专利名称:一种治疗性乙肝疫苗及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制剂，更具体地说，它涉及用于慢性乙型肝炎的一种治疗性 乙肝疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法和用途。
背景技术：
慢性乙型肝炎是我国常见的传染病之一，我国属乙型肝炎病毒(HBV)高流行区， HBV感染是一个严重的公共卫生问题，但在慢性乙型肝炎治疗方面一直未取得突破性进展。
直至目前，临床上对慢性乙型肝炎的治疗仍面临着不少的困惑，虽然治疗的总体 目标是明确的，即最大限度的长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及纤维化，延缓和 阻止疾病的进展等。但在实施过程中还存在着许多困难和争议。HBV的持续存在和复制是 导致病情进行性发展的主要原因，因此抗病毒治疗是关键手段，尽管核苷(酸)类似物有 了长足的发展，但由于HBV的耐药变异、HBV DNA可能与宿主基因的整合以及环状共价闭合 DNA(cccDNA)难以清除等因素，以致抗病毒治疗存在着不彻底性。因此免疫干预的作用应当 引起我们的关注，虽然目前还缺乏特异性的免疫干预制剂，但归根结底调动和诱导机体自 身的免疫调节机制，是有效治疗慢性乙型肝炎的重要途径。
大量试验研究及临床观察表明，HBV特异性细胞免疫应答在慢性乙型肝炎病变的 发生、发展、转归和清除HBV起着至关重要的作用。在急性HBV感染过程中，多克隆多特异 性的细胞免疫应答，使HBV的复制迅速被抑制以致完全清除(Sobau Y,et al. JHepatology, 2002)，患者痊愈。而慢性HBV感染者，针对HBV的特异性细胞免疫应答低下，甚至呈现对 HBV的免疫耐受状态。增强和促进HBV特异性的⑶8+毒性T淋巴细胞(CTL)和⑶4+辅助 性T淋巴细胞(HTL)的活化，以非靶细胞损伤为主的清除HBV机制是机体清除HBV的十分 重要的方式。活化的⑶8+CTL—方面分泌IFN-Y、TNF-α等细胞因子，通过抑制前基因组 RNA(pgRNA)和缩短细胞核内cccDNA半衰期，抑制以致清除HBV，另外也可通过溶细胞的机 制清除HBV。但只有当CD8+CTL应答非溶细胞损伤机制不能有效抑制HBV复制时，才启动凋 亡和溶细胞的机制，其途径包括穿孔素颗粒酶系统、Fas/Fas配体系统、TNF/TNF受体系统 和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。
研究表明，慢性乙肝患者外周血存在着高水平的HBV颗粒和HBV蛋白，而且是抑制 患者细胞免疫应答低下或耐受的主要原因之一(Schlaak JF，et al. J Hepatol, 1999 ；Chen M,etal. J Virol, 2005)。慢性乙型肝炎患者免疫应答功能低下或免疫耐受主要表现为树突 状细胞(DCs)包括mDC和pDC数量下降、功能损伤，HTL的功能缺陷、CD8+CTL的数量减少和 功能下降以及CD4+CD25+调节性T细胞(Treg细胞)抑制效应细胞和肝细胞外环境的改变。 此外，共抑制分子PDL-1/PD-1信号途径也参与了 HBV慢性感染过程中CTL的损伤(Leibsim PJ. Curv Opin Immunol, 2004) 0还有人指出慢性乙肝患者天然免疫应答也有所减弱，天然 免疫在HBV的清除过程中起着重要作用，特别在感染的初期，pDC可先产生IFN-α β，ΝΚ和 NKT细胞通过I10Il样受体途径被活化即可产生IFN- γ，80%复制高峰期的HBV可被ΝΚ、ΝΚΤ 细胞通过分泌细胞因子和细胞毒作用抑制和清除。[0006]综上所述，慢性乙型肝炎治疗除使用抗HBV药物外，免疫干预治疗 是必不可少的重要途径，而后者的主要选择就是以基于细胞因子的免疫治疗 (cytokine-basedimmunotherapy)或治疗t生疫苗(therapeutic vaccines) (Depla Ε, et al. J Virol,2007)。
本申请的发明人通过长期的实验研究，设计以多个HBV特异性CTL和HTL多肽 表位为抗原肽，以重组人的白介素_12(rhIL-12)作为佐剂的慢性乙型肝炎治疗性疫苗， rhIL-12既可作为佐剂增加多肽表位的抗原性和免疫应答效应，而且rhIL-12是免疫网络 中占有十分重要地位的核心细胞因子，具有多重功能，不但是连接天然免疫和获得性免疫 的桥梁，而且是细胞免疫应答的关键调节者(Decchio MD, et al. Clin Cancer Res，2007)。 研究证明NKT细胞表达丰富的IL-12R复合物，是rhIL-12免疫调节作用的首要目标，而NK 细胞无论活化与否均存在IL-12R，因此二者被rhIL-12激活后均可产生以IFN-γ为主的细 胞因子，通过非溶细胞和溶细胞机制抑制HBV的复制。更重要的是rhIL-12调节Thl/Th2 应答(Rossol S，et al. J Clin hvest，1997)，使其向 Thl 倾斜。rhIL-12 还是诱生 CTL 免 疫应答最佳的细胞因子。rhIL-12作为第三信号在初始CD8+细胞活化增殖中起重要作用。 因此，HBV多肽表位诱导HTL和CTL的活化作用，能被rhIL-12所明显放大。因此在多肽表 位的刺激下HTL和CTL活化后，其细胞表面表达高亲和力的IL-12R，与rhIL-12结合后进一 步促使其转变为效应性T细胞，通过分泌以IFN-Y为主的细胞因子和细胞毒作用，抑制和 清除HBV。
发明内容
本发明要解决的技术问题的关键所在是筛选源自HBV核心抗原(HBcAg)、HBV包膜 蛋白抗原(HBsAg)和多聚酶的CTL、HTL优势表位多肽中加入佐剂rhIL-12，形成一种新型 治疗性乙肝疫苗。
本发明的要解决的另一技术问题是提供一种上述治疗性乙肝疫苗的制备方法。
本发明的前一技术方案是这样的一种治疗性乙肝疫苗，其特征在于该疫苗是由 人体有效剂量的表位多肽、重组人白介素-12和药用辅料共同组成的冻干制剂，其中表位 多肽和重组人白介素-12重量之比为200 20000 1，其中的表位多肽由CTL表位多肽和 HTL表位多肽组成。
上述一种治疗性乙肝疫苗中，所述的表位多肽中CTL表位多肽和HTL表位多肽的 重量比约为2 1 ；所述的CTL表位多肽、HTL表位多肽、重组人白介素-12的重量范围为 6mg IOOyg ;3mg 1 μ g 10 μ g ；所述的药用辅料为甘露醇或蔗糖或白蛋 白或右旋糖酐或聚维酮40或NaCl或水解明胶或乳糖或山梨醇中的至少一种。
上述一种治疗性乙肝疫苗中，所述的CTL表位多肽为乙型肝炎病毒来源的CTL表 位多肽中的一条或多条，包括HBV包膜蛋白抗原中第183 191氨基酸序列FLLTRILTI或 236 245氨基酸序列RWMCLRRFII或249 258氨基酸序列ILLLCLIFLL或313 321 氨基酸序列IPIPSSWAF或332 342氨基酸序列RFSWLSLLVPF或335 343氨基酸序列 WLSLLVPFV或359 369氨基酸序列WMMWYWGPSLY或它们的变异序列、HBV核心抗原中第 18 27氨基酸序列FLPSDFFPSV或19 27氨基酸序列LPSDFFPSV或88 96氨基酸序 列YVNVNMGLK或101 110氨基酸序列LWFHISCLTF或117 125氨基酸序列EYLVSFGVW或137 147氨基酸序列LTFGRETVLEY或141 151氨基酸序列STLPETTVVRR或419 428氨基酸序列DLLDTASALY或它们的变异序列和HBV多聚酶抗原中第47 55氨基酸序 列NVSIPWTHK或149 159氨基酸序列HTLWKAGILYK或166 173氨基酸序列ASFCGSPY 或3 363氨基酸序列TPARVTGGVF或388 397氨基酸序列LVVDFSQFSR或392 401 氨基酸序列SWPKFAVPNL或415 似4氨基酸序列LSLDVSAAFY或似9 437氨基酸序列 HPAAMPHLL或455 463氨基酸序列GLSRYVARL或530 539氨基酸序列FPHCLAFSYM或 531 539氨基酸序列SAICSVVRR或538 546氨基酸序列YMDDVVLGV或562 570氨基酸 序列FLLSLGIHL或640 650氨基酸序列YPALMPLYACI或665 674氨基酸序列QAFTFSPITK 或745 753氨基酸序列KYTSFPWLL或它们的变异序列。优选FLPSDFFPSV或YVNVNMGLK或 STLPETTVVRR 或 TPARVTGGVF 或 HTLWKAGILYK 或 IPIPSSWAF 或 RWMCLRRFII 或 YMDDVVLGV。
