一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用

本发明属于生物材料，具体涉及一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,ctcs)是从原发肿瘤或转移部位脱离并在循环血液中存活的癌细胞，血液样本中ctcs数量的检测在早期癌症的诊断、癌症治疗的评估和监测癌症的复发方面都有非常重要的临床意义，被认为是肿瘤的重要生物标志物。但是，ctcs在血液中丰度极低，每毫升血液中有1-100个ctcs、大约几百万个白细胞和几十亿个红细胞。这些巨大数量的红细胞和粘附性极强的白细胞作为非靶细胞干扰，给分离ctcs的灵敏度和纯度带来了许多困难。

2、目前，基于抗原-抗体结合或利用ctcs与血细胞之间的大小、可变形性、密度以及介电性质的差异，建立了多种ctcs分离平台。最常见的表面分子之一是上皮细胞粘附分子(epcam)。然而，肿瘤转移过程中发生上皮-间质转化，导致ctcs上皮抗原性丧失，从而大幅下调epcam的表达。因此，以epcam为目标的捕获效率大大降低，甚至出现假阴性结果。

3、苯硼酸是一种路易斯酸，常被用作糖类、糖蛋白和多巴胺的有效传感器。大量研究表明，硼酸可以与癌细胞上过表达的唾液酸的顺式二醇分子共价结合，形成五元或六元环硼酯。基于硼酯共价键的形成，硼酸修饰的材料被广泛用于捕获和分离含有二醇的生物分子和癌细胞。此外，与常用的抗体和适配体相比，唾液酸与硼酸具有广谱识别能力，适用于多种癌症的ctcs捕获。但是，现有技术中利用单一的苯硼酸结合位点捕获ctcs，导致ctcs的捕获率较低。

技术实现思路

1、针对现有技术中的不足之处，本发明提出一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用，与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸具有更多唾液酸的结合位点从而显著提高ctcs的捕获效率。

2、第一方面，本发明提供一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料，所述多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料为聚乙烯亚胺通过静电作用包覆在三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子表面，形成聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再在所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的表面通过酰胺反应接枝4-羧基苯硼酸得到的。

3、采用上述方案，使用无机聚阴离子三聚磷酸钠或多聚磷酸钠对四氧化三铁磁性纳米粒子进行了预处理。三聚磷酸钠或多聚磷酸钠可以使四氧化三铁磁性纳米粒子通过形成稳定的p-o-fe键，使四氧化三铁磁性纳米粒子表面带有强烈的负电荷。三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子更分散，更稳定，有利于与聚乙烯亚胺通过静电相互作用得到磁性纳米颗粒。

4、多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料以树突状聚乙烯亚胺功能化的磁性纳米粒子基体材料，表面修饰有硼酸配体。用于修饰的硼酸为含有羧基和硼酸基的化合物，优选为羧基苯硼酸，其分子结构中的羧基与氨基缩合成酰胺键，硼酸基可以与唾液酸中的糖基结合，树突状多位点的硼酸基团可以更灵敏的捕获ctcs。

5、第二方面，本发明提供一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

6、s1、将四氧化三铁磁性纳米粒子分散至三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液中，得到三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；

7、s2、将聚乙烯亚胺分散至酸性磷酸盐缓冲液中，得到聚乙烯亚胺溶液；

8、s3、向所述聚乙烯亚胺溶液中加入所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，反应后得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；

9、s4、将所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子与4-羧基苯硼酸通过酰胺反应得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。

10、进一步地，步骤s1中，所述四氧化三铁磁性纳米粒子与所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液中溶质的质量比为(10.8～11.3)：(0.9～1.1)；所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液的浓度为1.4～1.6mg/ml。

11、进一步地，步骤s2中，所述聚乙烯亚胺与所述酸性磷酸盐缓冲液加入量为1g：10～14ml，所述酸性磷酸盐缓冲液的ph为6.4～6.6。

12、进一步地，步骤s3中，所述聚乙烯亚胺溶液中的聚乙烯亚胺与所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的质量比为(4～6)：1。

13、进一步地，步骤s3为：

14、s31、向所述聚乙烯亚胺溶液中加入所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再加入酸性磷酸盐缓冲液，超声25～35min，得到混合溶液；

15、s32、将所述混合溶液于55～65℃条件下反应22～26h，得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。

16、进一步地，步骤s4为：

17、s41、将所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子于二甲基亚砜中超声，得到分散液；

18、s42、将4-羧基苯硼酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺溶解在二甲基亚砜中，在室温、黑暗条件下搅拌，得到活化混合液；

19、s43、将所述活化混合液加入到所述分散液中，在室温、黑暗条件下搅拌，得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。

20、进一步地，所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子、所述4-羧基苯硼酸、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和所述n-羟基丁二酰亚胺的质量比为(7～9)：(8～10)：(11～13)：(5～7)。

21、采用上述方案，通过形成稳定的p-o-fe化学键锚定在四氧化三铁磁性纳米粒子表面，使用三聚磷酸钠或多聚磷酸钠预处理获得了更分散，表面活性更好的三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，接着使用聚乙烯亚胺作为支架来扩增硼酸基团的数量以此来提供更多的ctcs结合位点。制得了具有快速磁响应性能的多位点树突状硼酸功能化的磁性纳米材料，与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸具有更多唾液酸的结合位点从而显著提高ctcs的捕获效率。

22、第三方面，本发明提供一种所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料或所述制备方法制得的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料在捕获循环肿瘤细胞中的应用。

23、采用上述方案，本发明的有益效果是：

24、本发明采用三聚磷酸钠或多聚磷酸钠对合成的四氧化三铁磁性纳米粒子进行了预处理。三聚磷酸钠或多聚磷酸钠可以与四氧化三铁通过形成稳定的p-o-fe键锚定在四氧化三铁磁性纳米粒子表面，使其分散性更好，表面活性更高，这有利于后续聚乙烯亚胺的包覆。

25、聚乙烯亚胺溶液的ph在6.5时，聚乙烯亚胺与三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的静电相互作用最强，包覆效果最好，分散性更好。

26、聚乙烯亚胺具有树突网状结构和丰富的氨基，它包裹三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子后再偶联4-羧基苯硼酸就可以形成多位点的树突状硼酸功能化磁性纳米材料，使唾液酸的结合位点显著增加，进而大大提高捕获率。聚乙烯亚胺携带大量的氨基，可作为支架来扩增硼酸基团的数量以此来提供更多的ctcs结合位点，与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸可以更灵敏的与ctcs过表达的唾液酸结合从而实现ctcs的高捕获率。