专利名称：大潜在转化生长因子-β复合物及其有用结构物的生产方法
技术领域：
本发明涉及转化生长因子-β(TGF-β)。具体说，本发明涉及在真核细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))表达大潜在TGF-β复合体。同时，本发明也描述了在真核细胞中表达这种大潜在TGT-β(LL-TGF-β)复合体及其后来对该复合体的纯化。本发明进一步涉及以上所述的rLL-TGF-β中分离大潜在相关肽(L-LAP)的一种方法。
转化生长因子-β是一大类对许多类型细胞具有潜在细胞调节活性的蛋白质。(参见Roberts和Sporn，肽生长因子和它们的受体I，419-472，1990)。人TGF-β的三种同型异构体(TGF-β1，-β2，β3)已经被确定且其特征也已搞清楚。TGF-β1是首次被鉴定作为一种生长因子，它可在半固体琼脂上刺激一些啮齿类动物成纤维细胞生长。然而现在越来越清楚地认识TGF-β1，对许多不同类型的细胞来说也是一种潜在生长抑制物，一种细胞分化的调节剂和一种细胞外基质的生产和沉积作用的诱导物。
TGF-β1作为一种高分子量的潜在复合体可由广泛的多种多样正常和肿瘤细胞产生。从人的血小板(Miyazono et al.，J.Biol.Chem.263，6407-6415，1988;Wakefield et al.，J.Biol.Chem.263，7646-7654，1988)和大鼠血小板(Okada et al.，J.Biochem.106，304-310，1989)纯化后的潜在TGF-β1的结构已经被确定。已经使用人红白血病细胞系搞清了它的生物合成(Miyazono et al.，EMBO J.10，1091-1101，1991)。
这种潜在型的TGF-β1是由三种不同的组分组成1)成熟的TGF-β1;2)TGF-β1前体的N-末端残余部分;3)潜在的TGF-β1结合蛋白(以下被称为LTBP)。TGF-β1前体的N-末端残余部分对于TGF-β潜在性是非常重要的，所以这就被表示为TGF-β1潜在性相关肽(β1-LAP)(Gentry et al.，Biochemistry，29，6851-6857，1990)。象本发明所称的那种大潜在性相关肽(rL-β1-LAP是由两种组分组成，即TGF-β1潜在性相关肽(β1-LAP)和LTBP。
成熟TGF-β1是一种二硫键连接的二聚体，它是以β1-LAP中经蛋白酶切割而成，形成了一个连接LTBP单一分子上二硫键的二聚体。含LTBP的潜在TGF-β1复合物称为“大潜在复合物(1arge latent complex，LL-TGF-β1)”，而不含LTBP的复合物称为“小潜在复合物(small latent complex)”(Wakefield et al.，Growth Factors，1，203-218，1989;Miyazono et al.，EMBO J.，10，1091-1101，1991)LTBP首次以自由形态和作为LL-TGF-β1复合物的一种组分从人血小板中纯化而得到。编码LTBP的cDNA克隆最近也从人前皮成纤维细胞中分离出来(参见U.S.serial NO.07/487，343，美国专利5177197号，这些文章的内容结合参考文献会给一个全面的认识)。cDNA序列的敞开阅读框架指出LTBP是一个由1394个氨基酸组成的蛋白质，它含有2种不同类型重复序列，16个类表皮生长因子(EGF)的重复片段和在一个基元序列中含有8个半胱氨酸重复顺序的3个拷贝。在一些类EGF重复顺序，β-羟基化天冬酰胺残基已被鉴定出来(Kanzaki et al.，Cell61，1051-1061，1990)表明LTBP是一种Ca2+结合蛋白(Dahlback et al.J.Biol.Chem.266，18481-18489，1990)。LTBP不直接与TGF-β1潜在性相关，但它在由生产细胞装配和分泌潜在TGF-β1分子中起一定作用。
已经发现了几乎纯的类受体样TGF-β1结合的糖蛋白，这些分子经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定出分子量为160KD，70-80KD和30-40KD，并证实能结合TGF-β1分子(参见美国系列号07/717，316，美国专利5229495号，这些文献上的内容连同参考文献为提供一个完整的认识)。
本发明通过为编码LTBP和前-TGF-β的DNA序列引入真核细胞，总的来说提供了一种生产重组大潜在TGF-β的方法。这些序列被引入真核细胞并协同得以表达。象这里所用的“Co-expression”和“Co-expessed”本语意味着由一个熟练技术人员所知的任何一种方法表达该复合体中的两种成份，即前-TGFβ和LTBP。这些可能已意味着包括用两个表达载体顺序转化或用能够表达两种成分的单一载体进行转化。
本发明进一步通过为LTBP DNA序列引入表达前-TGF-β的真核细胞来提供一种产生重组大潜在TGF-β。具体讲就是本发明提供构建一个LTBP表达质粒，pDSV2-BP，和它后来转染到CHO细胞内，需要指出的是最好使用CHO细胞系T23-7-11。筛选出LL-TGF-β复合体最高表达量的克隆用于纯化(LT3-1克隆)。
本发明也提供构建一个pME-TGF-β2质粒和它与pRSVneo质粒共同转染在基因组上含有一个放大LTBP cDNA序列的BP-1-1 CHO细胞中的全过程，已检测表达到培养基内的LL-TGF-β2活性。
本发明也提供一个方法用于通过降解LL-TGF-β和分离出LL-LAP来获得L-LAP的方法。
本发明也描述一个能特异性连接到LL-TGF-β复合物而不连接LTBP的抗体。
本文图示的简要说明
图1表达质粒pDSVE2-BP的构建。
图2A表示用Ab-39多克隆抗体检测由质粒pDSVE2-BP转染细胞克隆分泌到培养基中的LL-TGF-β1。
图2B表示用LT-1多克隆抗体描述图2A中的试验。
图3表示从LT3-1条件培养基中纯化LL-TGF-β1的方案。
图4表示A在SDS-PAGE上分析纯化的LL-TGF-β1。
图4B表示用免疫印迹法分析经SDS-PAGE后纯化的LL-TGF-β1。
图5表示纯化LTBP酶水解片段的分离和顺序。
图6表示CCL-64细胞DNA合成的抑制作用。
图7表示SDS-PAGE分析用碳4(C4)反相高效液相色谱柱洗脱出的重组LTBP。
图8表示检测用从含有一个早前-TGF-β2(Prepro-TGF-β2)cDNA的质粒DNA转染的BP-1-1细胞克隆中分泌的LL-TGF-β2。
图9表示结合到LTBP的45Ca2+。
图10A表示Ca2+对自由型LTBP的胰蛋白酶敏感性的影响。
图10B表示Ca2+对重组LL-TGF-β1的胰蛋白酶敏感性的影响。
图11A表示Ca2+在5mM EDTA存在下对LTBP阴离子交换层析的影响。
图11B表示用5mM CaCl2描述在图11A中的试验。
图12用琼脂糖12(Superose 12)凝胶过滤纯化重组L-LAP。
图13用SDS-PAGE分析纯化的重组L-LAP。
本发明通过参考下列实施例将得到更好的理解，这里所包括的实施例其目的给予例证并不构成对本发明的限制。
实施例1一个被称为pDSVE2-BP的LTBP表达质粒是采用标准重组方法(如Maniatis等人在分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，1982中所述的方法)构建的。具体地讲质粒pDSVE2-BP是按下述方法构建的pUC19-A和PUC19-B分别为带有5′未翻译区(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1061，1990)的LTBP cDNA 5′-端一半EcoRI片段的质粒和带有3′未翻译区的LTBP cDNA 3′一端一半EcoRI片段的质粒。首先将带有LTBP cDNA 5′一端一半的DraI-EcoRI片段从pUC19-A中分离出来并亚克隆到SRα-296质粒的PstI-EcoRI位点(Takabe et al.，Mol.Cell.Biol.8，466-469，1988)。3′一端一半EcoRI片段从pUC19-B中分离出来并引入到SRα-296质粒的EcoRI位点构建出SRα-BP。该质粒携带LTBP的全长cDNA。最后LTBP cDNA用XhoI酶消化切割由SRα-BP中分离出来插入到含有一个鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)微基因的一个哺乳动物细胞表达质粒pDSVE2的SalI酶位点中用于基因扩增。最后的质粒称为pDSVE2-BP，参见图1。
实施例2T23-7-11是一株大量生产重组人前-TGF-β1复合体的CHO细胞系。这个细胞系的建立和特性已在公开的日本专利申请(KOKAI3-180192，1981)中作了详细描述。描述建立T23-7-11细胞的核心成分将在下面作简要描述。
人早前-TGF-β cDNA克隆分离自一株人脂盘细胞(human placenta cells)的λgt10 cDNA库(Library)。从人脂盘组织制备出总DNA。用已知方法寡聚(dT)-纤维素柱层析分离出poly(A)RNA。用G1uber和Hoffmann(Gluber et al.，Gene 25，263，1983)方法合成为双股cDNA并克隆到一个λgt10载体的EcoRI位点。按发表的人TGF-β1cDNA核酸序列合成一个寡聚DNA探针(Derynck et al.，Nature 316，701-705，1985)。带有人早前-TGF-β1蛋白的cDNA序列的克隆，用上述探针从人脂盘基因库中筛选出来。一株cDNA克隆T1携带人早前-TGF-β1全长cDNA序列通过斑点杂交和DNA定序后从3×105独立噬斑中鉴定出来。该cDNA克隆然后亚克隆到pUC19的EcoRI位点。
一个人早前-TGF-β1cDNA的哺乳动物的表达质粒pECβ是按下面方法构建的。首先，带有人早前-TGF-β1cDNA的PUC-19质粒用coRI消化，一个含有cDNA的分离出的EcoRI片段被做成钝端，然后插入到载体pSVL的SmaI位点而得到pSVL-TGF-β1。第二，哺乳动物细胞表达质粒CDM8(参见Seed，B.，Nature 329，840-842，1987)用SacII和BamHI消化。含有一个琥珀抑制物supF tRNA基团，巨细胞病毒(CMV)介导早期启动子DNA序列和猿猴病毒40(SV40)多腺苷酰化DNA序列的分离的SacII-BamHI片段做成钝性末端，然后导入到pSV2dhfr载体的PVuII位点(Subramani，S.et al.，Mol.Cell.Biol.1，854-864，1981)获得了pCMV-dhfr。最后含有人早前-TGF-β1cDNA，SV40多腺苷酰化序列，一个氨苄青霉素抗性基因和源自pBR322 DNA的Ori的pSVL-TGF-β1的XbaI-EcoRI片段与含有CMV启动子序列和由SV40早期启动子，鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)编码序列以及SV40多腺苷酰化序列组合的基因卡盒(gene cassette)的pCMV-dhfr的XbaI-EcoRI片段被连结在一起。获得这种表达质粒pECβ携有CMV启动子，对于人早前-TGF-β1表达用的SV40多腺苷酰化信号序列，SV40早期启动子和用于鼠二氢叶酸还原酶表达的SV40多腺苷酰化信号。
为了表达人前-TGF-β蛋白，使用了一株dhfr-细胞系，如CHO-DUKX B11(Chasin，L.A.and Ur laub，G.，PNAS USA 77，4216-4220 1980)。一个同等的dhfr-CHO细胞系是由ATCC公开提供的，如ATCC CRL 9096并能够用于替代CHO-DUKX B11。这些细胞被培养在补充10%胎牛血清(FCS)的MEMα(-)培养基中。PECβ质粒DNA是采用磷酸钙共同沉淀法转染到细胞中的，并在含有15%透析过的胎牛血清(FCS)与上述相同的培养基中进行筛选。转化体细胞进一步在含500nM氨甲喋呤的培养液中培养进行基因扩增。在转化体的条件培养基内人前-TGF-β1的出现可用在实施例6详细描述的CCL-64细胞生长抑制试验和用兔多克隆抗人血小板纯TGF-β1前区的抗体建立的免疫印迹法来测出(Kanzaki，etal.，前述)。在条件培养基中最高TGF-β1活性的细胞克隆被筛选出来，并命名为T23-7-11。
T23-7-11细胞系已于1993年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 93006。并已按布达佩斯协议保藏于日本发酵研究所，保藏号为FERM BP-4024。
实施例3在上述实施例2，所描述的T23-7-11细胞培养在补充有15%FCS和500nM氨甲喋呤的Ham′s F-12和Dulbecco′s改良Eagle′培养基(1∶1)中。按上述构建的质粒pDSVE2-BP和pSV2neo采用标准电穿孔法被转染至该细胞中。具体地说，含有一个高浓度克隆化基因的质粒DNA被加到细胞悬液中，用200-600V/cm电场对该混合物进行电休克。通过电极释放短暂电脉冲从而在细胞膜上凿出洞，然而在含有1mg/ml G418和500nM MTX的相同培养基上筛选出成功转染的克隆株。对G418和500nM MTX有抗性的7个克隆被挑出并检测LL-TGF-β1复合体的分泌。
这些克隆再按下列程序进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹技术测定。在对G418抗性的细胞克隆培养在含有10%FCS培养基中，直到细胞长满后，就用PBS为细胞洗二次，并进一步在含有5mg/l牛胰岛素的无血清培养基上培养4天。4天后收集条件培养基，并超浓缩5倍。这些样品在非还原条件下，于4-12%梯度胶上上样进行SDS-PAGE，然后在一个含有20%甲醇、192mM甘氨酸和25mM Tris-HCl pH8.4的缓冲液中于100V下转移至PVDF膜上。该PVDF膜置入含有1%变性明胶，0.1%Tween20和150mM NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中进行封闭，进一步为该膜在同一个缓冲液中与碱性磷酸酶结合的抗体(Ab39，LT-1)在4℃作用16小时。然后为PVDF膜清洗再用NBT/BCIP底物沉淀法显色。图2所示，与Ab39和LT-1多克隆抗体结合物的反应结果。这些结果指出，所有的7个细胞克隆都将LL-TGF-β复合体和前-TGF-β1分泌到无血清培养基内。LT3-1克隆分泌到培养基中的LL-TGF-β1水平最高，并被选定为候选的细胞克隆用于从条件培养基中纯化LL-TGF-β1。
LT3-1细胞系已于1993年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 93007。并已按布达佩斯协议于1992年9月29日保藏于日本发酵研究所，保藏号为FERMBP-4015。
实施例4为了获得重组LL-TGF-β1的供应，将LT3-1细胞培养在含200ml选择性培养基的转瓶中并长满，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗培养物，进一步在添加有胰岛素，转铁蛋白，单乙醇胺，亚硒酸钠，抑蛋白酶肽和聚乙二醇6000等生长促进添加物(200ml/瓶)的无血清培养基F-12/DMEM中培养7天，7天后收集80升条件培养基。
图3简要地显示纯化程序。
为进一步阐明这一过程作如下说明，80升被收集的条件培养基浓缩并用分子载流为100KD大小的Millipore公司的超滤膜进行脱盐，浓缩后的条件培养基加样于用10mM pH7.2磷酸钠缓冲液平衡的Q-琼脂糖快速流动阳离子交换层析柱。结合在柱上的蛋白质再用200-660mM NaCl梯度液以8.0ml/min的流速洗脱。用SDS-PAGE和兔多克隆抗体Ab39免疫印迹法监测LL-TGF-β1复合物的出现。
含有LL-TGF-β1复合体的部分进一步通过用10mM，pH7.2磷酸钠缓冲液平衡过的HP-10羟基磷灰石柱(50×100nm)。收集未吸附在柱上的部分，再通过用10mM，pH7.2磷酸钠缓冲液平衡过的硫化精细纤维素柱(sulfated cellulofine Column)(30×100mm)。吸附在柱上的蛋白用0-200mM NaCl梯度以4.0ml/min流速洗脱。把含有LL-TGF-β1复合体的部分合并，对40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析。透析后的样品，再次加样于用40mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡过的DEAE-Toyopearl阴离子交换柱(15×100mm)洗脱，最后用0-250mM NaCl梯度以2.0ml/min流速洗脱。
合并含有高浓度LL-TGF-β1复合体的部分，用Amicon YM100超滤膜浓缩，浓缩后的样品再加至用PBS平衡过的Sephacryl S-300HR凝胶过滤柱(20×100mm)，用平衡液洗柱，流速为0.5ml/min。
纯化蛋白质用SDS-PAGE分析，并进一步用银染色和免疫印染色分析(图4示结果)，即表明从S-300HR中纯化的蛋白质用4-12%梯度胶进行SDS-PAGE和有无二硫苏糖醇的情况下银染色检查结果(图4A)和有无二硫苏糖醇的情况下用Ab39(A)或CT-1(B)抗体建立的免疫印迹染色，对此纯化蛋白进行分析结果(图4B)。
在没有还原的条件下，纯化LL-TGF-β1复合体含有2个蛋白带，表现分子量分别为220KD和270KD。两条带均可被Ab39和LT-1抗体所识别。
在还原条件下，这些蛋白被分成4条带，表现分子量为12.5KD，40KD，53KD和150-190KD。40KD和53KD蛋白带能被LT-1识别，这说明这两条带含有β1-LAP。12.5KD和53KD蛋白带可被针对成熟TGF-β1部分肽的兔多克隆抗体Ab57所识别。这暗示，这两条肽可能含有一个成熟TGF-β1列序。150-190KD蛋白带可被Ab39所识别。上述结果说明这些蛋白是由LTBP，前-TGF-β1，β1-LAP和成熟TGF-β1组成。
实施例5在还原条件下进一步用直接氨基酸序列分析每一组分的方法对重组LL-TGF-β1复合体进行鉴定。
待检样品先进行SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。在电印迹后，膜上的蛋白用的春红.S(Ponceau.S)染料测定。剪下染色斑，在二硫苏糖醇存在和电印迹下从PVDF膜上纯化出蛋白质。
12.5KD组分的N-末端氨基酸测序结果表明该序列为Ala-Leu-Asp-Thr-Asn-Tyr-x-Phe-Ser-Ser，这和成熟的TGF-β1序列相同。40KD和53KD组分的N-末端氨基酸序列分析指出该序列为Leu-Ser-Thr-x-Lys-Thr-Ile-Asp-Met-Glu，这与TGF-β1的前体序列相同。
但企图确定160-190KD组分的N-末端氨基酸序列没有成功，这说明N-末端可能被封闭。因而纯化的LTBP进一步用蛋白内切酶Asp-N消化，并在一个窄孔反相HPLC柱用乙腈/2-丙醇线性梯度分离。流出液用215nm监测，用SHIMADZU PSQ-1蛋白测序仪对有峰的各管进行氨基酸序列分析。获得的序列可与Kanzaki等介绍的相比较(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1061 1990)。三个不同多肽的氨基酸测序结果表明序列为Asp-Ile-Asn-Glu-Cys-Leu-Glu(第10)，Asp-Gln-Gly-Tyr-Arg-Ala-Ser(第12)，Asp-Pro-Val-Lys-Le
u-Gln-Cys-Leu(第18)，参见图5。这些序列除去第18肽Leu10残基外，其它均与LTBP内部序列相同(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1060，1990)因此，150-190KD组分确定为LTBP。
纯化的LL-TGF-β1复合体已发现是由分子量为12.5KD，40KD，53KD和150-190KD四种不同亚单位组成。它们分别对应于成熟TGF-β1，β1-LAP，前-TGF-β1和LTBP。
实施例6TGF-β1的活性可用3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到水貂肺上皮细胞CCL-64试验加以确定(Cone et al.，Anal.Bionhem，168，71-74，1988)。CCL-64细胞和待检样品被移入到含有10%FCS和抗生素的DMEM培养液的96孔组织培养液中。培养48小时后，细胞用0.5μCi3H-胸腺嘧啶脱氧核苷脉冲4小时。掺入到DNA的3H放射活性用液体闪烁计数仪进行测定。用一个Bio-Rad公司蛋白测定试剂盒定性纯化蛋白。图6表示生物活性图谱。重组成熟TGF-β1是CCL-64细胞潜在生长抑制剂。
当重组LL-TGF-β1复合体被酸化活化后，它也是CCL-64细胞潜在的生长抑制剂。可是它的特异性活性大约是重组成熟TGF-β1的五分之一，相当于用6ng纯化蛋白/ml观察到的最大抑制作用的一半。这些结果与从人血小板分离到LL-TGF-β1复合体获得的相似(Miyazono et al.J.Biol.Chem.263，6407-6415，1988)。重组LL-TGF-β1复合体以约200ng/ml达到一半最大抑制作用来抑制CCL-64细胞的效应要低得多，它的抑制曲线当和重组TGF-β1和酸活化LL-TGF-β1复合体相比较明显的有一个轻微改变的斜坡度。以前还未见有报道天然LL-TGF-β1复合物抑制CCL-64细胞的分裂增殖。
在图6中，DNA合成抑制作用按以下所述进行了评价。图上符合(O)重组成熟TGF-β1，(
)重组LL-TGF-β1复合体(未处理)，(
)重组LL-TGF-β1复合体(酸活化的)。
所进行的试验表明由LT3-1细胞分泌的重组LL-TGF-β1复合体很明显与来自人血小板的天然LL-TGF-β1复合体完全相同，这可说明LT3-1细胞在研究LL-TGF-β1复合体的结构和功能中将是一个很有用的来源。然而，由LT3-1细胞产生的重组LL-TGF-β1复合体，重组小潜在TGF-β1复合体和重组成熟TGF-β1象所讨论的在治疗和生理学研究中将会大有用途。
实施例7生产重组LTBP的CHO细胞系已被建立，以申请者所了解的程度来说，这是第一份用重组DNA技术，以中等水平稳定生产LTBP的报告。
为了表达LTBP，在实施例2中所述的dhfr-细胞系CHO-DUKX-B11用实施例1中的LTBP表达质粒pDSVE2-BP进行转染。细胞保持在补充有5%FCS的MEMα(-)培养基中，用20μg pDSVE2-BP质粒以磷酸钙共同沉淀法转染。Dhfr-表达转化体通过用加有5%经透析的FCS MEMα(-)替换进行筛选。
在每一个转化体条件培养基中LTBP的存在可由免疫印迹法来测定。样品加到5-20%梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电流分离并转印到硝酸纤维素膜上，非特异性蛋白吸附结合可由加入的0.05%Tween20，150mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.0)和5%干奶粉中于室温下1小时来封闭。然后把该硝酸纤维素膜在含有10mg/ml抗LTBP多克隆抗体Ab-39的相同缓冲液作用，再用相同缓冲液洗2次，加入抗兔IgG碱性磷酸酶的抗体结合物作用，洗膜之后，用NBT/BCIP底物沉淀反应显色。
筛选在条件培养基中生产LTBP的细胞克隆并进一步在含有提高到50nM浓度氨甲喋呤的培养基中培养以扩增转染进去的LTBP cDNA。BP1-1克隆被选出做进一步研究。
在含有200ml选择培养基的转瓶中让BP1-1细胞长满瓶壁。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗细胞，然后用含有胰岛素、转铁蛋白、单乙醇氨、亚硒酸钠，抑蛋白酶肽和聚乙二醇6000作为生长促进添加物的无血清F-12DMEM(200ml/瓶)培养7天。7天后收集20升条件培养基。
浓缩收集条件培养基，并用截留分子范围10KD大小的Millipore超滤膜脱盐。浓缩的条件培养基对25mM含有0.5硫酸铵的磷酸钠缓冲液(pH7.2)透析，然后加样于上述相同缓冲液平衡过的Phenyl-Toyopearl 650M柱(50×100mm，Tosoh)。吸附的蛋白用0.5-OM硫酸铵梯度以5.0ml/min流速进行洗脱。LTBP的出现用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹和/或酶免疫法进行监测(使用兔多克隆抗体Ab-39)。含有LTBP的洗脱液合并，对10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)透析，进一步加样于用相同缓冲液平衡过的Q-Sepharose FF阴离子交换柱(26×100mm)。吸附的蛋白用100-600mM NaCl梯度以流速3.0ml/min洗脱。将含有LBP的部分合并，浓缩后再加样于用PBS平衡过Superose 12制备级柱(26×500mm)，用PBS以1.0ml/min的流速洗脱，收集合并含有LTBP的部分，再加入到用含0.1%TFA的10%乙腈平衡过的反相C4 HPLC柱(11×250mm)中层析，用10-50%乙腈梯度洗脱，流速为2.0ml/min。
纯化的蛋白质经SDS-PAGE分离后，用银染色和上述介绍过的抗-LTBP抗体Ab-39进行免疫印迹分析，再进行氨基酸序列分析。在还原和非还原两种条件下，纯化的蛋白经银染色揭示为一单一的宽带，表现分子量为110-130KD。如图7所示，SDS-PAGE揭示一条扩散蛋白带，表现分子量约在120-140KD。这个带可由兔抗-LTBP Ab-39抗体所识别，这表明它就是-LTBP。纯化蛋白的进一步确认靠还原条件下的氨基酸序列分析。该蛋白用蛋白内切酶Asp-N消化，加样于反相HPLC，分离的多肽进行定序。获得的氨基酸序列与从人血小板纯化的LTBP报告中的氨基酸序列完全相同(Kanzaki et al.，Cell 61，1051-1061，1990)。
BP1-1细胞系已于1993年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 93008;并已按布达佩斯协议于1992年9月29日，保藏于日本发酵研究所，其保藏另为FERM BP-4014。
实施例8
LL-TGF-β2生产是LTBP cDNA和早前-TGF-β2cDNA共同在CHO细胞中完成表达的。早前-TGF-β2表达质粒被引入BP1-1细胞系在上面已经加以描述。
人TGF-β2完整核苷酸序列已经发表(DeMartin et al.，EMBO J.6，3673-3677，1987)。对于人TGF-β2的cDNA克隆可按实施例2中所描述的TGF-β1cDNA那样获得。哺乳动物表达质粒pME-TGF-β2是使用获得的早前-TGF-β2cDNA构建的。该质粒在一个改良的SV40启动子和SV40对于转录终止和多腺苷化的前区的控制下含有人TGF-β2cDNA。
pME-TGF-β2质粒和含有新霉素抗性选择的pRSVneo质粒以电穿孔方式共同转染进入BP-1细胞系。G418抗性转化体被选出和检测，并用CCL-64细胞的生长抑制试验来测定TGF-β2的活性的产生(参见实施例6)，分离的几株细胞克隆都能为TGF-β2活性分泌到细胞培养基中。这些克隆的鉴定方法学在实施例9中为加以描述。
实施例9为了用免疫学方法检测出几株具有TGF-β活性的转化体条件培养基中LL-TGF-β2，先对细胞培养液用Centriprep 10浓缩仪进行浓缩，然后用SDS-琼脂电脉(4-20%聚丙烯酰胺梯度胶)进行分析。随后，用抗人体LTBP多克隆抗体Ab39进行的免疫印迹分析，指出具有4表现种分子量大小不同的分子100-110KDa，120-130KDa，150-160KDa，200-220KDa(参见图7)。
200-220KDa是与前-TGF-β2相关的LTBP，而100-110KDa，120-130KDa和150-160KDa几种可能是游离LTBP蛋白，因为这几种也可在BP-1-1条件培养基中找到。该结果表明用含有编码人早前-TGF-β2蛋白cDNA的质粒转染的BP-1-1细胞分泌与LTBP相关的前-TGF-β2，生产一种LL-TGF-β2复合体。这也说明共同在CHO细胞中表达的LTBP和前-TGF-β2的关联可以发生在每一种蛋白的合成期间。
生产LL-TGF-β2的细胞系被筛选出来并命名为LT2-14。细胞系LT2-14已于1993年10月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC C 93005;并按布达佩斯协议已于1992年9月29日保藏于日本发酵研究所，菌株保藏号为FERM BP-4016。
实施例10也已经发现LL-TGF-β1和LTBP能够与Ca2+结合，从而导致产生一些通过结合该离子纯化稳定LL-TGF-β的方法。下面提出的方法被进一步得到描述于Colosetti et al.，FFBS Letters 320140-144，1993中，该文献的加收会使该方法的描述更加完整。
重组LL-TGF-β1(10μg，用不同浓度EDTA或CaCl2预处理)，人血小板LTBP(10μg)(从人血小板纯化出LL-TGF-β1中分离的另外部分(Kanzaki等，Cell 611051-1061，1990)，重组小潜在TGF-β1复合体(SLC，10μg)和人血(B，2μl)全部都上样于4-10%聚丙烯酰胺梯度SDS-PAGE，然后转至硝酸纤维素膜，在和45CaCl2(1μCi/ml)过夜作用后、冲洗该膜，干燥后对其进行放射自显影。
在图9中出现的试验资料表明无论游离LTBP和LL-TGF-β1都展示与45Ca2+清晰结合的情况。重组小潜在TGF-β1和用做对照的人血样品虽然蛋白可由Ponceau S染色看到，但不能结合45Ca2+。
实施例11为了研究Ca2+结合对蛋白结构可能的影响，从用[35S]半胱氨酸标记的人前列腺细胞PC-3的细胞培养液中分离出的游离LTBP用Ab39抗体进行免疫沉淀，然后在2mM CaCl2或2mM EDTA存在下以恒温37℃通过不同时间用胰蛋白酶对沉淀物进行蛋白消化。
消化反应可通过加入2μg大豆胰蛋白酶抑制剂而终止，用SDS-PAGE和荧光记录仪分析样品。可以观察到Ca2+对LTBP的保护性效应，即在Ca2+存在下为获得象在EDTA存在下获得的相同程度的降解而需要20倍以上长的温育时间。蛋白酶抗性片段的大小是相似的(参见图10A)。
相似的试验也用LL-TGF-β1进行过。在5mM CaCl2或5mM EDTA存在下进行胰酶消化。1μg重组LL-TGF-β1和在含有5mM EDTA或CaCl2的50mM Tris-HCl(pH7.4)的胰蛋白酶共同温育，然后样品用SDS-PAGE和银染色进行分析。在CaCl2存在下几乎未观察到LL-TGF-β1的消化，而在EDTA存在下，和胰酶作用20分钟后能看到8条带(参见图10B)。
实施例12Ca2+对LTBP分子的影响也在EDTA或CaCl2存在下用离子交换层析进行了研究，在5mM EDTA或5mM CaCl2存在下从PC-3的条件培养基中获得的游离LTBP上样于Q-Sepharose层析分析。
15ml PC-3细胞条件培养基和5mM EDTA(A)或5mM CaCl2(B)结合，再上样于用分别用150mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.5，用5mM CaCl2或EDTA预先平衡过Q-Sepharose柱层析，流速为150ml/hr。150-600mM NaCl梯度洗脱(45min)用于解附作用洗柱。用280nm光吸收值来监测LTBP开始洗下的位置，5ml的洗脱液进行SDS-PAGE和用Ab39血清免疫印迹法分析(参见图11)。
当样品在没有CaCl2或EDTA加入时分析样品，LTBP在约460mM NaCl时开始洗下，在5mM EDTA存在时，LTBP洗下要拖后，即约500mMNaCl。如果Ca2+离子存在可观察到在约420mM NaCl时有一个更前的洗脱。在Ca2+存在下，LTBP对阴离子交换剂的更低的亲和力可能是由于在Ca2+结合后LTBP有一个电荷变化或由于Ca2+诱导该分子的构象改变。
也已观察到Ca2+结合蛋白的这种效应具有可逆转性如果LTBP在EDTA或CaCl2存在下进行层析，然后再加入CaCl2或EDTA，就可观察到洗脱的位置就会漂移。
实施例13按实施例3预先的程序可从已经制备的rLL-TGF-β中分离出大量的rL-β1-LAP。用一种常规变性剂(如脲)处理LL-TGF-β复合体以从LL-TGF-β复合体中分离出L-LAP。
通过第一次用含8M脲的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)透析1mg rLL-TGF-β来制备L-β1-LAP。透析的蛋白被浓缩后加样于Superose12制备级凝胶层析柱。该柱用含有8M脲和500mM NaCl的20mM磷酸钠缓冲液(pH7.2)平衡，而后用同一缓冲液洗脱样品。图12显示在Superose12上凝胶过滤纯化rL-β1-LAP。这种分离是基于这两者的相对大小，第一峰是用样品8-16洗脱下的L-β1-LAP部分，第二峰是成熟的TGF-β部分。
收集含有rL-β1-LAP的部分，然后对磷酸缓冲盐水透析，最后经0.22μm滤膜过滤。纯化蛋白再用SDS-PAGE分析，象图13所示，纯化的rL-LAP移行的分子量约在180-200KDa。
LL-TGF-β复合体特异的抗体可通过将该复合体接种到实验小鼠，再筛选出对该复合体应答的血而获得。标准方法可以生产出单克隆抗体。
抗体对LL-TGF-β复合体异常生产的检测是非常有用的。
成熟的TGF-β目前正在研究用于治疗许多疾病，(Sporn et al.JAMA，262938-941，August 16，1989);但成熟的TGF-β1有一些潜在的副作用，如体重下降，贫血和血小板减少症。据推测使用LL-TGF-β1可能会克服一些这类副作用。
目前TGF-β1也正在被研究用于治疗一些骨髓疾病，例如，骨质疏松症和骨折愈合，因为已知TGF-β影响着骨形成。TGF-β是一种潜在Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的潜在诱导剂，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖形成了软骨的细胞外基质(Sporn et al.，同上)。亦已发现TGF-β是重要地作用于软骨细胞或骨细胞和其他类型的细胞肽生长因子(Pfeilschifter et al.，PNAS 842024-2028，1987)。已经发现涉及软骨和骨的胚系形成，存在于长骨的生长板中。大量的TGF-β也发现于成骨中。事实上，TGF-β2可从成年牛骨中分离出来。
LL-TGF-β也可用作自身免疫病和器官移植时的免疫抑制剂。TGF-β是已知淋巴细胞增殖和功能最有潜力的内源抑制剂，作为自动分泌的“停止”信号抑制白细胞介素和其它细胞活素(如肿瘤坏死因子)的作用，这些活素都对淋巴细胞功能有刺激作用。因此，TGF-β抑制了由白介素介素1和2刺激活化的T细胞增殖，抑制由几种活化因子中的任何一种刺激的B淋巴细胞的增殖和抗体产生，抑制了自然杀伤细胞的杀细胞活性以及抑制了细胞毒性T细胞和淋巴活素活化的杀伤细胞的产生(Sporn et al.，同上)，这些效应在体外研究中已被证实，但体内研究仍处在早期阶段。这些早期试验表明，心脏同种异体移植排斥在小鼠是通过主要组织相容性障碍的结果。目前的研究在肝，胰岛和肾的移植，以及在实验关节炎和临床类风湿病的情况下抑制活化T细胞驱动的炎性过程。
TGF-β也可通过抑制干细胞为血细胞提供免遭细胞活性抑制药物的作用保护。依LL-TGF-β的免疫抑制特性的优点，对于那些选择使用化学药品作为免疫抑制治疗的疾病病人，为保护骨髓细胞可在治疗之前注射LL-TGF-β。
TGF-β也对参与组织损伤修复的成纤维细胞有一些重要的作用。TGF-β可刺激产生细胞外基质主要成份的生产，如胶原，纤维连接素和蛋白聚糖，抑制破坏新形成结缔组织的蛋白水解酶的作用(Sporn et al.，J.Cell Biol.1051039-1045(1987);Keski-Oja et al.，J.Cell Biol.106451-459(1987)。因此，这些作用导致在TGF-β的部位上形成新颗粒组织。进而，TGF-β已经表明可提高胶原的基团转录(Heine et al.，J.Cell Biol.1052861-2876(1987)，在提供愈合创伤的结构强度上起一个极其重要的作用。而且还可作为骨和软骨基质的核心部分。TGF-β已表明也可提高动物创伤愈合(Roberts et al.，RecentProg.Horm.Res.44157-197，1988)，有一个这样的例子，就是兔视网膜的重新粘连的刺激。此外，LL-TGF-β1也可以用于刺激软组织愈合，即，皮肤溃疡和消化道溃疡。
TGF-β亦已表明对于大多数上皮细胞是一个潜在抗增殖因子，这可被用于肿瘤病的抗增殖药。
大潜在性相关肽(L-LAP)可以用于成熟TGF-β分子的拮抗剂。为了防止TGF-β治疗中可能的毒性副作用，可使用L-LAP在治疗或诊断方法中以控制，调节TGF-β治疗或存在时的有害或不希望出现的副作用。用L-LAP可以克服TGF-β治疗的缺点，可以降低或消除TGF-β的潜在毒性副作用。在治疗其它TGF-β相关疾病，如纤维变性紊乱，肾小球性肾炎，肝纤维化病，瘢痕形成和癌肿转移期间可注射L-LAP以提供一种保护效应。
对L-LAP的特异性抗体可通过将所述的肽引入实验动物并筛选对该组合体有应答的血液来获得。单克隆抗体可由标准技术方案获得。这些抗体可用作诊断辅助。
正在进行的试验表明有可能通过引入一个LTBP DNA序列到能表达前-TGF-β的T23-7-11 CHO细胞中就可生产出重组的LL-TGF-β1。通过构建一个含有LTBP的质粒，用此质粒转染CHO细胞，很可能表达重组LL-TGF-β1。
试验也表明通过引入一个含有TGF-β2的cDNA的质粒到含有一个扩增过的LTBP cDNA序列的BP-1-1细胞很可能会生长出重组LL-TGF-β2。
现行的试验还表明LTBP和LL-TGF-β可以结合Ca2+和通过加入Ca2+离子到生产出的重组LL-TGF-β复合体会导致蛋白质稳定性的提高和抵抗蛋白酶活性的增加。
本试验还表明L-β-LAP可通过用变性剂处理rLL-TGF-β复合体就可分离制备出L-β-LAP。
如要期望的是上述描述的生产重组LL-TGF-β1和LL-TGF-β2复合体的方法可以被广泛应用到生产重组LL-TGF-β复合体，包括但不仅仅限于在重组TGF-β3，因为已经很了解TGF-βS家族的每个成员间在肽序列和生物活性上非常相似。TGF-β同分异构体表示出可比特性，因此可希望有相似的作用。
上述描述的试验暗示生产LL-TGF-β复合体和相关构成物的方法，用不同的质粒和其它载体，也可在其它真核细胞上表达。这种质粒和载体的选择可由熟练技术人员来实现。
亦已认为如果不是脱离了本发明的精神和范围，其它具体化的东西也可被列入本发明内。本发明无任何企图被限于仅仅所描述的那些具体化的东西。这些具体化的东西被做适当修饰将也会被那些操作技术人员所承认。然而，本发明还应以所附的权利要求的范围为限定。
权利要求
1.生产大潜在TGF-β(LL-TGF-β)的方法，包括在转化真核细胞内共同表达1)编码LTBP的核酸分子；2)编码前-TGF-β的核酸分子和在适宜生产大潜在TGF-β的条件下培养所说的细胞。
2.按权利要求1的方法，其中，这里所指的TGF-β是TGF-β1。
3.按权利要求1的方法，其中，这里所指的TGF-β是TGF-β2。
4.按权利要求1的方法，其中，这里所指的TGF-β是TGF-β3。
5.稳定LL-TGF-β的方法，即以足以稳定所说的LL-TGF-β的量加入一定量的Ca2+到含有LL-TGF-β的样品中。
6.按权利要求1的方法，其中，这里所说的真核细胞是CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细胞系。
7.按权利要求2的方法，其中，这里所说的真核细胞是LT3-1(CCTCC C 93007)。
8.按权利要求3的方法，其中，这里所说的真核细胞是LT2-14(CCTCC C 93005)。
9.按权利要求1的方法，包括用至少含有一个编码LTBP的核酸分子和编码前-TGF-β的所说核酸分子的真核质粒转化所述的真核细胞。
10.按权利要求2的方法，包括，用至少含有一个编码LTBP的核酸分子和编码前-TGF-β的所说核酸分子的真核质粒转化所述的真核细胞。
11.按权利要求3的方法，包括，用至少含有一个编码LTBP的核酸分子和编码前-TGF-β的所说核酸分子的真核质粒转化所述的真核细胞。
12.按权利要求4的方法，包括，用至少含有一个编码LTBP的核酸分子和编码前-TGF-β的所说核酸分子的真核质粒转化所述的真核细胞。
13.按权利要求10的方法，其中，这里所说的真核质粒是pDSVE2-BP。
14.按权利要求11的方法，其中，这里所说的真核质粒是pME-TGF-β2。
15.真核质粒pME-TGF-β2。
16.治疗骨质疏松症，炎症和免疫紊乱类疾病的方法，包括当病人需要所说的治疗时使用药学有效剂量的大潜在TGF-β1。
17.治疗创伤的方法，包括当病人需要所说的治疗时使用药学有效剂量的大潜在TGF-β1。
18.诱导由细胞抑制药物影响的干细胞抑制的血保护作用的方法，包括当病人需要所说的治疗时使用药学有效剂量的大潜在TGF-β1。
19.治疗肿瘤病的方法，包括用一定量足以治疗所说的肿瘤疾病的大潜在TGF-β1，当病人需要所说的治疗时，使用它进行病人治疗。
20.生产LL-TGF-β的细胞系，该细胞系拥有一段编码LTBP的异源DNA分子和染色体融合的编码前-TGF-β的异源DNA分子。
21.按权利要求20的细胞系，其中所述的TGF-β是指TGF-β1。
22.按权利要求21的细胞系，其中所述的LT3-1。
23.按权利要求20的细胞系，其中所述的TGF-β是TGF-β2。
24.按权利要求23的细胞系，其中所述的是LT2-14。
25.生产LTBP的方法，包括在一个真核细胞上表达一段编码LTBP的异源DNA分子，其中，这里所说的异源DNA分子是指染色体上掺入的，和在适宜于生产LTBP的条件下培养所说的细胞。
26.按权利要求25的生产方法，其中所说的细胞是CHO细胞。
27.按权利要求25的生产方法，其中所说的真核细胞是BP-1-1(CCTCC C 93008)。
28.生产LTBP的细胞系，该细胞系具有一段在染色体上掺入的编码LTBP的异源DNA分子。
29.按权利要求28的细胞系，其中所述的细胞系是BP-1-1。
30.分离L-LAP的方法，包括(a)按权利要求1中的方法生产LL-TGF-β;(b)在适宜于分离L-LAP的条件下用一种变性剂处理所说的LL-TGF-β;(c)并从中分离出L-LAP。
31.分离出由SDS-PAGE测定具有约180-约200KDa分子量的L-LAP。
32.分离出的由SDS-PAGE测定具有约180-约200KDa分子量的L-LAP，由下述而获得(1)按权利要求1中的方法生产LL-TGF-β;(2)在适宜于分离L-LAP的条件下用一种变性剂处理所说的LL-TGF-β;(3)并从中分离出L-LAP。
全文摘要
本发明提供了一种将编码LTBP和前-TGF-β的核酸序列引入到真核细胞来生产重组大潜在TGF-β的方法，及将LTBP的DNA序列引入到一个表达前-TGF-β的真核细胞来生产重组LL-TGF-β的方法。本发明揭示一种构建LTBP表达质粒pDSVE2-BP和将该质粒转染到CHO细胞，即CHO T23-7-11细胞的方法在此做了特别的说明。将最高水平表达大潜在TGF-β复合体的克隆筛选出来用于纯化LL-TGF-β(LTB3-1克隆)。
文档编号A61K38/00GK1088616SQ9311915
公开日1994年6月29日 申请日期1993年10月26日 优先权日1992年10月26日
发明者卡尔-亨里克·赫尔丁, 宫园浩平, 帕斯卡尔·科洛塞弟, 乌尔夫·赫尔曼, 大桥秀哉, 石井保之 申请人:麒麟麦酒株式会社, 路德维格癌症研究所