磷脂相变温度为44℃～46℃。

21、优选地，所述脂质体纳米颗粒与外泌体按质量比(8～10):1。

22、在上述配比下，能够控制仿生纳米囊泡的粒径在合适的范围(130nm～140nm)，使得仿生纳米囊泡的均一性好，而且能够很好地平衡穿透血脑屏障的能力和载药能力；若粒径过大，虽然载药能力提高但是穿透血脑屏障的能力会下降；若粒径过小，虽然穿透血脑屏障的能力较好但是负载的药物过少，会影响药物的协同作用效果。

23、优选地，所述trem2质粒和bace1 sirna的体积比为(1.8～2.2)：1。

24、优选地，bace1 sirna的浓度为1～1.5nm；所述trem2质粒的浓度为0.5～1μg/ml。

25、本发明还发现，控制两种药物的体积比在上述范围内时，能够使得药物的负载率和包封率均能达到最高。

26、进一步，本发明提供了一种ros响应的仿生纳米囊泡，其由上述任一实施方案中的制备方法制得。

27、本发明提供的仿生纳米囊泡能够显著改善小胶质细胞的多种功能，具体体现在：促进炎症反应，抑制细胞凋亡，促进细胞迁移，并增加小胶质细胞对寡聚体aβ42的内吞和降解。

28、本发明提供的仿生纳米囊泡表现出积极的生物相容性、保护药物不被破坏、延长有效药物维持时间、降低药物的毒副作用等优点并可进一步功能化以实现安全、有效和组织靶向的传递，为神经退行性疾病的治疗提供一种新的途径。

29、进一步，本发明提供了一种药物组合物，包括：所述ros响应的仿生纳米囊泡以及药学上可接受的辅料或辅助性成分。

30、优选地，药学上可接受的辅料或辅助性成分为赋形剂、稀释剂、载体、调味剂、粘合剂或填充剂中的至少一种。

31、优选地，所述载体为生物体来源细胞分泌的外泌体或纳米材料杂合的不同功能载体。

32、进一步，本发明提供了上述任一制备方法、或所述的ros响应的仿生纳米囊泡在制备药物中的应用；所述药物用于治疗或改善神经退行性疾病。

33、优选地，所述神经退行性疾病包括阿尔兹海默症、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症或亨廷顿氏病中的至少一种。

34、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

35、本发明的仿生脂质体外泌体杂合纳米囊泡作为一种载药工具，在纳米囊泡包封、转载作用下，具有保护质粒等小分子物质不受运输途中酶降解、免疫细胞吞噬摄取等作用，实现在血液中的长途运输。此外，仿生脂质体、外泌体杂合纳米囊泡模拟细胞中磷脂双分子层的结构特性，依靠“相似相溶”的原理，促进细胞对包封物质的有效摄取。ros响应特性保证了药物能在病变区域精准释放，增加药物的疗效，且本发明的纳米囊泡具有无毒性、低刺激的作用，避免了对神经元的进一步损伤作用。

36、此外，本发明的仿生纳米囊泡通过上调trem2调控小胶质细胞从m1向m2极化的转变，促进小胶质细胞对aβ斑块的吞噬，下调促炎细胞因子。同时，sirna下调bace1的表达，从源头上减少了aβ斑块的形成，减轻了神经元的损伤。本发明提供了一个安全高效的非病毒基因传递系统，增加了trem2靶向基因治疗在临床应用的可能性，为ad治疗提供新方法。