上述一种治疗性乙肝疫苗中，所述的HTL表位多肽为乙型肝炎病毒来源的HTL表 位多肽和padre序列AKFVAAWTLKAAA中的一条或多条，乙型肝炎病毒来源的HTL表位多 肽包括HBV包膜蛋白抗原中第180 194氨基酸序列AGFFLLTRILTIPQS或339 353氨 基酸序列LVPFVQWFVGLSPTV或它们的变异序列、HBV核心抗原中第50 69氨基酸序列 PHHTALRQAILCffGELMTLA 或 120 139 氨基酸序列 VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI 或它们的变异 序列和HBV多聚酶抗原中第96 110氨基酸序列VGPLTVNEKRRLKLI或145 159氨基 酸序列RHYLHTLWKAGILYK或385 399氨基酸序列ESRLVVDFSQFSRGN或412 似6氨基 酸序列 LQSLTNLLSSNLSWL 或 420 4；34 氨基酸序列 SSNLSWLSLDVSAAF 或 501 515 氨基 酸序列LHLYSHPIILGFRKI或523 537氨基酸序列PFLLAQFTSAICSVV或618 632氨基 酸序列KQCFRKLPVNRPIDW664 678氨基酸序列KQAFTFSPTYKAFLC或694 708氨基酸 序列 LCQVFADATPTGWGL 或 767 781 氨基酸序列 AANWILRGTSFVYVP 或 774 788 氨基 酸序列GTSFVYVPSALNPAD或它们的变异序列；优选HTL表位多肽为AGFFLLTRILTIPQS或 LHLYSHPIILGFRKI 或 AKFVAAWTLKAAA 或 RHYLHTLWKAGILYK。
本发明的后一目的是这样实现的一种治疗性乙肝疫苗的制备方法，包括以下步 骤(1)用Fmoc固相肽合成法合成所需表位多肽；(2)在100级以下车间，量取各抗原表位 肽、rhIL-12,加入药用辅料，用注射用水溶解，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，分装于 适当容量玻璃容器瓶中，冷冻干燥，扎盖，包装即得成品。
本发明的还提供上述治疗性乙肝疫苗在慢性乙肝感染治疗中的应用，以及它在乙 肝病毒相关肿瘤的预防和治疗中的应用。
以下从二个组分的具体研制过程和使用进行详细说明。
在应用抗原分子进行免疫干预方面，基本上已放弃病原体或天然抗原整体分子， 虽然其抗原性强，但由于其中含有不适当、抑制性甚至病理性表位可以导致免疫损伤甚至 免疫颠覆，因此选择的途径多遵循由病原体、蛋白质分子逐步过度到表位多肽。其优点是诱 导的免疫应答有针对性，特异性强，但免疫原性依次下降，以致单纯应用表位多肽常常达不 到满意的符合治疗要求的免疫应答。本申请的发明采用(1)表位多肽的合理组合与搭配; (2)以细胞因子rhIL-12为佐剂；(3)广谱高效的表位，HTL PADRE作为CTL表位的重要协 同成分，它不仅可以和很多DR分子相结合，还可以与某些MHC II类分子相结合，该表位在 诱导特异性CTL免疫应答方面比天然的HTL表位高1000倍以上，因此能够克服单纯应用多 肽表位具有的抗原性较低的缺陷。[0018]研究所用的多肽表位采用固相合成技术，高效液相色谱(HPLC)纯化，十分注意不 同多肽表位氨基酸组成分析，质谱、氨基酸序列测定对其结构确定的重要意义，特别关注其 生物特性尤其是其免疫原性的观察和研究，因为与其他化学药物相比，合成多肽稳定性较 差，易降解、氧化，体内半衰期短。在注意这些基本方面的前提下，我们遵循以下原则筛选 HBV特异性的CTL和HTL表位。
(1)尽可能选择较多的多肽表位形成MAP，以保证能诱导较全面的多特异性的CTL 和 HTL 效应(Depla E, et al. J virol，2007)。
(2)选择来自HBV蛋白不同部分HBcAg、HBsAg和多聚酶(Polymerase)的多种CTL 和HTL表位，以提高应答能力和调节作用。
(3)选择CTL和HTL表位时，应考虑到限制这些表位的HLA类型，特别是HLA超型 的选择，尽量增加这些多肽表位的不同HLA类型的覆盖范围，以提高其潜在的识别率；
(4)充分注意提高免疫原性的通用的HTL表位，即泛化的DR辅助性T细胞表位 (PanDR-helper T cell 印itopes，PADRE)，以提高对多肽疫苗的应答水平(Alexander J 等，1994)，避免对HBV感染个体的免疫损伤。应当指出，⑶4+T细胞的活化可分泌IL-2、 IL-12等细胞因子，是CTL发育、诱导成熟扩增及有效维持的必要条件(Rige JP, et al. Nature,1998)。
(5)多选择来自多聚酶的多肽表位有助于克服HBV抗原引起的免疫损伤，因为这 种抗原的含量远较体内其他HBV抗原含量为少(Mizukoshi E，et al. J Immunol，2004)。
(6)选择相对保守度高的多肽表位序列，选用这种在病毒基因稳定存在的序列制 成的疫苗，不但可以最大限度的抵抗现有的HBV，而且还可以避免病毒变异导致免疫逃逸；
(7)选择与HLA有高度或中度亲和力的表位(与HLA I类分子高度亲和的表位IC50 高于或等于50nM，与HLAII类分子高度亲和的表位IC5tl高于或等于ΙΟΟηΜ，中度亲和的IC5tl 在 100 IOOOnM) (Alessandro 等，1999)。
采用下列方法筛选和优化HBV多肽表位组合
(1)应用ELISA法检测和比较候选的HBV多肽组合、rhIL-12，和多肽组合与 rhIL-12对人PBMC产生IFN- γ的影响；
(2)应用Elispot方法筛选和观察HBV多肽组合、rhIL-12，和多肽组合与rhIL-12 对人PBMCs IFN- y +细胞频率的影响；
(3)应用流式细胞术，观察HBV多肽组合与rhIL-12对人PBMC产生IFN- γ的细胞 来源，主要观察IFN- y +的⑶8+CTL、⑶4+Thl和NK细胞的分布情况。
候选的HBV多肽总计47个，其中来自HBcAglO个，来自HBsAg 9个，来自多聚酶28 个。[0031 ] 通过上述3种方法的筛选，我们选择FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、 TPARVTGGVF、HTLffKAGILYK, IPIPSSffAF, RffMCLRRFII, YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、 LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAffTLKAAA 和 RHYLHTLWKAGILYK 这 12 个多肽表位，把它们作为 MAP(mutiple antigen peptide system)的成员，形成优化的组合与搭配。 本发明的发明人经过5年多的研究，成功地构建了高表达rhIL-12的CHO细胞株， 从静止培养过渡到连续培养，形成了中试规模，用改进的纯化方法，所得rhIL-12纯度达到 98%。经质谱MALD-TOF分子量检测与理论相符合，其质谱肽图N-端氨基酸序列与理论完全符合，SDS-PAGE电泳、免疫印迹结果与标准带一致。应用Elispot试验，外周血PBMC刺 激试验和多色流式细胞仪进行了多项药效学试验，结果与文献报告一致(参考中国专利公 开号 CN101033254A)。
HBV多肽组合对人PBMC产生IFN- γ的影响结果表明，单独应用HBV多肽组合对 PBMC产生IFN- γ只有轻度增加，单独应用rhIL-12也只诱导PBMC产生IFN- γ轻度增加， HBV多肽组合与rhIL-12联合应用则明显促进PBMC产生IFN- y。Balb/c小鼠体内试验结果 也证明，应用多肽组合和rhIL-12联合免疫，每天一次，连续5天，在免疫后2周，HBV多肽 组合和rhIL-12联合应用组脾脏淋巴细胞产生IFN- γ水平明显较单用HBV多肽或rhIL-12 明显提高。流式细胞仪检测表明，IFN-Y的增量来源以HTL和CTL为主，其次为NK细胞。 上述试验结果表明，以HBV多肽表位组合为抗原，以rhIL-12为佐剂的新型乙肝疫苗可以强 烈诱导以HTL和CTL为主的免疫应答，显示了良好的应用前景。
已经证明rhIL-12可以活化NKT、NK细胞和γ δ T细胞，NKT和NK均存在rhIL_12 受体(Lanzen N M, et al. Cell Immunol，2006)，相结合产生以IFN-γ为主的细胞因子，具 有非溶细胞及溶细胞的免疫作用。而且NKT和NK活化的结果可使单核细胞直接分化为DC， 导致人对DC的调节，包括上调⑶40的表达，调整⑶40和⑶40L的相互作用，促进DC激活， 提高DC对HBV多肽组合的功能，加速HBV特异性和CTL的活化，激发IFN- γ的分泌。特别 应当指出，rhIL-12可以调节Thl/Th2应答，使其向Thl倾斜，协助HBV多肽，诱导Thl细胞 发育和增殖，增强T细胞的功能，使其分泌IL-2，IL-3，IFN- γ，TNF- β和GM-CSF, rhIL-12 和⑶观+协同诱导静息型T细胞增生，rhIL-12与HBV多肽抗原共刺激，使特异性的CTL增殖 并表现叠加或倍增效应，增加CTL释放IFN- γ、穿孔素、颗粒酶A及颗粒酶B，提高其非溶细 胞和溶细胞清除HBV机制。还要指出rhIL-12作为第三信号对初始的CD8+T细胞的活化与 增殖起诱导作用，特别是在HBV抗原水平较低时起诱导的作用是十分重要的。rhIL-12可活 化IL-2Ra链(⑶25)的表达能力，而且其诱导功能比TCR和/或rhIL-2的诱导功能更强， 因此rhIL-12作为第三信号在一定程度上决定了初始T细胞能否进一步分化(Curtsinger J M，et al. J Exp Med, 2003) 还应指出rhIL-12诱导B细胞产生多种生物效应(Ima A， et al. HaematOlOgiCal，2002)，在抗原特异性应答期内对多数同型抗体的生成产生增强效 应，rhIL-12刺激NK细胞和T细胞活化生成IFN- γ，促使IgGl向IgG2转化，并对IgGl的 生成产生抑制作用，而IgG2/IgGl > 1时，则有助于Thl的应答。因此rhIL-12在协助HBV 多肽表位诱导放大免疫应答是十分重要的。综上所述，rhIL-12不仅能活化NKT、NK、T细 胞以非溶细胞为主要方式抑制和清除HBV，而且还可以促进APC的功能，加速DC成熟，提高 DC对HBV多肽组合的递呈效率，促进HBV特异性CTL和HTL的活化(Xiong SQ, et al. Int immunophar macol，2007)o
最新的研究表明，rhIL-12可以增强记忆性中央型T细胞的活化或应答；在中央型 记忆性⑶+细胞转化为⑶4+效应性T细胞是必须的。效应性记忆性⑶8T细胞在缺乏同源 抗原下，rhIL-12可以促使其分泌IFN- y。HBV特异性记忆性T细胞在HBV疫苗的应答中 占有地位是十分重要的。rhIL-12这一作用再次说明HBV的特异性HTL和CTL表位产生应 答效应，与rhIL-12的佐剂作用是十分重要的和不可缺少的。
多肽表位组合作为再次进入机体HBV相同抗原与记忆性T细胞(包括⑶4+和⑶8+T 细胞)再次接触时，能迅速杀灭或清除被感染的细胞，同时分泌细胞因子来抑制HBV的复制并调节其他免疫细胞的功能。这一点是免疫网络对HBV多肽表位为抗原肽以rhIL-12为佐 剂的疫苗的重要作用机制之一。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1多肽表位的制备
多肽的制备用Fmoc固相肽合成法，首先将一个用Fmoc基团对α -氨基进行保护 的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨 基酸-支臂-树脂。将第二个预先活化的α -氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去，缩 合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽。最后将肽-支臂-树 脂裂解。多肽纯化，用HPLC法，粗肽产品经C18高压柱分离纯化，用液相色谱仪跟踪收集所 需流出液，样品峰合并后去盐、冻干，制得多肽精品。以下以HBcAg(18-27)的制备过程为 例，叙述合成过程。
(I)HBcAg (18-27)合成[0041 ] a) Fmoc-Val-Wang树脂的溶胀及脱Fmoc保护
称取Fmoc-Val-Wang树脂62. 5克(150目，0. 8mmol/g)，装入专用的反应器中，开 启CS936生产型多肽合成仪总电源，打开工作站，调用事先编著的接肽程序。用700mlDMF 浸泡，使树脂充分溶胀，氮气吹干。加入700ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮 气吹虑去PIP，用DMF洗涤3次，氮气吹干。
b) Fmoc-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Ser (tBu) -0H57. 5g, H0Bt20. 5g, DIC 50. 6g, 300mlDMF,将混合物 25°C振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
c) Fmoc-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Pro-OH 50. 6g,H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，将混合物 25°C振摇 1 小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
d) Fmoc-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Phe-OH 58. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，将混合物 25°C振摇 1 小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
e) Fmoc-Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Phe-OH 58. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，将混合物 25°C振摇 1 小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。87/35
f) Fmoc-Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH 61.7g, H0Bt20. 5g, DIC 50. 6g,300mlDMF,将混合物 25°C振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
g) Fmoc-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Ser (tBu) -OH 57. 5g, H0Bt20. 5g, DIC 50. 6g, 300mlDMF,将混合物 25°C 振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。[0061 ] h) Fmoc-Pro-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Pro-OH 50. 6g，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，将混合物 25°C振摇 1 小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
i) Fmoc-Leu-Pro-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的制备
加入Fmoc-Leu-OH 53. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，将混合物 25°C振摇 1 小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
j) Fmoc-Phe-Leu-Pro-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Phe-Phe-Pro-Ser (tBu) -Val-树脂的 制备
加入Fmoc-Phe-OH 58. lg，H0Bt20. 5g，DIC 50. 6g，300mlDMF，将混合物 25°C振摇 1 小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。
加入400ml20% PIP的DMF溶液，25°C振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。
再用无水乙醇洗涤3次。抽干后，放入真空氮气吹干器中氮气吹干，得保护的 HBcAg (18-27)树脂 103g。
k) Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val 的制备
取103g保护的HbcAg (18-27)树脂转移到切肽瓶中，冷却，边搅拌边加入切肽试剂 (TFA/HBr/TIS/EDT = 700ml/28ml/43ml/21ml)，25°C搅拌 4 小时。过滤，减压浓缩，滤液加 无水乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗，P205干燥，获得切肽后的HbcAg (18-27)粗品，约45g。
(2)纯化
将45g HbcAg (18-27)粗品溶于20L纯化水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相 0. 1MNH4AC 乙腈(75-25)，流速为300ml/min。用HPLC跟踪收集所需要的流出液。样品峰 合并后去盐，冻干，得成品12. 5g(MW :11 )，总收率约22%。
其他抗原表位多肽的制备同上述工艺。
实施例2多肽表位的质量控制
多肽表位的质量控制检测项目包括外观、纯度和分子量。[0078]多肽的外观制备的抗原表位肽外观应为白色粉末状；多肽的色谱分析采用 RP-HPLC对多肽进行分析，色谱条件Waters公司C18色谱柱Q50X4. 6mm，5 μ m，IOnm)。流 动相A(含0. 三氟乙酸的乙腈)。流动相B(含0. 三氟乙酸的水)。线性梯度洗脱 0. 01 到 20. OOmin, B 从到 50%，流速1. Oml/min。检测波长220nm。进样量10μ 1。 柱温室温。质量要求纯度> 98% ；多肽的质谱鉴定用30%乙腈水溶液将样品溶解为 0. 05mg/ml的溶液。取0. 51点于样品板上，以0. 5 μ 1 HCCA作为基质溶液进行质谱鉴定。 质量要求多肽分子量的检测结果与理论分子量一致。检测结果见表1。
表1多肽表位HBcAg (18-27)的质量检测结果
权利要求
1.一种用于制备治疗性乙肝疫苗的组合物，其特征在于该组合物是由人体有效剂 量的表位多肽、重组人白介素-12和药用辅料共同组成的冻干制剂，其中表位多肽和重 组人白介素-12重量之比为200 20000 1，其中的表位多肽由来自乙肝病毒蛋白抗 原的 CTL 表位多肽 FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、 IPIPSSWAF, RWMCLRRFII, YMDDVVLGV 和 HTL 表位多肽 AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、 RHYLHTLffKAGILYK 以及通用 HTL 表位多肽 padre 序列 AKFVAAWTLKAAA 组成。
2.根据权利要求
1所述的组合物，其特征在于所述的表位多肽中CTL表位多肽HTL 表位多肽以及通用HTL表位多肽padre序列的重量比为2 1。
3.根据权利要求
2所述的组合物，其特征在于所述的CTL表位多肽、HTL表位多肽以及 通用HTL表位多肽padre序列、重组人白介素-12的重量范围为200yg 6mg IOOyg 3mg 1 μ g 10 μ g。
4.根据权利要求
1所述的组合物，其特征在于所述的药用辅料为甘露醇、蔗糖、白蛋 白、右旋糖酐、聚维酮40、NaCl、水解明胶、乳糖或山梨醇中的至少一种。
5.权利要求
1所述一种用于制备治疗性乙肝疫苗组合物的制备方法，其特征在于包括 以下步骤(1)用Fmoc固相肽合成法合成所需表位多肽；( 在100级以下车间，量取各抗 原表位肽和rhIL-12，加入药用辅料，用注射用水溶解，溶液经0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌， 分装于适当容量玻璃容器瓶中，冷冻干燥，扎盖，包装即得成品。
6.权利要求
1所述的组合物在制备慢性乙肝感染以及预防和治疗乙肝病毒相关肿瘤 的治疗性乙肝疫苗中的应用。
专利摘要
本发明公开了一种治疗性乙肝疫苗及其制备方法和用途，其技术方案的关键是筛选了源自HBV包膜蛋白、核心抗原和多聚酶(polymerase)多个CTL和HTL多肽表位，形成多重抗原肽系统(MAP)，并以重组人的白细胞介素12(rhIL-12)为佐剂，以提高其免疫原性和应答水平，可为临床上慢性乙型肝炎的治疗提供一种治疗性的生物制剂。
文档编号A61P31/20GKCN101361969 B发布类型授权 专利申请号CN 200810026075
公开日2011年5月11日 申请日期2008年1月29日
发明者于源, 叶倩君, 吴思纹, 夏书奇, 张宜俊, 曾振飞, 李平, 段详, 熊伟宏, 王增松, 王翠玲, 王艳, 赵峰, 邱向南, 黄观凤 申请人:广州市恺泰生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan