专利名称:自主神经调节剂及其保健饮食品的制作方法
发明领域本发明涉及一种适于以低剂量给药肌肽的组合物(即低剂量药物)。
当交感神经的活性系统性地增强时，可以促进激素分泌、引起心率及血压增加、细支气管膨胀、肠蠕动及分泌受到抑制、糖代谢加强、瞳孔扩大、毛发竖立、皮肤及内脏血管收缩以及骨骼肌的血管扩张(“生物体内的调节系统”，录于Iwanami Koza《基础现代医学(Gendai Igaku-no Kiso)》第4卷，1999年，Toshio Hagiwara和Seiichi Tarui编纂)。因此，当交感神经系统的活性增强时，健康就受到干扰，出现如高血压、高血糖、皮肤血液循环减少、免疫功能下降等现象。另一方面，当副交感神经系统的活性增强时，将发生慢性便秘。
目前，这些健康障碍都是根据疾病和症状进行对症治疗，一直没有可对自主神经系统活动本身的根本原因进行调控的方法。对症疗法事实上只能暂时改善疾病的状况，停止药物治疗将导致疾病的复发，如果继续药物治疗，由于相同的被扰乱的失衡，在许多情况下将会产生其它疾病。因此，人们一直需求可对自主神经活动本身的根本原因进行调控的药物或食品。
L-肌肽(β-丙氨酰-L组氨酸，下文中称为肌肽)是在20世纪从骨骼肌中发现的一种二肽，其在各种脊椎动物的骨骼肌中以高浓度(1-20mM)存在(Nippon Rinsho 47476-480，1989)。如同其它含组氨酸的二肽例如鹅肌肽和高肌肽一样，肌肽是生物体内的水溶性抗氧化剂(Cariballa SE和SinclairAJ，Age Ageing，29207-210，2000)，其中鹅肌肽和高肌肽的抗氧化作用较强，肌肽次之(Kohen R等，Proc.Natl.Acad.Sci.853175-3179，1988)。肌肽通过阻止膜内脂质的过氧化或者消除超氧化物阴离子实现其稳定细胞膜的功能(Boldyrev AA等，Mol.Chem.Neuropath.，19185-192，1993)。
已知肌肽不仅是一种抗氧化剂，也是一种神经递质、一种酶活力调节剂和金属离子螯合剂(Cariballa SE和Sinclair AJ，Age Ageing，207-210，2000)。还证实肌肽具有生理学上的作用，如抗衰老作用(Bioscience Report，19587-587，1999)、伤口愈合作用(Roberts PR等，Nutrition 14266-269，1998)、对离体血管的血管扩张作用(Ririe DG等，Nutrition 16168-172，2000)等。基于上述多种生理学上的作用，肌肽一直用于治疗类风湿性关节炎和其它多关节炎、十二指肠溃疡和胃溃疡、与拔牙和牙周病有关的炎症、不宜手术的肿瘤等(Quinn PJ等，Mol.Aspects Med.，13379-444，1992)。
已证实，作为用肌肽治疗糖尿病的并发症和病因的方法，摄取2％肌肽水溶液可有效的治疗兔子的动脉粥样硬化和白内障。在本发明的实施例中，对于兔子的肌肽剂量为800mg/kg体重/天或者更高(口服)。
据记载(日本PCT专利申请(公表)号11-505540)，含有肌肽或其衍生物和其支链氨基酸的具有抗氧化活性的药物组合物和/或营养学组合物，可以通过向大鼠给予0.75％肌肽水溶液来阻止其内脏中脂质过氧化物的形成。在本发明中，肌肽的给药量为300mg/kg体重/天或更高(口服)。
一种含有肌肽的锌盐作为活性成分用于治疗胰腺炎的治疗剂(专利号2777908)，以100mg/kg体重/天或更高的剂量向大鼠口服给药。
为了达到保护肝功能及促进应激相关性物质代谢的效果(NipponSeirishi 5222l-228，1990)，向大鼠给予250mg/kg体重/天或更高的剂量(口服给药)，向大鼠和小鼠给予100mg/kg体重/天或更高的剂量(非肠道给药)。因此，当给予100mg/kg体重/天或更高剂量的肌肽时，证实了肌肽在动物实验中所表现出来的生理学作用。
另一方面，据记载，为达到促进铁吸收的效果，必须向人类口服给药50mg到5g/天剂量的肌肽(日本待审专利公开号7-97323)。
此外，当肌肽作为一种预防剂和治标剂而用于治疗因红血球数量减少而引起的医学症状时，需要向人类给药50mg到5g/天(口服给药)或者5-500mg/天(非肠道给药)的剂量。同样的，为了达到肌肽在提高学习能力上的效果(日本待审专利公开号9-20661)，也需要向人类给药50mg到5g/天(口服给药)或者5-500mg/天(非肠道给药)的剂量。因此，要使肌肽显示出其已经证实的对于人类的生理学作用，在任何情况下，在口服给药时均需要摄入50mg/天或更高的剂量。
因此，尽管人们已经更清楚的明白了肌肽具有一系列的生理学活性，它的作用机理是以抗氧化剂作用(Kohen R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.853175-3179，1988)或金属螯合作用(Chem.Lett.88335-338，1988)为基础的，但是肌肽的剂量却根本没有减小。由此，根据迄今为止所作的报道，要使肌肽显示出其对动物的生理学作用，需要摄入100mg/kg体重/天或者更高的剂量，若要使肌肽显示出其对人的生理学作用，在口服给药的情况下需要摄入50mg/天或者更高的剂量。
如上所述，尽管报道了肌肽具有各种作用，但人们只关心其对不同疾病状态的对症治疗的效果，并且均给药大剂量的肌肽，并没有报道指示说摄取低剂量的肌肽能在调控自主神经的活性中起作用。
为了解决上述问题，发明人注意到了一种鸡精(chicken essence)，该鸡精是由Brand先生，160多年前英国白金汉宫的一名厨师，为了维持皇室家族的健康而制得的。
近年来，对鸡精的功效及其促进基础代谢的作用进行了科学的研究(Nutr.Report Int.39547-556，1989)并报道了其对精神疲劳的恢复效果(Appl.Human Sci.15281-286，1996)。
通过双沸腾方法(将整只鸡煮沸两次)汽提出鸡精中的脂肪，在鸡精中含有大量的氨基酸、肽和蛋白质。作为富含氨基酸、肽和蛋白质的饮食品，已知有胶原蛋白、大豆肽等。作为该鸡精的特征组分，其中有来自于鸡的肌肉中的肌肽和鹅肌肽。本发明的发明人研究了肌肽对自主神经系统的作用。
我们发现，当向大鼠静脉内给药肌肽时，低剂量的肌肽便能抑制交感传出神经(支配肾上腺、肝脏和肾脏的交感神经)的神经活性，并同时激活副交感传出神经(支配腹腔的迷走神经)的神经活性。
如果肌肽直接作用于自主神经系统的活性，预期肌肽对自主神经的直接作用将会影响生物调节机制，诸如调控血糖水平、调控血压、调控胃液分泌、调控体温等。也就是说，既然肌肽对于自主神经系统活性的直接作用是抑制交感神经系统的活性和促进副交感神经系统的活性，则其在调控血糖水平时应该是向着降低血糖的方向起作用的，而在调控血压时是向着降低血压的方向起作用的。
同样，由于肌肽可以促进副交感肝脏神经(迷走神经)的活性，它必将会促进肝脏中葡萄糖的摄取，从而导致血糖水平的降低。同样，由于肌肽抑制了交感肝脏神经的活性，其必将会抑制葡萄糖向血液中的释放，从而导致血糖水平的降低。此外，由于肌肽可以抑制副交感肾上腺神经的活性，它将会抑制肾上腺素的分泌，这样便能抑制高血糖。
即，作为使肌肽在低剂量下直接作用于自主神经系统的结果，预期血糖水平将会降低。该结果在一项实验中得到了证实，在该实验中，将肌肽以低剂量向2-去氧-D-葡萄糖(2DG)高血糖大鼠(一种能显示由交感神经活性增强导致的高血糖的动物模型)腹膜内给药，用以研究肌肽的降血糖作用，结果表明，正如所预期的，低剂量的肌肽具有降低血糖水平的作用。高剂量的肌肽则没有该活性。因此，只有当肌肽以一定的低剂量摄入时，才能观察到肌肽对自主神经系统的调控作用。
和肌肽一样，鹅肌肽也是一种含有组氨酸的二肽，它是肌肽的甲基化产物，即，在肌肽咪唑环的1位发生了甲基化。所以，为了研究降血糖作用是否是肌肽所特有的，我们检验了鹅肌肽的降血糖效果。结果是，在鹅肌肽中没有发现任何降血糖效果。因此证实肌肽在低剂量下的降血糖效果是肌肽所特有的。
接着，研究了肌肽通过调控自主神经系统而降低血糖的作用对于链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠(在这些大鼠中，由于胰腺β细胞的破坏抑制了其胰岛素原生物合成)是否也有效。在进行口服葡萄糖耐量试验的STZ糖尿病大鼠中，证实低剂量的肌肽能显示其降低血糖水平的效果。因此，我们确信，在胰岛素分泌不足的STZ大鼠中，肌肽可以通过提高副交感肝脏神经(迷走神经)的活性而促进肝脏中葡萄糖的摄取，从而导致血糖降低，因此，证实了肌肽在低剂量时具有抗糖尿病的效果。
此外，由于肌肽在低剂量时能抑制交感肾上腺神经的活性，肾上腺素的分泌也将受到抑制，且由肾上腺素导致的心输出量的增加也将被抑制，其结果将是使血压降低。因此，用醋酸去氧皮质酮(DOCA)-盐型高血压大鼠检测了低剂量肌肽的降血压效果，结果证实，用含有低剂量肌肽的食物喂养的大鼠血压有所降低。
根据这些动物实验，我们认为肌肽可以对人类自主神经系统的活性产生类似的效果。因此，用Science，213220-222，1981中描述的方法检测了心脏自主神经系统的活性，在该方法中，记录人类心脏的心电图(ECG)并测量ECG中R波的间距(R-R间期)，之后对心率变化进行图谱分析。结果发现，口服摄取低剂量的肌肽能促进心脏副交感神经系统的活性，且此时总的自主神经系统活性要低于副交感神经活性的提高度，因此我们发现低剂量的肌肽也能抑制人类交感神经系统的活性。
根据这些结果，本发明的发明人在动物试验中发现了肌肽对自主神经系统的调控作用，即肌肽在低剂量时抑制交感传出神经的神经活动并促进副交感传出神经的神经活动。同样的，由于肌肽在低剂量时显示有调控自主神经系统的作用，人们确信其能通过控制高血糖和高血压动物模型的自主神经系统而对血糖水平和血压的调控起作用。此外，发明人还发现肌肽在低剂量时具有调控人类自主神经系统的作用，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种具有调控自主神经系统作用的组合物，所述组合物含有一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
本发明的组合物具有调控自主神经系统的作用，其能预防、改善或者缓解自主神经系统的紊乱以及由此引起的疾病状况，所述组合物含有一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。本发明的组合物还具有改善由交感神经活动增强所致的自主神经系统紊乱而引起的高血压或者高血糖症状的作用。
本发明组合物可以是一种药物组合物或是饮食品。
本发明还提供一种调控自主神经系统的方法，该方法包括摄取一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。这是一种预防、改善或者缓解自主神经系统的紊乱和由此引起的疾病状况的方法，其可抑制交感神经系统的兴奋并促进副交感神经系统的活性，该方法包括摄取一定量的肌肽使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
此外，本发明还提供了肌肽用于制备调控自主神经系统的组合物的用途，其中，需摄取一定量的肌肽以使每次摄入的肌肽的量为0.7μg/kg到0.09mg/kg。本发明的用途是指肌肽在制备用于预防、改善或者缓解自主神经系统的紊乱和由此引起的疾病状况的组合物中的用途，以及肌肽用于抑制交感神经系统的兴奋及促进副交感神经系统的活性的用途，其中，摄取一定量的肌肽以使每次摄入的肌肽的量为0.7μg/kg到0.09mg/kg。
所述组合物的具体实例包括每片含有例如0.04到5mg肌肽的片剂、每粒含有例如0.04到5mg肌肽的胶囊、每一容器中含有例如0.04到5mg肌肽的饮料或果汁、每包含有例如0.04到5mg肌肽的散剂或颗粒剂、以及每片含有如0.04到5mg肌肽的食品例如蛋糕、饼干或面包。
可以摄取一种或多种上述这些组合物以使肌肽的摄取量达到具有调控自主神经系统效果的量，即人类每次的摄取量不超过0.1mg/kg体重。这些组合物每片片剂、每一容器、每一包装或每片食品可以含有0.04mg或者更少的肌肽。在这种情况下，可以摄取多种组合物而使肌肽的每次摄取量在人类中不超过0.1mg/kg体重。
图2表示肌肽对大鼠交感神经肝脏分枝的传出神经活性的抑制效果。
图3表示肌肽对大鼠交感神经肾脏分枝的传出神经活性的抑制效果。
图4表示肌肽对大鼠迷走神经腹腔分枝的传出神经活性的促进效果。
图5表示肌肽腹膜内给药对2DG高血糖大鼠血糖水平升高的抑制效果。
图6表示肌肽颅内给药对2DG高血糖大鼠血糖水平升高的抑制效果。
图7表示肌肽颅内给药对进行口服葡萄糖耐量测试的STZ糖尿病大鼠血糖水平增加的抑制效果。
图8表示肌肽腹膜内给药对进行口服葡萄糖耐量测试的STZ糖尿病大鼠血糖水平增加的抑制效果。
图9表示摄取含肌肽的食物对DOCA盐型高血压大鼠的抑制效果。
图10表示肌肽对人类副交感神经活性的促进效果。
低剂量肌肽对自主神经系统的作用通过可以直接测量出自主神经活性的实验方法(Nippon Rinsho 48150-158，1990)在大鼠中进行研究。该实验方法的特征在于可以单独测定肌肽对于控制各器官的自主神经系统的神经活性的影响。由于自主神经系统负责血糖水平的调控、血压调控、胃液分泌调控、体温调控等(“生物体内的调节系统”，录于Iwanami Koza《基础现代医学(Gendai Igaku-no Kiso)》第4卷，1999年，Toshio Hagiwara和Seiichi Tarui编纂)，通过直接调控自主神经的活性可以对生物体的这些调控机制进行调节。
首先，在低剂量肌肽对交感神经肾上腺分枝的传出神经活性的影响的实验中，向每只大鼠静脉内100ng(0.00033mg/kg体重)的肌肽抑制了交感神经肾上腺分枝的传出神经活性(图1)。
然后，在低剂量肌肽对交感神经肝脏分枝的传出神经活性的影响的实验中，向每只大鼠静脉内给药100ng(0.00033mg/kg体重)的肌肽抑制了交感神经肝脏分枝的传出神经活性(图2)。
在低剂量肌肽对交感神经肾脏分枝的传出神经活性的影响的实验中，向每只大鼠静脉内给药1000ng(0.0033mg/kg体重)的肌肽抑制了交感神经肾脏分枝的传出神经活性(图3)。
此外，还研究了肌肽在低剂量时对迷走神经(典型的副交感神经)的神经活性的影响。迷走神经腹腔分枝控制着大多数的内脏，包括肝脏、胰腺和胃肠道。向每只大鼠静脉内给药1000ng(0.0033mg/kg体重)低剂量的肌肽促进了迷走神经腹腔分枝的传出神经活性(图4)。
上述结果揭示了肌肽在低剂量时具有调控自主神经系统的作用。即，肌肽可以直接作用于交感神经系统与副交感神经系统。
肌肽在低剂量时对自主神经系统的调控作用进一步通过以下研究得到证实。
为了研究肌肽在低剂量时改善在交感神经系统占支配状态下的高血糖状况的效果，使用2-去氧-D-葡萄糖(2DG)高血糖大鼠(Brain Research，809165-174，1998)作为高血糖的动物模型。通过向2DG高血糖大鼠腹膜内给药10到100000ng(0.000033mg到0.33mg/kg体重)剂量的肌肽，观察到了血糖下降的效果(图5)。然而，腹膜内给药1000000ng(3.3mg/kg体重)的高剂量肌肽，则未显示任何血糖降低的作用。人们确信此结果表明肌肽对自主神经系统的作用只是在摄入低剂量(每次摄取10ng到100μg)的时候才会引起血糖水平的降低，从而改善在以交感神经系统的神经活动占主导地位的情况下的高血糖状态。
还研究了用结构与肌肽相似的鹅肌肽是否也能够观察到如肌肽所显示的降低血糖的作用。结果是，当向2DG高血糖大鼠颅内给药10ng(0.000033mg/kg体重)鹅肌肽的时候，未观察到任何血糖降低的作用(图6)。另一方面，在颅内给予相同剂量的肌肽时则观察到了血糖降低的效果。既然确信肌肽产生的降血糖作用是肌肽通过受体介导的特异性反应所引起的(Brain Res.158407-422，1978)，那么上述试验结果可能的原因是，虽然鹅肌肽具有相似的结构，但却不能与受体相结合。
发明人还进一步研究了在链脲霉素(STZ)糖尿病大鼠(一种大鼠高血糖模型)上，低剂量的肌肽是否对自主神经系统有作用并显示其降血糖的作用(Nippon Rinsho 56732-737，1998)。与2DG高血糖模型不同，该模型是一种糖尿病模型，其胰腺β细胞已被STZ破坏，从而由于胰岛素原的生物合成被抑制而引起高血糖。通过口服葡萄糖负荷提高STZ诱导的糖尿病大鼠的血糖水平，然后研究肌肽在低剂量时对血糖水平增加的影响。当向大鼠颅内给药10ng(0.000033mg/kg体重)肌肽(图7)或者腹膜内给药10ng(0.000033mg/kg体重)肌肽的时候，证实了其对于口服葡萄糖负荷导致的血糖增加有恢复作用(图8)。
在STZ糖尿病大鼠中，除了胰岛素分泌不足之外，隔膜中的肌肽浓度与正常大鼠相比也有所降低(Metabolism，29605-616，1980)，这表明胰岛素分泌不足引起的高血糖病理学与肌肽浓度的降低有关。因此认为，即使对于由交感神经系统活性增强之外的因素所导致的高血糖状态，给予肌肽也可以通过肌肽促进肝脏迷走神经活性而引起的肝脏中葡萄糖摄取的增强而降低血糖水平，这表明低剂量的肌肽具有自主神经系统介导的抗糖尿病作用。
我们对肌肽在低剂量时的效果，即作用于自主神经系统并由此改善交感神经活动占主导情况下的高血压状态的效果进行了研究，研究使用醋酸去氧皮质酮(DOCA)-盐型高血压大鼠(Nippon Rinsho 58708-712，2000)，该大鼠是一种高血压动物模型。当给予DOCA-盐型高血压大鼠含有0.001％或0.0001％肌肽的食物时，观察到了血压降低的效果(图9)。
血压通过外周动脉张力和心脏收缩力之间复杂的相互作用维持在正常的水平。由于这主要是由交感神经系统控制的(“大脑和应激”，BrainScience series，第13卷，第136-137页，1995年，Tetsuo Hirano、AkiraNiijima编纂，Kyoritsu Shuppan)，我们推测肌肽在低剂量时可以抑制交感神经系统的活性，从而降低血压。我们确信该结果还揭示了肌肽在低剂量时能改善在交感神经活性占主导地位的状态下的高血压。
另一方面，通过测定ECG研究了对人类自主神经系统的影响。心率是由自主神经系统控制的，其随着呼吸和血压而变化(心率变化)。对心率变化的时间顺序进行图谱分析，测定其在频率范围约为0.1Hz(周期约为10秒)和0.3Hz(约为3秒)之间的特征性波动(图谱中的峰)以研究肌肽对自主神经系统活动的影响。
结果是，当每一受试者摄入0.04mg至5mg的肌肽时，心脏副交感神经的活性比摄入肌肽之前(先前值)增强了两倍以上(图10)。由于此时自主神经系统整体活性的增强不如副交感神经，这就意味着肌肽在低剂量时能抑制交感神经系统的活性。此结果表明在动物实验中肌肽对于自主神经系统的调控作用在人类中也能够重现。
根据以上结果，本发明证实了肌肽在低剂量时具有调控自主神经系统的作用，也就是说，可以抑制交感神经系统的活性并促进副交感神经系统的活性。
能产生调控自主神经系统作用的肌肽剂量可以从2-去氧-D-葡萄糖(2DG)高血糖大鼠(用作高血糖动物模型)的肌肽剂量中推出。因此，由于向大鼠腹膜内给药10-100000ng的肌肽能引起血糖水平的降低，且小鼠对肌肽的口服吸收率为30-70％(Am.J.Physiol.255G143-G150，1988)，所以向大鼠口服给予33-330000ng的肌肽将在大鼠体内产生肌肽对自主神经系统的调控作用。此外，由于实施例中使用的大鼠体重约为300g，因此口服给药110ng到1.1mg/kg体重的肌肽将在大鼠体内产生肌肽对自主神经系统的调控作用。根据现有技术的描述，当向实验动物口服给药肌肽时，需要100mg/kg体重/天或更高的剂量。本发明的肌肽在较常规使用的剂量较小的剂量下(1/90到1/900000)显示其效果。另一方面，根据本发明，当向大鼠口服给药10mg/kg体重/天或者更高剂量的肌肽时，将不会产生对自主神经系统的调控作用。
例如，尽管向大鼠腹膜内给药10到100000ng的肌肽能抑制2DG高血糖大鼠的血糖水平升高，但是腹膜内给药10到100000倍或1mg的肌肽却不能在2DG高血糖大鼠中产生任何抑制血糖水平升高的作用(图5)。肌肽降血糖作用的剂量响应曲线呈钟型。在研究谷氨酸受体激动剂时，激动剂作用的剂量响应曲线在很多情况下都是呈钟型的，激动剂只在极低的浓度下特征性地起效(Nichiyakurishi 116125-131，2000)。
尽管谷氨酸受体控制着神经细胞的兴奋性调控和递质的释放，但谷氨酸受体的信号传递系统并不总以兴奋的方式起作用，确信这就是为什么剂量响应曲线呈钟型的原因。因此，我们认为谷氨酸受体的信号传递系统不只是激活一条通道，还可以以浓度依赖的方式(在高浓度下)激活其它信号传递通道。既然报道有肌肽受体存在(Brain Res.158407-422，1978)，因此我们认为肌肽具有与谷氨酸受体激动剂相似的钟型剂量响应曲线。
另一方面，当从动物使用的剂量估算人类使用的剂量时，对于种属之间的差异要采用一个系数10(食物安全性评估，Kageaki Kurimesihara、Mitsuru Uchiyama编纂，Gakkai Shuppan Center，1987)，对于人类的剂量应当是对于大鼠剂量的1/10。因此，在本发明的情况中，人类的口服剂量估计为11ng到0.11mg/kg体重。
事实上，在研究了在人的心脏中肌肽对自主神经活性的影响之后，我们发现给予每一受试者0.04mg到5mg的低剂量的肌肽，可以观察到副交感神经活性的增强。将该剂量用受试者的体重进行转化，则剂量为0.000741mg/kg到0.0926mg/kg体重。当将该剂量与从动物的有效剂量估算出的对于人类的肌肽剂量相比较时，去上限与估算出的口服剂量是一致的。然而，它们的下限有近100倍的差异。
这可能是由于血液中肌肽降解酶的活性在人体中为2-7μmol/hr/ml(Pediat.Res.7601-606，1973)，而在大鼠血液中却未能检测到肌肽降解酶的活性(Biochim.Biophys.Acta.429(1)214-219，1976)。本发明人测定了大鼠血浆中的肌肽降解酶，发现其为0.01-0.04μmol/hr/ml，比人类要低100倍。这表明当肌肽的量很小时，由于肌肽在人体血液中快速降解，因此人类需要比大鼠多至少100倍的肌肽。从肌肽对动物的有效剂量估算出的对人类的剂量的结果可以从肌肽降解酶活性的差异中得到解释。
当本发明的肌肽作为自主神经系统的调节剂使用时，小剂量优选在不受进餐影响的时段内服用。例如，优选在睡觉之前或者在两次进餐之间服用。此外，对于不进食肉类而主要吃素的素食者，服用肌肽作为自主神经调节剂是种优选的方式。
鸡肉和牛肉中富含肌肽。例如，100g鸡肉中含有280mg肌肽，100g牛肉中含有150mg肌肽(Adv.Enzyme Regul.30175-194，1990)。从该文章中记载的内容来看，促进副交感神经活性的肌肽的量(如5mg)可以折算成1.78g鸡肉。此外，已知在鸡肉中鸡胸所含的肌肽含量最高，但是靠食用如此少量的鸡肉来促进副交感神经系统的活性很不现实。
此外，根据文献(Am.Physio.255G143-G150，1988)，当将肌肽向小鼠空肠给药以研究其吸收率时，肌肽与L-丙氨酸联合给药时的吸收率是其单独给药时的两倍以上。当与β-丙氨酸联合给药时，吸收率达到三倍以上，这表明肌肽的吸收率随同时存在的氨基酸的类型而变化。因此，如本发明所述，为了实现肌肽在低剂量时对自主神经系统的调控，必须摄入精确低剂量的肌肽，因此从饮食中摄取能控制自主神经活性的量的肌肽是不现实的。
当使用本发明的肌肽作为自主神经系统调节剂时，不仅包括含肌肽的健康保健食品和饮料，还包括含肌肽的食品添加剂。当作为健康保健饮食品使用时，它可以掺入到，但不限于，干燥食品、食用补剂、提神饮料、矿泉水、酒精性饮料等中。
当使用本发明的肌肽作为健康保健饮食品和食品添加剂时，它可以作为药物制剂来制备。该药物制剂可以是固态或液态的，可以提到的有例如散剂、片剂、小丸、胶囊、颗粒剂、混悬液、乳液等。对于本发明的药物制剂，可以加入可药用的赋形剂。作为赋形剂，可以使用的有稀释剂、矫味剂、稳定剂、混悬液润滑剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂，可以单独或结合使用。
当使用本发明的肌肽作为治疗剂时，药物制剂可以是固态或液态的，可以提到的有例如散剂、片剂、小丸、胶囊、栓剂、颗粒剂、内用液体制剂、混悬液、乳液、洗剂等。对于本发明的药物制剂，可以加入可药用的赋形剂。作为赋形剂，可以使用的有稀释剂、矫味剂、稳定剂、混悬液润滑剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂等，可以单独或结合使用。
将参考实施例来说明本发明。
实施例1、肌肽对大鼠自主神经系统的调节作用按照Niijima的方法(Neurobiology 3299-307，1995)，研究肌肽对自主神经活性的影响。将Wistar雄性大鼠(体重约300g)置于室温(24℃)环境下，可自由取食，在实验开始前禁食12小时(仍能自由饮水)。在乌拉坦麻醉(1g/kg体重，腹膜内给药)后实施剖腹手术，从交感神经分枝或者迷走神经分枝的中央切割端分离出神经细丝，通过交流放大器记录传出神经的活动。使用示波器观察神经活动并将其记录在磁带中。同时，神经活动的时程通过数率计用笔型记录器记录下来，数率计的复回时间设定在5秒。
静脉内给药肌肽(100ng或1000ng，溶于0.1ml生理盐水中)。作为对照，仅静脉内给药生理盐水(0.1ml)。
用相对于设定为100的给药前神经活动计数(平均值为5分钟内10次活动计数)的肌肽给药后神经活动计数(％)计算肌肽给药的效果。每次实验使用5只大鼠。所得数据进行ANOVA检测(p＜0.05)，以平均值+/-标准误差表示。
(1)交感神经肾上腺分枝的传出神经活性的抑制通过向大鼠静脉内给药100ng肌肽，交感神经肾上腺分枝的传出神经活性在给药后30分钟(抑制率31.3％)、60分钟(抑制率46.9％)及90分钟(抑制率58.1％)被显著抑制(图1)。
(2)交感神经肝脏分枝的传出神经活性的抑制通过向大鼠静脉内给药100ng肌肽，交感神经肝脏分枝的传出神经活性在给药后30分钟(抑制率20.1％)、60分钟(抑制率25.9％)及90分钟(抑制率32.0％)被显著抑制(图2)。
(3)交感神经肾脏分枝的传出神经活性的抑制通过向大鼠静脉内给药1000ng肌肽，交感神经肾脏分枝的传出神经活性在给药后30分钟(抑制率29.7％)、60分钟(抑制率32.8％)及90分钟(抑制率28.0％)被显著抑制(图3)。
(4)迷走神经腹腔分枝传出神经活性的促进为了研究对迷走神经的神经活性的影响，记录下迷走神经腹腔分枝的传出神经活性。通过向大鼠静脉内给药100ng肌肽，迷走神经腹腔分枝的传出神经活性在给药后30分钟(促进率15.4％)、60分钟(促进率28.6％)及90分钟(抑制率48.7％)得到显著的促进(图4)。
上述结果表明，由于静脉内给药低剂量的肌肽能抑制交感神经系统的活性并促进迷走神经的活性，肌肽在低剂量时具有调控自主神经系统的作用。
实施例2、肌肽在2DG高血糖大鼠中的抗高血糖作用由于预计当用低剂量的肌肽调控自主神经系统活性时血糖水平将会降低，因此按照Chun等提出的方法(Brain Research 809165-174，1998)来研究肌肽在2DG高血糖大鼠中的抗高血糖作用。让所使用的Wistar雄性大鼠(初始重量约为250g)在室温下(24+/-1℃)下，在用80勒克斯的白炽光照射平均12小时的房间内适应环境至少10天，可自由取食。
在实验前3天，在戊巴比妥麻醉(35mg/kg体重，腹膜内给药)的情况下，向大鼠右心房插入一根含硅橡胶导管(Dow Corning，Midland，MI)和聚乙烯导管(Clay Adams，Parsippany，NJ)的心脏导管，向右侧脑室(LCV)插入聚乙烯导管。在实验的当天，将肌肽溶解于生理盐水中并向大鼠颅内给药(0.01ml)或者腹膜内给药(0.1ml)，同时向大鼠LCV给予2-去氧-D-葡萄糖(2DG，0.01ml)。对照组大鼠用生理盐水代替肌肽，用人工脑脊液代替2DG，均使用相同的量。
向LCV给予2DG60分钟后，经由心脏导管抽出300μl血液，检测其血浆葡萄糖水平。按照葡萄糖氧化酶方法，使用Fuji-Dri-chem系统(FujiFilm，东京)测定血浆中的葡萄糖浓度。葡萄糖血浆浓度的变化以相对于给予2DG之后90分钟的对照值(设为100)的比值的(％)来表示。实验中使用4或5只大鼠。所得数据进行ANOVA检测(p＜0.05)，以平均值+/-标准误差表示。
(1)通过腹膜内给药肌肽抑制高血糖向2DG高血糖大鼠腹膜内给药1ng、10ng、100ng、1000ng、10000ng、100000ng和1000000ng肌肽，观察血浆葡萄糖水平的变化。结果是，当腹膜内给药10ng肌肽(抑制率16.0％)、100ng肌肽(抑制率31.5％)、1000ng肌肽(抑制率26.8％)、10000ng肌肽(抑制率27.6％)、100000ng肌肽(抑制率21.9％)时，高血糖被显著抑制(图5)。
(2)鹅肌肽与肌肽的比较颅内给药与肌肽结构相似的鹅肌肽以比较其抗高血糖效果。向大鼠腹膜内给药10ng的肌肽能抑制高血糖，而相同量的鹅肌肽却不能抑制高血糖(图6)。该结果表明肌肽的抗高血糖作用是肌肽所特有的反应。
实施例3、肌肽在进行口服葡萄糖耐量试验的STZ糖尿病大鼠中的抗高血糖效果试验使用Wistar雄性大鼠(初始体重约250g)。将它们圈养在用80勒克斯的白炽光照射平均12小时的房间内，可自由取食，并对该环境适应至少10天。在实验前3天，在戊巴比妥麻醉(35mg/kg体重，腹膜内给药)下，向大鼠右心房插入一根含硅橡胶导管(Dow Corning，Midland，MI)和聚乙烯导管(Clay Adams，Parsippany，NJ)的心脏导管，向右侧脑室(LCV)插入聚乙烯导管。
然后，按照Portha等报道的方法(Diabets，3064-69，1981)准备STZ(链脲霉素)糖尿病大鼠。将链脲霉素(STZ，Sigma公司生产)以2g/ml的浓度溶于0.05M柠檬酸溶液(pH4.5)，以60mg/kg体重的剂量腹膜内给药。向按此方法准备的STZ糖尿病大鼠每只动物口服给药1ml(0.5g)溶解了0.5g/ml葡萄糖的水溶液(口服葡萄糖负荷)。在负荷葡萄糖的同时，将溶于生理盐水的肌肽向大鼠颅内(0.01ml)或腹膜内(0.1ml)给药。
口服给药采用探针，颅内给药用LVC聚乙烯管来进行，腹膜内给药使用注射器及针头。对照组大鼠用生理盐水代替肌肽，用人工脑脊液代替2DG，均使用相同的量。在口服给药葡萄糖之前或给药15、30、60和90分钟后，经由心脏导管抽取300μl血液并测定血浆中的葡萄糖浓度(血糖水平)。将葡萄糖给药前的血浆葡萄糖浓度设为100，以比值(％)的形式计算出给药肌肽时的葡萄糖血浆浓度。在实验中使用4或5只大鼠。所得数据进行ANOVA检测(p＜0.05)，以平均值+/-标准误差表示。
当向大鼠颅内给药10ng肌肽时，从15到90分钟，由口服葡萄糖负荷引起的血糖增加被显著抑制(图7)。抑制率为15分钟时14.5％、30分钟时17.3％、60分钟时14.7％、90分钟时11.4％。同样，当向大鼠腹膜内给药100ng肌肽时，在60和90分钟时，由口服葡萄糖负荷引起的血糖增加被显著抑制(图8)。抑制率为60分钟时14.3％，90分钟时12.4％。
实施例4、肌肽在DOCA-盐型高血压大鼠中的抗高血压作用使用6周大的Spragur-Dawley雄性大鼠。动物通过腹膜内给药40mg/kg体重的戊巴比妥实施麻醉，剖开右侧腹部取出右肾。实施外科手术并恢复一周后，将动物分成假外科手术(假性)组和醋酸去氧皮质酮(DOCA)盐型组两组。每组再进一步分成正常食物组、含0.001％肌肽食物组和含0.0001％肌肽食物组。
向DOCA-盐型组大鼠皮下注射15mg/kg体重的混悬于玉米油中的DOCA，每周两次，用补充有1％氯化钠的自来水作为饮用水。假性组既不接受DOCA也不接受氯化钠。使用尾套和气体脉冲传感器(BP-98A，Softron)每周测量一次收缩压，共测量5周。实验中，DOCA组使用9只大鼠，假性组使用6只大鼠。所得数据进行ANOVA检测(p＜0.05)，以平均值+/-标准误差表示。
DOCA-盐型-正常食物组的大鼠的收缩压从第一周开始增加，且在第五周血压增加到200mmHg。相反，DOCA-盐型-含0.001％肌肽食物组的大鼠和DOCA-盐型-含0.0001％肌肽食物组的大鼠，与DOCA-盐型-正常食物组的大鼠相比，血压的增加从第一周起便受到显著抑制(图9)。DOCA-盐型-含0.0001％肌肽食物组的大鼠在第一周所显示的抑制率为9.6％，第二周为10.2％，第三周为15.0％，第四周为22.1％，第五周为17.8％。DOCA-盐型-含0.001％肌肽食物组的大鼠在第一周所显示的抑制率为6.2％、第二周为12.4％，第三周为19.6％，第四周为21.5％，第五周为25.5％。上述结果表明含肌肽的食物能显著抑制在交感神经系统的活动占主导地位的状态下的血压升高。
实施例5、肌肽对人类自主神经系统的调节作用测量受试者的静息心电图5分钟，并在受试者饮用测试样品后30分钟和60分钟时，分别测量其心电图5分钟。为了避免呼吸变化产生的影响，当受试者每分钟固定呼吸15次时测定其心电图。随后测定心电图中R波的间距(R-R间期)，并按照Moritani等制作的程序对其进行频谱解析(JSportMed.Sci.731-39，1993)。对于周期成分，以欧美心脏病学会的分类标准(Circulation，931043-1065，1996)将心率变化分成低频(0.03-0.15Hz)和高频(0.15-0.4Hz)两组。
在包药粉的纸上称出每人0.04mg、0.2mg、1mg、5mg和25mg的肌肽。对于0.2mg，称取1毫克1∶4肌肽和淀粉的混合物(1/5稀释)。对于0.04mg，称取1毫克将1∶4肌肽和淀粉的混合物再次以1∶4的比例与淀粉混合的混合物(1/25稀释)。通过用舌头舔取在包药粉的纸上称量出的物质来服用肌肽。
实验中有8名受试者，年龄为21-51岁(33.0+/-11.95岁)，体重54-73.5kg(64.3+/-7.01kg)，对其中的6名受试者进行0.04mg和0.2mg的实验，对所有8名受试者进行1mg和5mg的实验，对其中的5名受试者进行25mg的实验。对神经活性的评估用显示超过先前副交感神经活性值200％的人的比例来表示。
在摄取0.04mg肌肽的实验中，在6名受试者中，在1人身上观察到了对自主神经活性的影响(显示促进作用的人的比例16.7％，副交感神经活性促进率249％，整体自主神经活性促进率195％)；在接受0.2mg摄取实验的6名受试者中有4人(显示促进作用的人的比例66.7％，副交感神经活性平均促进率436％，整体自主神经活性平均促进率329％)；在接受1mg摄取实验的8名受试者中有3人(显示促进作用的人的比例37.5％，副交感神经活性的平均促进率259％，整体自主神经活性的平均促进率190％)；在接受5mg摄取实验的8名受试者中有2人(显示促进作用的人的比例25.0％，副交感神经活性的平均促进率472％，整体自主神经活性的平均促进率410％)；在接受25mg摄取实验的8名受试者中有0人(显示促进作用的人的比例0％)。
上述结果表明肌肽也能促进人类副交感神经系统的活性。其剂量在0.04mg/剂到5mg/剂(0.000741mg/kg到0.0926mg/kg)之间。那些显示副交感神经活性的促进率为原始值的200％或更高的个体所占的比率如图10所示。另一方面，在所有浓度下，整体自主神经活性均低于副交感神经活性的促进率。这表明肌肽能抑制交感神经系统的活性。
(制剂实施例1)片剂(重量％)肌肽 2乳糖 83重质氧化镁 15将其均匀混合以制备100mg/片的片剂。
(制剂实施例2)散剂和颗粒剂(重量％)肌肽 2乳糖 70淀粉 28将其均匀混合以制备散剂或颗粒剂。
(制剂实施例3)胶囊剂(重量％)明胶 70甘油 22.9对羟基苯甲酸甲酯 0.15对羟基苯甲酸丙酯 0.35水 适量总计100％将制剂实施例1中所示的组合物填充到含上述成分的软胶囊外壳中，以制备100mg/粒的软胶囊。
(制剂实施例4)饮用制剂味道DL-酒石酸钠 0.1g琥珀酸 0.009g甜味液体糖 800g酸味柠檬酸 12g维生维生素C 10g肌肽 0.2g维生素E 30g环糊精 5g香料 15ml氯化钾 1g硫酸镁 0.5g混合上述成分并加水至10升。该饮用制剂每次服用约100ml。
工业实用性摄入肌肽仅在低剂量时能抑制交感神经系统的传出神经活性并促进副交感神经系统的传出神经活性。该调控自主神经系统的作用对于预防和缓解自主神经系统的失衡特别有用。
权利要求
1.一种具有调控自主神经系统作用的组合物，所述组合物包含一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
2.一种可以预防、改善或缓解自主神经系统紊乱以及由此引起的病症的具有调控自主神经系统作用的组合物，所述组合物包含一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
3.权利要求
所述2的组合物，其中，所述由自主神经系统紊乱所引起的病症是由交感神经系统活性增强所致的高血压或高血糖症状。
4.权利要求
1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是一种药物组合物。
5.权利要求
1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物是一种食品和饮料。
6.调控自主神经系统的方法，该方法包括摄入一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
7.预防、改善或缓解自主神经系统紊乱以及由此引起的病症的方法，该方法包括摄入一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
8.抑制交感神经系统兴奋的方法，该方法包括摄入一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
9.促进副交感神经系统活性的方法，该方法包括摄入一定量的肌肽以使每次的肌肽摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg。
10.肌肽在制备用于调控自主神经系统的组合物中的应用，其通过摄入肌肽以使每次的摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg来实现。
11.肌肽在制备用于预防、改善或缓解自主神经系统紊乱以及由此引起的病症的组合物中的应用，其通过摄入肌肽以使每次的摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg来实现。
12.肌肽在制备用于抑制交感神经系统兴奋的组合物中的应用，其通过摄入肌肽以使每次的摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg来实现。
13.肌肽在制备用于促进副交感神经系统活性的组合物中的应用，其通过摄入肌肽以使每次的摄取量达到0.7μg/kg到0.09mg/kg来实现。
专利摘要
一种含有肌肽的组合物(例如，饮料、食品、药物)，其所含肌肽的量可提供0.7μg/kg到0.09mg/kg肌肽的单剂量。该组合物可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、饮料、面包、饼干、蛋糕等形式。这些组合物优选具有自主神经系统调控作用，更优选具有预防、改善或缓解自主神经系统障碍以及由此产生的症状的作用。
文档编号A23L2/38GKCN1458843SQ02800655
公开日2003年11月26日 申请日期2002年3月15日
发明者鹤冈伸夫, 木曾良信, 永井克也, 松村靖夫, 新岛旭, 森谷敏夫 申请人:三得利株式会社, 塞雷博斯太平洋有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan