专利名称:一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和治疗心脑血管疾病的制剂的制备方法，具体为一种用光合 细菌培养液和中草药提取液共同发酵制备预防和治疗心脑血管疾病的制剂的方法。
背景技术：
光合细菌(PSB)是20亿年前地球上最早出现的利用太阳能进行光合作用生长繁 殖的原核古老微生物，能够进行不放氧的光合作用，在自然界C、N、S、P等循环中起着重要 的作用。过去多被应用于有机废水的处理中，近年来逐步认识到菌体的营养价值及一些特 殊的生理活性，其研究开发日益受到世界各国的关注。
丹参为唇形科植物。丹参Silvia miltiorrhiza Bge全国大部分地区都有分布， 南丹参Mlvia bowleyana Durm分布于浙江、江西、福建等省。药用部分为干燥根或根茎。 丹参为一味传统中药，其味苦，微寒。归心、肝经。有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等作用。
现有技术中，已有文献报道丹参的复方或单方制剂具有预防或治疗心脑血管系统 疾病的作用，亦有以丹参复方或丹参为原料制备药品或保健品的方法及其在治疗心脑血管 疾病中的应用的专利报道。如专利号为ZL200510075247. 0的中国发明专利，治疗心脑血 管疾病的中药制剂及其制备方法；专利号为ZL200510011731. 7的中国发明专利，一种治疗 高血脂症的中药组合物及其制备方法；专利号为ZL200510068350. 2的中国发明专利，一种 用于降血脂的中药胶囊及其制备方法；专利号为ZL02157381. 6的中国发明专利，一种治疗 心脑血管疾病的复方丹参滴丸及其制备方法；公开号为CN 101234171A的中国发明专利， 一种具有降血脂、防治心脑血管疾病的保健品及其制备方法，等等。
已有报道光合细菌制剂的制备及其应用的文献。如专利号为94106408. 5的中国 发明专利，光合细菌的应用及利用它制得的产品；申请号为02110316. X的中国发明专利， 光合细菌制剂的制备方法；专利号为00120974. 4中国发明专利，一种治疗恶性肿瘤的中药 制剂及制备方法；申请号为99107591. 9.的中国发明专利，光合细菌作为医药保健品的应 用及其制作方法及其产品；公开号为CN1970025A的中国发明专利，六味地黄汤的中药生物 制剂及制备方法；公开号为CN1775944A的中国发明专利，一种光合细菌的培养及制剂 ’专 利号为01800254. 4的中国发明专利，红色光合细菌及其健康食品，等等。
上述已有技术中亦有用光合细菌转化中草药制备药物的报道，但所用中草药均为 复方，中药复方开发成现代中药最重要的必须经过处方分析，拆方研究，建立质量标准，从 研究时间及经费上存在很大困难，何况又用光合细菌进行了转化，成分会更加复杂，加大了 开发成药物的困难，且其专利报道中无任何化学成分说明。
发明内容
本发明的目的是提供一种预防和治疗心脑血管疾病制剂制备方法，该方法采用光 合细菌培养液和丹参提取液，通过混合发酵并对有效成分进行浓缩处理制成各种口服制 剂，生产方法简便，产品无毒，降血脂、降血粘度作用显著，容易吸收，生物利用度高，可用于制备预防和治疗心脑血管疾病的药物。
本发明采用的技术方案是一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法，包括 以下步骤
(1)在经过灭菌的光合细菌培养基中接入1/10份数光合细菌菌种，在光照、厌氧 条件下，培养3-5天，作为光合细菌种子培养液；
(2)将丹参粉碎，用丹参原药材质量5-35倍体积的任意浓度的醇液，分1-4次回流 提取，每次0. 5-1小时，合并提取液，回收提取液中的醇至无醇味，得醇提取物，滤渣加水提 取1-3次，每次0. 5-1小时，合并滤液，和醇提取物合并，得丹参提取液；或者用丹参药材质 量5-35倍体积的水1-4次煎煮提取，每次0. 5-1小时，合并滤液，得丹参提取液；将丹参提 取液浓缩或者用光合细菌培养基或水稀释，调整丹参提取液体积至丹参原药材质量的3-10 倍体积，调pH至6-10，120-125°C灭菌20-40min，制得丹参提取液灭菌溶液；
C3)在丹参提取液灭菌溶液中按10 (1- 的体积比接入光合细菌种子培养液， 在500-3000LUX光照厌氧条件下，培养5-30天，制成光合细菌转化丹参培养液；
(4)将光合细菌转化丹参培养液2000-7000r/min离心，上清液过大孔吸附树脂 柱，先用水洗，然后用30% -100%的甲醇或乙醇水溶液洗脱，得上清液醇洗脱液，沉淀用 30% -100%甲醇或乙醇液超声或回流提取1-5次，得沉淀醇提取液，合并上清液醇洗脱液， 浓缩，再制备成不同的口服制剂胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂等制剂；
以上步骤中质量单位为g，体积单位为ml ；
所述的丹参为唇形科植物丹参Silvia miltiorrhiza Bge或南丹参 Salviabowleyana Dunn,光合细菌为红螺菌属RhodospiriIlium、红假单胞菌属 lihodopseudomonas、红细菌属Rodobacter中的任意一株菌或它们的任意组合。
为了取得预防和治疗心脑血管疾病的更好疗效，做为优选的技术方案，所述的 红螺菌属Rhodospiri 11 ium为深红红螺菌(Rhodospiri 11 ium rubrum)；红假单胞菌属 Rhodopseudomonas为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、绿色红假单胞菌 (Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌(Rhodopseudomonas sulfoviridis)、 海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)；红细菌属Rodobacter为球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides)。
上述菌种文献的出处姚竹云，张肇铭.几株光合细菌的表型特征及其DNA-DNA 同源性分析.应用与环境生物学报，1996，2(1) :84-89;张肇铭，杨素萍，赵春贵.沼泽红假 单胞菌的分离鉴定研究.山西大学学报(自然科学版)，1992，(4) :379-385;杨素萍，张肇 铭，赵春贵.绿色红假单胞菌和绿硫红假单胞菌的分离与鉴定.微生物学报，1995，35 O) 91-96;张肇铭，邓松录，赵良启，等.紫色非硫光合细菌的研究A.球形红假单胞菌的分离、 鉴定和生理特性的研究.山西大学学报(自然科学版)，1984，(4) :54-59。
这些菌种可以从山西省太原市山西大学生命科学与技术学院光合细菌研究室得 到。
所述适合光合细菌生长的培养基，可以采用现有技术中的光合细菌培养基，本发 明优选以下培养基，其组成为
乙酸钠1000-2000mg CaCl2. 2H20 50_100mg
MgSO4. 7H20 100-300mg EDTA10_30mg[0021]酵母 500-1500mgK2HPO4500-1500mg[0022](NH4)2SO41000-2000mgKH2PO4400-1000mg[0023]FeSO4.,7H205_15mg微量元素溶液l-5ml[0024]去离子水1000-2000ml pH6-8[0025]其中微量元素溶液组成为[0026]H3BO3200-300mgNa2MoO4. 2H20 50-IOOmg[0027]CuSO42-10mgMnSO4. 4H20150-250mg[0028]ZnSO4.,7H2020-30mg去离子水100-200ml[0029]公开号为CN100431557C的中国专利公开了-一种预防和治疗肿
方法，是用光合细菌培养液和槲寄生醇提取液混合发酵制成的光合细菌转化槲寄生活菌制 剂或灭菌制剂。在光合细菌转化中草药的领域内，中药的种类不同，其物理、化学和药理作 用是不同的，丹参含有大量的水溶性有效成分，必须经过水提取。中药提取方式和培养条件 是影响产品药效和生物利用度的关键。实验证明，利用光合细菌转化槲寄生活菌制剂和灭 菌制剂的方法和培养条件来进行光合细菌转化丹参不能得到理想的实验结果。因此，对于 光合细菌转化丹参的技术难点在于中药提取和培养步骤的调整、培养条件的选择以及培养 液中有效成分的浓缩。
对光合细菌转化丹参培养液的化学成分进行研究，结果表明丹参提取液经过光合 细菌转化以后，由于光合细菌的生物转化功能使光合细菌转化丹参培养液中的成分发生了 很大变化。实验过程为将光合细菌培养液、丹参提取液、光合细菌转化丹参培养液，分别于 5000r/min离心。上清液过DlOl大孔吸附树脂柱，先用水洗，然后用95%的乙醇洗脱，得上 清液醇洗脱液；沉淀用95%的乙醇水溶液超声提取2次，每次30分钟，得沉淀醇提取液，合 并上清液醇洗脱液。浓缩，干燥。分别进行电喷雾质谱(ESI-MS)分析。由
图1、2、3可知， 光合细菌转化丹参培养液产生了 m/z 175. 2，179. 3，313. 2，399. 5，429. 0,551. 5，573. 6 的 新离子，光合细菌培养液，丹参提取液中均没有出现。另外，光合细菌培养液或丹参提取液 中出现过的离子，峰的强度亦发生了很大变化，例如m/z 417. 4,717. 5等的峰。
与现有技术相比本发明具有如下有益效果
第一，本发明制备的光合细菌转化丹参制剂是丹参经过光合细菌代谢的中药生物 制剂，降低血脂、血粘度效果显著，优于丹参。在用于预防和治疗心脑血管疾病的保健食品 和药物的应用方面，均有明显的效果。
