专利名称：一种治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物及其制备方法
技术领域：
本发明属于中药研制领域，涉及一种治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物，同时涉及制备该药物的中间体黄蜀葵花总素的提取方法及黄蜀葵花总素制剂即治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物的制备方法。
目前肾小球肾炎的治疗药物适应范围局限，毒副反应大。例如皮质激素主要适用于肾病综合征I型，且副作用大;雷公藤制剂常因其肝脏毒性而被迫中断治疗，使病情反复。
本发明的目的在于利用黄蜀葵花研制一种新的中药制剂，将其作为治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物。
锦葵科秋葵属植物黄蜀葵Abelmoschusmanihot(L.)Medic.的花，在《嘉祜本草》、《本草纲目》等历代本草书籍中有所记载，文献报告其功用为通淋、消肿、解毒，主治淋病、痈疽肿毒、汤火烫伤等。
由于黄蜀葵花的加工、贮藏技术不过关，且又极易变质，所以国内一直没有商品化生产，从未正式作为中药材在临床应用，更无其药品的研究，对其药效作用认识很局限。
本发明的另一目的是提供一种制备上述治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物的中间体--黄蜀葵花总素的提取方法，以及黄蜀葵花总素制剂的制备方法。
本发明的目的是以下述方式实现的首先提取中间体，即黄蜀葵花总素，用已知的方法将黄蜀葵花用乙醇回流，取其滤液，减压回收乙醇，获取黄蜀葵花清膏，其关键是还含有去沉淀工艺过程，将黄蜀葵花清膏静置冷却至室温，去除表面不溶物，或加3-5倍量水，冷藏，过滤，即得黄蜀葵花总素。上述去沉淀工艺过程与现有技术提供的沸水溶解过滤的方法相比，具有省时节能的效果，并且操作简单，也无需特殊的设备。
黄蜀葵花主要有效成分之一是黄酮类化合物，经测定可知，黄酮类化合物主要存在于黄蜀葵花的花冠(带雄蕊、花柱)之中，而在黄蜀葵花的子房、萼片、苞片及花柄中几乎不含黄酮类成分。据此，在上述制备黄蜀葵花总素的工艺过程中最好能再增加对黄蜀葵花进行前处理的工艺过程，即只选取黄蜀葵花的花冠(带雄蕊、花柱)部分，用其作为生产黄蜀葵花总素的原料。
下面通过具体实施例对黄蜀葵花总素的提取方法作进一步详述。①前处理选取黄蜀葵花的花冠(带雄蕊、花柱)，将其制成粉末;
②热回流取上述工艺过程获得的黄蜀葵花粉末100公斤，加70%乙醇1200公斤，于多功能提取罐中热回流2小时，趁热过滤，再加70%乙醇800公斤，热回流1小时，过滤，弃去药渣;
③回收乙醇将由工艺过程②获得的滤液在减压浓缩罐中回收乙醇，浓缩至33000ml;
④去沉淀将由工艺过程③获得的浓缩液静置12小时，去除凝结在表面的油脂类不溶性物质，即得黄蜀葵花总素，黄蜀葵花总素干燥后得率24%。
①前处理与实施例1的工艺过程①相同;
②热回流取由工艺过程①获得的黄蜀葵花粉末10公斤，加70%的乙醇180公斤，于减压浓缩罐中热回流1.5小时，趁热过滤，弃去药渣;
③回收乙醇将由工艺过程②获得的滤液继续在减压浓缩罐中回收乙醇，并浓缩至3800ml;
④去沉淀在由工艺过程③所得的浓缩液中加水至10000ml，冷藏，过滤，弃去残渣，即得黄蜀葵花总素，黄蜀葵花总素干燥后得率22%。①前处理与实施例1的工艺过程①相同;
②热回流取由工艺过程①获得的黄蜀葵花粉末100公斤，加95%的乙醇1200公斤，于多功能提取罐中热回流2小时，趁热过滤，再加95%乙醇800公斤，热回流1小时，过滤，弃去药渣;
③回收乙醇与实施例1的第③步工艺过程相同;
④去沉淀与实施例1的第④步工艺过程相同，只是其黄蜀葵花总素的得率为21%。①前处理与实施例1的工艺过程①相同;
②热回流取由工艺过程①获得的黄蜀葵花粉末10公斤，加95%的乙醇180公斤，于减压浓缩罐中热回流1.5小时，趁热过滤，弃去药渣;
③回收乙醇与实施例2的工艺过程③相同;
④去沉淀与实施例2的工艺过程④相同，只是其黄蜀葵花总素的得率为20%。
利用上述方式得到的黄蜀葵花总素的理化性质如下1、总黄酮含量按《中国药典》1990年版第315页[含量测定]方法测定，本品干燥后含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计算大于8%。
2、黄蜀葵花总素槲皮素组分高效液相色谱图(见附图
)具体测试方法为①样品黄蜀葵花总素标准品槲皮素，北京药品生物制品检定所。
②样品水解处理方法称取1克样品，加6%H2SO4微沸水解40分钟，冷却后用乙醚～石油醚萃取槲皮素组分，萃取液用二次水洗至中性，脱水后，减压蒸馏近干，用乙醇定容至10ml，吸取5μl左右注入HPLC系统分析。
③色谱条件柱Nucleosil-ODS，7μ φ5×250mm，柱温30℃，流动相∶甲醇∶水∶冰醋酸＝60∶39∶1。流速1ml/分。波长254nm，衰减8×10-2。
②定性方法HPLC方法。用槲皮素标准品的保留时间与被测组分的保留时间相对照，再用槲皮素标准品峰高增加验证，然后确定被测样品中是否含有槲皮素组分。
⑤结果色谱分离结果表明三个样品中均含有槲皮素组分3、黄蜀葵花总素理化鉴定试验供试品溶液制备取黄蜀葵花粗粉15克，加乙醇150ml，热回流1小时，趁热滤过，浓缩，加水至30ml，冷藏，滤过，滤液即为黄蜀葵花总素供试品溶液。
取上述供试品溶液1ml，加镁粉少许，再滴入6N盐酸数滴，必要时在沸水中加热3分钟，溶液显樱红色。
取上述供试品溶液点于滤纸片上，喷洒1%三氯化铝乙醇溶液，干燥后，于紫外灯光下呈黄色荧光。
取上述供试品溶液1ml，加1%三氯化铁试剂1～2滴，呈墨绿色。
取上述供试品溶液点在滤纸片上，喷洒三氯化铁-铁氰化钾试剂，呈蓝色斑点。
取上述供试品溶液1ml，加入新配制的斐林试剂4～5滴，在沸水浴上加热数分钟，产生红棕色沉淀。
取上述供试品溶液10ml，加20ml斐林试剂，在水浴上加热10分钟，滤去沉淀，取滤液少许，滴加斐林试剂，确证已无沉淀反应，然后在滤液中加2ml盐酸，煮沸20分钟，加10%氢氧化钠溶液使呈碱性，再加斐林试剂沸水浴上加热，又产生沉淀反应。
取上述供试品溶液1ml，加入5%α-萘酚乙醇液2-3滴，摇匀，沿试管壁缓缓加入少量浓硫酸，与浓硫酸接触面产生紫红色环。
在用上述方法获得的黄蜀葵花总素的基础上，即可制备治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物，将黄蜀葵花总素作为药物活性成份，直接或与药学上通常用于该类制剂的固体或液体载体混合加工制成片剂、丸剂、胶囊、口服液、注射剂、冲剂等适宜的剂型。
当利用黄蜀葵花总素直接作为本发明的药物时，为便于服用，可将其装入胶囊中;当将黄蜀葵花总素作为药物活性成份与其他辅助剂混合加工成不同类型的剂型作为本发明的药物时，其辅助剂配入量视辅助剂种类的不同而有所差异。如果所选辅助剂为糊精或淀粉，则黄蜀葵花总素与糊精或淀粉以1∶1～1∶4的比例进行配合比较适宜，其最佳配比为1∶4;如果所选辅助剂为黄蜀葵花细粉末，则黄蜀葵花总素与黄蜀葵花细粉末以1∶1～1∶1.5的比例进行配合比较适宜，其最佳配比为1∶1;如果所选辅助剂为蒸馏水或去离子水，则黄蜀葵花总素与蒸馏水或去离子水以1∶1～1∶4的比例进行配合比较适宜，其最佳配比为1∶3(作为口服液或注射剂)。
下面我们继续通过实施例对黄蜀葵花总素制剂的生产方法作进一步详述[实施例5]取黄蜀葵花总素干燥，粉碎，过40目筛，按0.1克/粒装胶囊。取黄蜀葵花总素按1∶4加糊精或淀粉，干燥，粉碎，制粒，压片或制成丸剂。取黄蜀葵花总素按1∶1加黄蜀葵花细粉末，干燥，粉碎，制粒，压片或制成丸剂。取黄蜀葵花总素按1∶3加蒸馏水或去离子水，灌装，灭菌。取黄蜀葵花总素2公斤，溶入甜菊甙10克，加95%的乙醇适量，与8公斤糊精搅拌均匀，制成颗粒，60℃热风循环干燥，整粒。
取黄蜀葵花总素按1∶3加蒸馏水，用活性炭去鞣质，调至等渗，PH中性，灌装，灭菌。
用上述方法所得的黄蜀葵花总素及其制剂具有治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的作用，换言之可将其作为治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物。给药方法为口服或注射，每日给药量3～6克(以黄蜀葵花总素计)，一个月为一疗程。
用本发明提供的治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物治疗30例原发性肾小球肾炎患者，近期缓解10例，有效12例，近期总有效率73.3%，未发现对肝、肾功能、血常规有不良影响。
用本发明提供的治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物治疗5例乳糜尿患者，全部治愈。
下面用药理试验结果阐明其药效作用Ⅰ.黄蜀葵花总素制剂治疗家兔系膜增殖性肾炎的实验研究一、试验目的反复小剂量注射牛血清白蛋白(BSA)造成的兔系膜增殖性肾炎，与人类受到反复感染后导致的进行性慢性肾炎完全相似，后者与中医湿热毒邪致病的病理过程相似。本实验观察家兔系膜增殖性肾炎(MsPGN)的病理生理过程以及黄蜀葵花总素治疗该模型的疗效及其作用机理。
二、试验材料1、动物采用江苏省农科院兔场提供的新西兰纯种雄性白兔42只，健康成年，体重2.5±0.5kg/只。
2、受试物黄蜀葵花总素，南京中医学院中药研究室提供，批号900300;肾炎四味片，市售。
三、模型及方法(一)动物模型的复制动物模型的复制采用北京医科大学第一附属医院章友康等介绍的家兔慢性血清病所致系膜增殖肾炎的方法。
1、预免疫每只兔背部皮下分点注射完全弗氏佐剂1ml含10mgBSA。
2、致病免疫(简称免疫)预免疫1周后，每只兔耳静脉注射BSA10mg，每日一次，连续四日，以后每日一次耳静脉注射BSA25mg共六周，最后一周BSA剂量加倍。
3、辅助免疫①预免疫后1周、2周、背部皮下分点注射不完全弗氏佐剂外，同时从耳静脉注射1ug大肠杆菌内毒素。
(二)实验分组新西兰白兔42只，适应性喂养10天，尿蛋白定性检测阴性，按体重随机分为4组，除病理对照组12只兔外，每组均为10只兔。
1、病理对照组作MsPGN造型，不给任何药物。
2、空白对照组不给任何药物亦不造型。
3、阳性药物对照组，从造型第三周开始喂服市售肾炎四味片1.0g/kg·兔·d。
4、治疗组造型第三周开始喂服黄蜀葵花干浸膏粉1.2g/kg·兔·d。
各组兔子均喂养混合饲料150克/兔/日左右，全部兔子于第八周末处死，尸检取肾组织。
(三)观察检查1、尿化学检查尿蛋白定性5%磺柳酸法;尿蛋白定量(mg/24hr)双缩脲比色法2、肾功能检查血肌酐(Scrμmol/L)BECKMAN测定仪，氧化电极法。
血尿素氮(BUNmmol/L)同Scr。
3、血液流变学采用上海第一医学院生产的XN3型血粘度及血细胞电泳仪，按照上海第一医学院报道的方法测定。
4、免疫学检查(1)循环免疫复合物(CIC)PEG沉淀法(2)红细胞免疫复合物(RBC-IC)花环试验及红细胞C3b受体(RBC-C3b)花环测定。
(3)T细胞亚群测定OKT3，OKT4，OKT8单克隆抗体由卫生部武汉生物制品研究所提供。
5、血脂甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)BECKMAN生化分析仪、酶法;高密度脂蛋白固醇(HDL)PEG分离酶反应法。
6、肾组织学检查光镜肾标本用HE、PAS、PASM、PTH四种方法染色，观察肾组织的病理变化，如肾小球大小、细胞数多少，肾小球基底膜(GBM)有无增厚，系膜基质有无增多和肾小球内有无微血栓形成等。
电镜观察肾脏超微结构及有无电子致密物沉积等。
免疫荧光直接免疫荧光，用羊抗兔IgG，观察肾小球内有无IgG沉积及其分布情况。
四、结果(一)尿蛋白变化1、尿蛋白定性免疫两周后部分造型家兔尿蛋白定性阳性，程度±～+，第四周时全部造型家兔尿蛋白定性为阳性，程度±～++，此结果与章友康等报道基本一致。
2、尿蛋白定量免疫第四周测病理组24小时尿蛋白定量为147.87±32.29mg，标志此时MsPGN模型已形成。第五周、第八周24小时尿蛋定量，肾炎四味片组、治疗组均显著低于病理对照组。与肾炎四味片组比较，第八周治疗组尿蛋白定量下降显著(P＜0.02)，治疗组尿蛋白定量第八周与第五周相比均呈明显下降趋势(P＜0.01～0.001)，见表1。
表1各组尿蛋白定量变化(mg/24hrM±SE)尿蛋白定量第五周第八周病理对照组112.23±9.98121.94±16.71肾炎四味片组75.69±5.45※※71.59±3.30※※治疗组72.91±3.46※※55.74±4.59※※※▲与病理组比※※P＜0.01※※※P＜0.001与肾炎四味片组比▲P＜0.02(二)肾功能情况，第八周时病理组血尿素氮明显高于肾炎四味片组、治疗组(P＜0.02～0.01)，各组血肌酐水平无显著差异，见表2。
表2各组血尿素氮、肌酐变化M±SEBUNScr(mmol/L)(μmol/l)病理对照组7.95±0.5472.49±14.14空白对照组6.67±0.5275.14±22.98肾炎四味片组6.14±0.24※※70.72±4.42治疗组6.16±0.24※※70.72±3.54与病理组比※※P＜0.02(三)血液流变学改变，第八周末病理组血液沉降率及K值均明显高于其它各组(P＜0.02～0.01)见表3，空白对照组K值低于肾炎四味片组(P＜0.05)表3各组血液流变学改变M±SE全血比粘度血沉血浆比粘度压积K值病理对照组3.7414.601.6433.9032.16±0.11±3.92±0.26±1.87±7.21空白对照组4.281.88※※1.5441.636.79※※±0.17±1.36±0.83±1.39±1.95▲肾炎四味片组4.033.75※1.5434.759.44※±0.15±0.7±0.04±1.46±1.45治疗组3.803.33※1.4034.677.21※※±0.10±0.6±0.03±0.97±0.57
与病理组比※P＜0.02※※P＜0.01与肾炎四味组比▲P＜0.05(四)免疫学检验情况1、CIC，第八周末正常对照组CIC明显低于其它各组(P＜0.05～0.01)治疗组CIC水平呈下降趋势，但与病理组、肾炎四味片组相比，差别无统计意义，见表4。
表4各组CIC分析M±SECIC病理对照组40.53±14.70△空白对照组7.30±3.14肾炎四味片组31.76±5.70△△治疗组27.26±3.25△△与空白组相比△P＜0.05△△P＜0.012、红细胞免疫粘附功能第八周肾炎四味片组、治疗组RBC-IC均显著高于病理组和空白组(均P＜0.001)，各组RBC-C3b无明显差异(P＞0.05)，见表5。
3、T细胞亚群，第八周末病理组T3、T8均明显降低，T4则无明显变化，T4/T8值则显著高于空白组、治疗组(P＜0.01～0.05)，空白组、肾炎四味片组、治疗组T3、T4、T8、T4/T8值之间均无显著差异。见表6。
表5各组红细胞免疫粘附功能(%M±SE)RBC-ICRBC-C3b病理对照组7.20±0.448.50±0.69空白对照组3.88±0.237.56±0.59肾炎四味片组12.19±0.80※※※7.44±0.67△△△治疗组13.44±0.73※※※7.56±0.49△△△与病理组比※※※P＜0.001与空白组比△△△P＜0.001表6各组T淋巴细胞亚群变化(%M±SE)T3T4T8T4/T8病理对照组25.25±0.6121.39±0.5610.42±0.442.08±0.09空白对照组28.37±0.75※※21.05±0.4312.40±0.47※※1.72±0.07※肾炎四味片组27.75±0.65※21.19±0.5611.74±0.47※1.83±0.09治疗组29.55±0.76※※※21.85±0.5312.98±0.53※※1.71±0.09※与病理组比※P＜0.05※※P＜0.01※※※P＜0.001(五)血脂第八周末空白组TC、TG显著低于病理组(P＜0.02～0.001)HDL显著高于病理组(P＜0.002);肾炎四味片组、治疗组之间各血脂指标值无显著差异，但TC均显著低于病理组(P＜0.02～0.01)，见表7。
表7各组血脂变化(mmol/LM±SE)TCTGHDL病理对照组2.17±0.240.87±0.160.54±0.03空白对照组1.58±0.22※0.34±0.07※※※0.70±0.08※肾炎四味片组1.63±0.14※0.67±0.120.57±0.05治疗组1.74±0.13※0.75±0.150.57±0.06与病理组比※P＜0.02※※P＜0.01※※※P＜0.001(六)肾组织学检查光镜检查1、病理对照组全部肾标本均呈弥漫性肾小球系膜增生，①肾小球内细胞数明显增多，从分布判断以系膜细胞为主，②肾小球系膜基质增多较明显，有的系膜基质呈网络状，③肾小球肿胀、增大，部分肾小球囊腔狭小，甚者可见与包曼氏囊粘连，特殊染色未显示GBM增厚，PTH染色偶可显示肾小球内有血栓形成，肾小管及间质基本正常，有的肾小管内可见管型。
2、肾炎四味片组、治疗组二组肾小球系膜增生及肾小球直径明显低于病理对照组(均P＜0.001)。与肾炎四味片组相比，治疗组肾小球平均直径和细胞数均明显降低(P＜0.01～0.001);见表8。
表8各组光镜下肾组织检查情况M±SE肾小球直径肾小球细胞数(um)(个)病理对照组121.13±1.6780.39±1.35空白对照组92.91±2.12※※※54.56±0.48※※※▲▲▲▲▲▲肾炎四味片组105.64±1.65※※※67.62±1.23※※※治疗组98.88±1.49※※※59.73±1.04※※※▲▲▲▲▲与病理相比※※※P＜0.001与肾炎四味片比▲▲P＜0.01▲▲▲P＜0.001免疫荧光治疗组肾炎四味片组和空白组肾标本IgG免疫荧光均呈阴性，病理组肾小球内有较明显的IgG呈颗粒样沉积于系膜区，荧光强度++。
电镜检查病理组肾小球系膜区有不规则的，大小不一，密度均匀的电子致密物沉积;肾炎四味片组系膜区较少量免疫复合物;治疗组偶见系膜区极少量免疫复合物，各造型组GBM和上皮细胞足突形态均基本正常。
五、评价1、黄蜀葵花总素制剂对家兔实验性MsPGN的治疗作用本实验性肾炎模型病理组的临床表现及病理改变与章友康报道的家兔MsPGN模型基本相同，章氏未检测其BUN水平，本实验则提示该模型BUN水平轻度升高，且有血沉及K值增高的轻度血瘀改变。治疗组各项检测结果表明，黄蜀葵花总素制剂可显著减轻该模型尿蛋白量，使BUN水平，血沉及K值降至正常范围，并明显改善肾小球系膜增殖的病理改变。其疗效在减轻尿蛋白量及肾脏病理方面优于肾炎四味片。
2、黄蜀葵花总素制剂对家兔实验性MsPGN模型免疫功能的影响本实验显示黄蜀葵花总素制剂可使MsPGN模型CIC水平呈下降趋势，RBC-IC明显升高、T3、T8亦明显升高，免疫荧光及电镜检查显示治疗组系膜区免疫复合物沉积明显减少，表明该药可能具有提高红细胞免疫粘附力，促进CIC的转运与消除，同时调节细胞免疫功能，抑制体液免疫反应程度，从而减轻CIC介导性肾损伤的作用。
Ⅱ.黄蜀葵花总素制剂急性毒性实验(一)灌胃法小鼠20只，雌雄均用，以30%黄蜀葵花总素液作最大容量一日3次灌胃一天(剂量22.5g/kg)，给药后可见自发活动减少，呼吸轻度加快，纳食减少，次日上述症状消失，连续观察7天，无一死亡。此灌胃剂量是人体日口服治疗量375倍。
(二)腹腔注射法另取小鼠20只，雌雄均用，腹腔注射黄蜀葵花总素1.062g/kg，仅在给药后当天出现自发活动减少，纳食稍差，次日症状便消失，连续观察7天无一死亡。
权利要求
1.一种治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物，其特征在于它由黄蜀葵花总素构成。
2.根据权利要求1规定的治疗肾小球疾病及乳糜尿的药物，其特征是还配合辅助剂，作为药物活性成分的黄蜀葵花总素与辅助剂的种类及配比为a、黄蜀葵花总素20%～50%，糊精或淀粉50%～80%;或b、黄蜀葵花总素40%～50%，黄蜀葵花细粉末50%～60%;或c、黄蜀葵花总素20%～50%，蒸馏水或去离子水50%～80%。
3.一种黄蜀葵花总素的提取方法，包括下列工艺过程(1)将黄蜀葵花用乙醇回流，取其滤液;(2)然后减压回收乙醇，获取黄蜀葵花醇提物;(3)在黄蜀葵花醇提物中去除杂质;其特征在于所述在黄蜀葵花醇提物中去除杂质的工艺过程为，将黄蜀葵花醇提物静置冷却至室温，去除表面不溶物，或加3～5倍量水，冷藏，过滤。
4.根据权利要求3规定的黄蜀葵花总素的提取方法，其特征在于还含有黄蜀葵花的前处理工艺过程，即只选取黄蜀葵花的花冠(带雄蕊、花柱)部分，用其作为提取黄蜀葵花总素的原料。
5.黄蜀葵花总素制剂的制备方法，其特征在于用权利要求3或4所述方法获得的黄蜀葵花总素为药物活性成分，直接或与药学上通常用于该类制剂的固体或液体混合制成适宜的剂型。
6.根据权利要求5规定的黄蜀葵花总素制剂的制备方法，其特征在于所述的载体为a、糊精或淀粉，将黄蜀葵花总素与糊精或淀粉按1∶1～1∶4混合，以已知方法干燥，粉碎，制粒;或b、黄蜀葵花细粉末，将黄蜀葵花总素与黄蜀葵花细粉末按1∶1～1∶1.5混合，以已知方法干燥，粉碎，制粒;或c、蒸馏水或去离子水，将黄蜀葵花总素与蒸馏水或去离子水按1∶1～1∶4混合，以已知的方法灌装，灭菌;或d、蒸馏水或去离子水，将黄蜀葵花总素与蒸馏水或去离子水按1∶1～1∶4混合，用活性炭去鞣质，调至等渗，PH中性，以已知的方法灌装，灭菌。
全文摘要
本发明提供了一种治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物。利用黄蜀葵花总素作为药物活性成分。介绍了黄蜀葵花总素的提取方法，包括黄蜀葵花的前处理，乙醇热回流，回收乙醇，去沉淀等工艺过程，同时提供了黄蜀葵花总素直接或与药学上通常用于该类制剂的固体或液体载体混合制成适宜的剂型，作为治疗原发性肾小球疾病及乳糜尿的药物的制备方法。
文档编号A61K31/35GK1088826SQ9311050
公开日1994年7月6日 申请日期1993年1月1日 优先权日1993年1月1日
发明者熊宁宁 申请人:南京中医学院