一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡及其制备方法和应用

本发明属于纳米制剂，具体涉及一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡及其制备方法和应用法。

背景技术：

1、胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，gbm)是一种原发性的恶性脑肿瘤，约占成人所有恶性脑肿瘤的50％，预后差，复发率高，死亡率高。gbm的治疗方式有手术切除、放射治疗和化学治疗等，但由于gbm呈弥漫性生长，手术切除后易复发，化疗和放疗不具有肿瘤特异性靶向，创伤范围广，全身毒性高等缺陷，限制了脑胶质瘤的疗效。血脑屏障(blood brain barrier，bbb)阻碍大部分的药物进入脑部，导致病灶部位有效药物浓度低，缺乏主动靶向和跨越bbb的能力极大地限制了化疗药物在胶质瘤的治疗。同时，gbm存在的治疗挑战还与脑胶质瘤细胞增殖迅速、侵袭广泛、高度耐药性和分子发病机制认识不足有关。因此，设计一种克服bbb和增加局部药物浓度的药物递送系统以实现精准靶向递送药物、避免剂量限制性全身不良反应、发挥治疗作用尤为重要。

2、砒霜是一种中药矿物药，主要成分为三氧化二砷(arsenic trioxide，ato)。在19世纪70年代，张亭栋制备中药砒霜注射液治疗白血病，并发明“癌灵一号”。目前，ato已被美国食品药品监督管理局通过成为治疗急性早幼粒白血病治疗的临床一线用药。在脑胶质瘤治疗方面，ato通过诱导坏死性凋亡和铁死亡、阻断细胞周期以及增强放疗和化疗的效果等多种机制来发挥其抗癌作用。但是，由于ato易被肾脏快速清除，其短半衰期、血脑屏障穿透性差、低靶向性、高度的亲水性等缺陷造成了其临床治疗的失败。因此，ato在胶质瘤治疗中受到严重限制，迫切需要开发一种新的递送策略来增加ato在脑胶质瘤部位的蓄积，并在保持高生物相容性的同时提高其治疗效果。

3、人参为“百草之王”，味甘微寒，具大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津安神之功效，应用范围广泛。已经从鲜人参中提取出人参来源细胞外囊泡(ginseng-derivednanoparticles，gdnp)，并分别对gdnp和鲜人参的总rna和蛋白质进行组学分析，结果表明gdnp中的蛋白质和rna与鲜人参大体一致，且其具有磷脂双分子层结构，具有进一步开发为兼具治疗作用的药物载体的潜力。研究表明，gdnp中含有人参皂苷rg1、re、rg3和rb1等多种抗癌活性成分，如人参皂苷rg3能够激活癌细胞内质网应激及自噬，进而诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡，人参皂苷rg1通过扰乱有丝分裂进程抑制癌细胞增殖。此外，gdnp可诱导肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associatedmacrophages，tams)极化为具有抗肿瘤作用的m1表型，增加细胞毒性t淋巴细胞浸润，使“冷肿瘤”转变为“热肿瘤”，改善机体免疫功能而起到抗肿瘤的作用。因此，将人参来源细胞外囊泡作为药物载体携带目标药物用于靶向治疗，既可利用其自身活性物质，又可主动或被动装载治疗药物起协同/互补作用。然而，人参来源细胞外囊泡缺乏对脑胶质瘤的靶向效应，仍需进一步的修饰与优化。

4、肿瘤细胞来源的外泌体(exosome，exo)对于tme的塑造发挥着重要的作用，其参与蛋白质、核酸和脂类等物质的细胞间交换、肿瘤迁移、肿瘤血管生成等多种生理病理过程。同其他exo一样，肿瘤细胞来源exo具有优异的载药能力，可以容纳疏水性和亲水性药物，具有延长血液循环半衰期以及高生物相容性等优点。其次，肿瘤细胞来源的exo与其起源细胞有相似的成分，具有同源靶向归巢效应，可作为靶向递药载体而无需靶向分子的修饰。此外，来源于肿瘤细胞的exo由于携带免疫刺激介质，参与肿瘤微环境的免疫调节，其可作为免疫佐剂和抗原应用于癌症疫苗中。然而，肿瘤细胞来源外泌体对肿瘤的发生发展的作用机制复杂，产率低且成本高。

技术实现思路

1、发明目的：针对上述技术问题，本发明目的是提供一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，另一目的是提供一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备工艺，将药物活性成分进行纳米化处理，同时对融合囊泡进行表面修饰，充分利用融合囊泡内部载体空间，发挥其精准靶向病灶部位的作用，实现化疗、免疫治疗的多模式治疗。本发明提供的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，人参来源细胞外囊泡具有优越渗透性，同时其含有人参皂苷在内的多种有效成分，发挥免疫协同效应，促进胶质瘤微环境由“冷”转“热”；肿瘤细胞来源exo具有同源靶向归巢能力，能够实现药物在胶质瘤病位的精准递送；以两者为来源，构建融合囊泡，实现给药部位高效渗透，病灶部位精准靶向，相得益彰，共克鼻腔给药递送困境。此外，在融合囊泡表面修饰冰片，可提高载体的黏膜渗透性并实现脑胶质瘤的靶位浓集。到达病灶部位后，ato通过阻滞细胞周期，诱导坏死性凋亡等多种途径发挥化学治疗作用。随后，ato能够最大限度地提高肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡效率，使得大量损伤相关分子模式暴露，激活抗原提呈细胞，进而促进cd8+t细胞等免疫细胞在肿瘤病灶处的浸润；此外，gdnp促进巨噬细胞向抑瘤m1表型极化，进而重塑肿瘤微环境，增敏免疫效应。gdnp与ato联用，化疗协同免疫治疗，在杀伤胶质瘤细胞的同时，共奏肿瘤免疫抑制微环境重编程之功，逆转脑胶质瘤免疫抑制微环境，防止脑胶质瘤复发。

2、技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

3、一种冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡，所述融合囊泡是由人参来源细胞外囊泡与肿瘤细胞来源外泌体融合形成的融合囊泡作为外壳包载纳米形式的药物内核，进一步经过冰片修饰所形成的。

4、优选的，所述人参来源细胞外囊泡的制备方法包括如下步骤：将新鲜人参洗净，榨汁，通过差速离心去除细胞碎片及游离蛋白质聚集体，得到人参粗提液，于蔗糖梯度溶液条件下超速离心，后于碘克沙醇密度梯度离心中纯化，重悬，即得。

5、优选的，所述肿瘤细胞来源外泌体选自胶质瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞来源外泌体中的一种或几种，但不局限于这些来源。

6、优选的，所述纳米形式的药物内核为共聚物及化疗药物、光敏剂、诊断试剂等构成的复合物。

7、进一步优选的，所述共聚物优选自聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(plga)、甲基聚乙二醇(mpeg)、聚乳酸(pla)、聚三亚甲基碳酸酯(ptmc)、聚乙二醇甲醚-聚乳酸-聚甘醇酸共聚物(mpeg-plga)中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述化疗药物选自三氧化二砷、替莫唑胺、紫杉醇、阿霉素、姜黄素、顺铂中的一种或几种，但不局限于这些物质；所述光敏剂选自protoporphyrin ix(ppix)、indocyanine green(icg)、chlorin e6(ce6)中的一种或几种，但不局限于这些物质。

8、本发明还提供了所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，主要包括：纳米形式的药物内核的制备，肿瘤细胞来源exo的提取及分离，人参来源细胞外囊泡的提取及分离，融合囊泡的制备，纳米形式的药物内核的荷载，冰片的修饰。

9、所述的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡的制备方法，包括如下步骤：

10、(1)制备纳米形式的药物内核；

11、(2)采用超高速离心法提取、分离获得肿瘤细胞来源exo；

12、(3)采用密度梯度离心法提取、分离及碘克沙醇密度离心法纯化人参来源细胞外囊泡；

13、(4)取步骤(2)所得exo和步骤(3)所得人参来源细胞外囊泡混合，聚乙二醇诱导、超声破碎、反复冻融、挤出或孵育，得融合囊泡；

14、(5)将步骤(1)所得纳米形式的药物内核与步骤(4)所得融合囊泡混合，超声、挤出和孵育，制得共载药物内核的融合型囊泡；

15、(6)将步骤(5)所得共载药物内核的融合型囊泡通过共价结合方式表面修饰冰片；

16、(7)除去游离药物，即得。

17、优选的：

18、步骤(1)中，所述纳米形式的药物内核的制备方法，包括如下步骤：含药物的内水相制备，含乳化剂的外水相制备，含载体材料的油相制备，加入乳化剂进行乳化，干燥，透析纯化，即得。

19、步骤(4)中，肿瘤细胞来源exo和人参来源细胞外囊泡以蛋白含量计，所述肿瘤细胞来源exo和人参来源细胞外囊泡质量比为1:(1-5)，所述超声破碎时间为5-10min。

20、步骤(5)中，所述融合囊泡和药物内核质量比为5:(1-5)，所述超声时间为5-10min，孵育时间为1-2h。

21、步骤(6)中，所述融合囊泡与冰片的质量比为10:(1-3)。

22、本发明最后提供了所述冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡在制备抗肿瘤或脑部疾病治疗药物、肿瘤或脑部疾病诊断试剂中的应用。应用时，或加生理盐水、或磷酸盐缓冲液、或5％葡萄糖溶液溶解，以鼻腔给药、或静脉注射、或原位注射、或口服给药，该融合囊泡能够荷载多种模型药物，实现多模式诊疗平台的构建，且能够改善药物的生物分布，提高生物利用度，增强药物在病灶部位的渗透与聚集。

23、本发明利用人参来源细胞外囊泡的抗肿瘤药效作用及肿瘤细胞来源exo的同源靶向性，通过膜融合的方式构建融合囊泡，该融合囊泡兼具两者优势，不仅能够实现药物精准靶向递送到肿瘤病灶，而且保留了人参来源细胞外囊泡的抗肿瘤中药有效组分。载药融合囊泡经多途径被肿瘤细胞选择性摄取后，能够通过化疗联合免疫治疗高效杀伤肿瘤，制备过程中不需添加其他辅料，实现了中药制剂的药辅合一。

24、本发明利用融合囊泡的亲水性及疏水性多重载药空间，包载化疗药物、光敏剂或诊断剂，实现多模式诊疗，同时提高药物的生物利用度，降低药物的不良分布及毒副作用，尤其是中药毒性成分递送，充分发挥其“增效减毒”作用。

25、本发明利用共价修饰方法，将芳香开窍代表药冰片修饰于融合囊泡表面，赋予该融合囊泡更强的渗透性，提高融合囊泡屏障穿透能力，进一步增强药物在病灶部位有效渗透和蓄积，从而改善药物穿透性差、靶向性差的递送弊端。

26、本发明通过将化疗药物包覆于聚合物中，制备纳米形式药物内核，并将其包载入冰片修饰的融合囊泡中。在解决药物半衰期短弊端的同时，提高了药物的包封率与载药量、改善了药物的生物分布及生物利用度。特别地，降低了毒性药物对正常组织的毒副作用，提高了给药安全性。同时多模式载药空间为多种性质的药物提供了装载策略，可有效改善单一治疗模式的局限性，实现疾病诊疗同步。此外，冰片修饰赋予融合囊泡高渗透性，实现药物强效渗透，高效浓集。其具备以下优势：

27、(1)高生物安全性：利用人参来源细胞外囊泡与肿瘤细胞来源exo融合，所得融合囊泡保留了两者的天然特性，具有低免疫原性、高生物安全性的特点；

28、(2)精准靶向性：经鼻递送策略联合肿瘤细胞来源exo归巢效应，赋予该递送系统鼻-脑肿瘤部位级联精准递送特性；

29、(3)高药物渗透性：融合囊泡表面修饰芳香开窍药代表成分冰片，通过调控粘膜表面特定蛋白表达发挥促渗作用，进而实现药物高效递送及靶位浓集；

30、(4)载药模式及治疗模式多元化：由于具有双分子层结构，融合囊泡能够装载不同性质的模型药物，允许化疗药物、成像剂/光敏剂、中药活性成分等的共递送，实现多模式协同治疗及诊疗一体化平台的构建；

31、(5)低毒副作用：药物经融合囊泡包载，提高其包封率及载药量的同时，解决其溶解性差、半衰期短的递送问题，同时赋予其精准靶向病灶部位能力，融合囊泡通过降低用量、解决递送问题、改善分布多维度降低药物毒副作用；

32、(6)载体治疗协同作用：人参来源细胞外囊泡中含多种有效组分，作为药物递送载体的同时，能够与药物互补/协同增效。

33、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：

34、(1)本发明采用物理融合的方法直接将药物与聚合物复合，条件温和、操作简单、成本低廉、可实现工业化生产；

35、(2)本发明提供的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡具有归巢效应，实现精准靶向效果；

36、(3)本发明提供的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡能够通过选择不同功能的药物(如化疗药物可实现化疗、光敏剂可实现光动力治疗/光热治疗、成像剂可实现病灶部位诊断、中药活性成分可实现免疫治疗等)与融合囊泡共递送，从而实现疾病诊断、疾病治疗等不同目的，为疾病的多模式治疗提供新的研究思路；

37、(4)本发明提供的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡实现了药物的高包封率和载药量，并对其进行促渗剂修饰，显著提高药物的生物安全性和屏障穿透能力，实现了药物在病变部位的精准递送和靶位浓集。

38、本发明提供的冰片修饰精准递药的人参融合型囊泡可用于治疗作用药物(包括化疗药物、中药活性成分、光敏剂等)及成像作用药物的高效递送，该融合型囊泡递送平台具有高生物安全性、精准靶向性及高负载能力。载药模式多元化使其药物选择广泛，能够同时实现肿瘤诊断及肿瘤治疗，并具备多模式协同治疗潜力，能够较好的满足临床肿瘤治疗的需要。本发明为多功能仿生型纳米囊泡递送平台在肿瘤中的应用提供了新的研究案例，具有广阔的临床转化潜力。