结合以下动物实验对光合细菌转化丹参制剂在高血脂大鼠降血脂、抗氧化作用及 对血液流变学指标调节作用进行说明。实验采用健康雄性Wistar大鼠60只，随机分组， 每组10只，即正常组、模型组、血脂康组(阳性对照组)、丹参提取物组、光合细菌培养液组 及光合细菌转化丹参培养液组。空白组给基础饲料，其余5组均喂饲高脂饲料(高脂饲料 配方1 %胆固醇，10 %猪油，10 %蛋黄粉，0. 2 %胆盐，78. 8 %基础饲料)。同时空白组及模 型组给予同体积水，其余4组分别给血脂康胶囊、丹参提取物、光合细菌培养液、光合细菌 转化丹参培养液，均为灌胃给药，每天一次，连续45天，末次给药后禁食12h，次日眼眶取 血1ml，分离血清，分别测定血清TC (总胆固醇)、TG (甘油三脂)、LDL-C (低密度脂蛋白)， HDL-C (高密度脂蛋白)，并计算脂质系数HDL-C/LDL-C (结果见表1)。继续喂养1周后，下腔 静脉取血5ml，进行全血粘度、血浆粘度、红细胞压积血液流变学指标测定(结果见表幻；取Iml血分离血清，进行血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化脂质(LPO)降解产物丙二醛(MDA) 和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抗氧化指标的测定(结果见表3)。
表1光合细菌转化丹参培养液对高血脂大鼠血脂水平的影响
权利要求
1.一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)在经过灭菌的光合细菌培养基中接入1/10份数光合细菌菌种，在光照、厌氧条件 下，培养3-5天，作为光合细菌种子培养液；(2)将丹参粉碎，用丹参原药材质量5-35倍体积的任意浓度的醇液，分1-4次回流提 取，每次0. 5-1小时，合并提取液，回收提取液中的醇至无醇味，得醇提取物，滤渣加水提取 1-3次，每次0. 5-1小时，合并滤液，和醇提取物合并，得丹参提取液；或者用丹参药材质量 5-35倍体积的水1-4次煎煮提取，每次0. 5-1小时，合并滤液，得丹参提取液；将丹参提取 液浓缩或者用光合细菌培养基或水稀释，调整丹参提取液体积至丹参原药材质量的3-10 倍体积，调PH至6-10，120-125°C灭菌20-40min，制得丹参提取液灭菌溶液；(3)在丹参提取液灭菌溶液中按10 (1- 的体积比接入光合细菌种子培养液，在 500-3000Lux光照厌氧条件下，培养5-30天，制成光合细菌转化丹参培养液；(4)将光合细菌转化丹参培养液2000-7000r/min离心，上清液过大孔吸附树脂柱， 先用水洗，然后用30% -100%的甲醇或乙醇水溶液洗脱，得上清液醇洗脱液，沉淀用 30% -100%甲醇或乙醇液超声或回流提取1-5次，得沉淀醇提取液，合并上清液醇洗脱液， 浓缩，再制备成不同的口服制剂胶囊剂、颗粒剂、滴丸剂；以上步骤中质量单位为g，体积单位为ml ；所述的丹参为唇形科植物丹参Silvia miltiorrhiza Bge或南丹参&ilviabowleyana Dunn，光合细菌为红螺菌属Rhodospirillium、红假单胞菌属Rhodopseudomonas、红细菌属 Rhodobacter中的任意一株菌或它们的任意组合。
2.根据权利要求
1所述的一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法，其 特征在于所述的红螺菌属Rhodospirillium为深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)；红假单胞菌属Rhodopseudomonas为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、绿色红假单胞菌(Rhodopseudomonas viridis)、绿硫红假单胞菌 (Rhodopseudomonassulfoviridis)、海洋红假单胞菌(Rhodopseudomonas marina)；红细菌 属 Rhodobacter 为球形红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。
3.根据权利要求
1所述一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法，其特征在于 步骤O)中所述的醇液是甲醇液或乙醇液。
4.根据权利要求
1所述的一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法，其特征在 于步骤( 所述的丹参提取液浓缩时，是在丹参提取液中配入任意浓度的光合细菌培养 基后将体积调整至丹参原药材质量3-10倍体积。
专利摘要
一种预防和治疗心脑血管疾病制剂的制备方法，该方法是在丹参的醇或水提取液中按10∶(1-5)的体积比接入光合细菌种子培养液，在500-3000Lux光照厌氧条件下，培养5-30天，制成光合细菌转化丹参培养液，将光合细菌转化丹参培养液2000-7000r/min离心，上清液过大孔吸附树脂柱，先用水洗，然后用醇洗脱，收集醇洗脱液得上清液醇洗脱液，沉淀用醇液超声或回流提取1-5次，得沉淀醇提取液，合并上清液醇洗脱液，浓缩，再制备成不同的口服制剂。该方法生产简便，降血脂、降血粘度作用显著，容易吸收，生物利用度高，有效成分含量高，可用于制备预防和治疗心脑血管疾病的药物。
文档编号A61P9/00GKCN101579400 B发布类型授权 专利申请号CN 200910074560
公开日2011年5月25日 申请日期2009年6月24日
发明者张肇铭, 杨官娥, 杨飞, 秦娟 申请人:山西医科大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan