基于PP7RNA茎环结构的高效VLP载体及其用于递送mRNA的制作方法

本发明属于基因工程领域，具体涉及基于pp7 rna茎环结构的高效vlp载体及其用于递送mrna。

背景技术：

1、vlp(virus like particle)技术来源于慢病毒系统，可利用病毒的高亲嗜性特性实现有效的细胞内递送，递送对象可为核酸、蛋白质或者核糖核蛋白(rnp)等。但是病毒在递送核酸时，多数以dna形式递送，且慢病毒所递送的dna存在基因组随机插入的情况，因此在递送crispr/cas9系统时，cas9蛋白基因在体内存在时间较久，持续翻译成cas9蛋白，会导致较大机率的“脱靶”效应(与原设计的基因剪切效应无关的基因剪切)。在实际临床应用中，可将cas9以mrna或蛋白的形式瞬时递送到人体中，以达到治疗目的同时大幅降低脱靶效应。

2、mrna递送对于疫苗开发、基因治疗等领域至关重要，在生物医学领域具有广泛的应用前景，但其在实际应用中仍面临一些限制：(1)mrna的稳定性问题，mrna是一种非常不稳定的分子，容易被细胞内的核酸酶降解。(2)递送载体的选择，选择合适的递送载体对于mrna递送至关重要。目前常用的递送载体包括脂质纳米粒子(lnps)、聚合物纳米粒子等。这些载体需要具备良好的生物相容性、低免疫原性和高效的递送效率。然而，现有的递送载体在这些方面仍存在不足，如lnps可能引起免疫反应，聚合物纳米粒子可能难以穿透细胞膜等。(3)靶向递送，mrna递送需要实现精准靶向，即将mrna递送到特定的细胞或组织中。然而，目前的递送系统往往难以实现这一目标，导致mrna在递送过程中可能被非靶细胞摄取，降低治疗效果并增加副作用风险。因此，为了在体内发挥作用，mrna需要安全、有效和稳定的递送系统，以保护mrna免受降解，并允许其被细胞摄取以及在细胞内释放。同时，其安全性、有效性和递送效率等方面的挑战也需要进一步研究和解决。

3、pp7噬菌体衣壳蛋白(pp7 coat protein,pcp)是噬菌体pp7的重要组成部分，它在噬菌体的结构和功能中扮演着关键角色，具有保护核酸、参与感染过程、作为展示平台等多种功能。pcp是一种小型的蛋白质，能够特异性地识别并结合某些茎环rna分子(pp7 rna)。

4、现有技术中并未公开基于pp7 rna茎环结构的高效vlp载体及其用于递送mrna的研究。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明将噬菌体衣壳蛋白和茎环结构进行组合，获得特异性结合和递送效率很高的pcp-pp7 rna组合，提高vlp载体的mrna递送效率和crispr-cas9编辑效率。

2、一方面，本发明提供了pp7 rna茎环结构在制备递送rna中的用途，所述的用途包括但不限于：

3、(1)在实现基因编辑和基因治疗药物中的用途；

4、(2)在携带表达肿瘤抗原和病毒抗原的rna用于制备疫苗中的用途；

5、(3)在表达细胞重编程因子用于制造多能干细胞中的用途；

6、(4)在表达细胞重编程因子用于改造细胞功能中的用途；

7、(5)在递送嵌合抗原受体rna用于制备细胞免疫治疗药物中的用途。

8、具体地，所述的rna包括但不限于：mrna、grna、sirna、mirna、aso、rrna或多种非编码rna。

9、进一步具体地，所述的rna可以是mrna或grna。

10、优选地，所述的rna可以是mrna。

11、具体地，所述的pp7 rna茎环结构的数量为5-8。

12、优选地，所述的pp7 rna茎环结构的数量为6-7。

13、进一步优选地，所述的pp7 rna茎环结构的数量为6。

14、又一方面，本发明提供了一种慢病毒样颗粒，所述的慢病毒样颗粒包括pp7rna茎环结构。

15、具体地，所述的慢病毒样颗粒的包装质粒可以包括pcmv-cas9-pp7 rna质粒、plv-egfp-u3-sp.grna质粒、pmdlg/prre-d64v、pcp-ph-gag-pol-d64v、pmd.2g和prsv-rev；

16、所述的pcmv-cas9-pp7 rna质粒上pp7 rna的数量可以是5-8；

17、所述的plv-egfp-u3-sp.grna质粒上的grna序列为：seq id no.3；

18、所述的pmdlg/prre-d64v质粒pol区域的integrase基因的64位氨基酸d突变为v；

19、所述的pcp-ph-gag-pol-d64v质粒上pcp-gag-pol基因序列为seq id no.2。

20、优选地，所述的pp7 rna的数量可以是6-7。

21、进一步优选地，所述的pp7 rna的数量为6。

22、具体地，所述的pcmv-cas9-pp7 rna质粒上cas9-6×pp7 rna基因序列seq idno.1。

23、又一方面，本发明提供了一种慢病毒样颗粒的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：

24、s1、质粒构建；

25、s2、转染和感染细胞；

26、s3、去除残留质粒；

27、s4、vlp浓缩。

28、具体地，所述的质粒包括pcmv-cas9-pp7 rna质粒、plv-egfp-u3-sp.grna质粒、pmdlg/prre-d64v、pcp-ph-gag-pol-d64v、pmd.2g和prsv-rev；

29、进一步具体地，所述的pcmv-cas9-pp7 rna质粒上pp7 rna的数量可以是5-8；

30、优选地，所述的pp7 rna的数量可以是6-7。

31、进一步优选地，所述的pp7 rna的数量为6。

32、更进一步优选地，所述的pcmv-cas9-pp7 rna质粒上cas9-6×pp7 rna基因序列seq id no.1。

33、进一步具体地，所述的plv-egfp-u3-sp.grna质粒上的grna序列为：seq id no.3。

34、进一步具体地，所述的pmdlg/prre-d64v质粒pol区域的integrase基因的64位的天冬氨酸突变为缬氨酸。

35、进一步具体地，所述的pcp-ph-gag-pol-d64v质粒上pcp-gag-pol基因序列为seqid no.2。

36、又一方面，本发明提供了前述的慢病毒样颗粒在制备递送rna中的用途，所述的用途包括但不限于：

37、(1)在实现基因编辑和基因治疗药物中的用途；

38、(2)在携带表达肿瘤抗原和病毒抗原的rna用于制备疫苗中的用途；

39、(3)在表达细胞重编程因子用于制造多能干细胞中的用途；

40、(4)在表达细胞重编程因子用于改造细胞功能中的用途；

41、(5)在递送嵌合抗原受体rna用于制备细胞免疫治疗药物中的用途。

42、具体地，所述的rna包括mrna、grna、sirna、mirna、aso、rrna或多种非编码rna。

43、进一步具体地，所述的rna可以是mrna或grna。

44、优选地，所述的rna可以是mrna。

45、本发明所取得的技术效果：

46、(1)在相同vlp感染剂量的条件下，pcp和pp7 rna组合的编辑效率显著高于ms2c和stem loop的组合。

47、(2)本发明的技术方案大大降低了传统慢病毒递送的“脱靶效应”的风险。

48、(3)本发明的技术方案提高了现有vlp载体的递送效率低的弊端，开发了一种相对更高效瞬时表达的递送载体。