专利名称：诊断和/或治疗关节炎的方法与药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及光动力学诊断和光动力学治疗关节炎特别是哺乳动物关节炎的方法与药剂。具体地说，用于本发明的药剂属于有四吡咯骨架结构的特异性荧光化合物。当给动物患者使用有效量的药剂时，该药剂即聚积在身体的受影响部位。
当将一定波长的光线施加于待诊断或治疗的受影响关节时，该制剂即在受影响部分产生荧光，从而能够检查关节炎。这叫作光动力学诊断。在治疗方面，当将适当波长和强度的光线施加于损伤部位时，该制剂被激发而产生细胞毒性作用并使关节损伤处的受影响细胞坏死。这叫作光动力学治疗。本发明涉及这种类型的适用于关节炎特别是类风湿性关节炎的诊断和治疗。
类风湿性关节炎是一种主要引起多关节炎症的慢性全身性疾病。这种疾病最初表现为手和脚的小关节，或者肘关节及膝关节的疼痛和肿胀，然后长及全身其他关节。在疾病的初期，由于某些未知抗原的刺激，受影响关节中的滑液开始过度增生，并且因级联系统的作用而使滑液增生持续并延长为肿瘤样状态。关节的构成成分如软骨、韧带或骨被这些滑液产生的酶破坏，继之出现关节结构破坏。
这种病理状况可在所有人种中观察到，并分布于世界各地。
在类风湿关节炎的诊断中，必须借助血液试验鉴定类风湿因子的暴发和炎性反应的存在，了解关节肿胀和疼痛出现情况，并借助X射线检查是否存在骨的变形。综合这些检查结果，即可完成类风湿关节炎的诊断。
因为还没有建立任何令人满足的关风湿关节炎病因治疗方法，所以只能按照个别病例的实际情况采用对症治疗，以保护受损关节。然而，这类治疗的效力目前尚不明瞭。这就是说，首先采用的医疗手段是给病人使用非类固醇消炎止痛药以促进病性缓解，同时采用物理疗法。尽管这样，但如果肿胀加重并且滑膜增生明显时，则需经关节切开术或借助关节窥镜法进行滑膜切除。采用全关节成形术，以用人工矫型假肢替代已破坏关节来恢复关节功能。
为了防止关节结构的破坏，必须在整个病程中，特别是病变早期降低滑液中的细胞免疫反应。
迄今已知一种给佐剂诱发关节炎的大鼠服用血卟啉衍生物，并进行光照来诊断和治疗类风湿性关节炎的方法，例如参见“RheumatoidArthritisandLaser(Effectoflaserirradiationtoadjuvantinducedarthritis)”,TheRYUMACHI(OfficialJournaloftheJapanRhematismAssociation),Vol.23,pp.574-575,1983。
然而，通过本发明人进行的实验可以清楚看出，当使用典型的血卟啉即PhotofrinⅡ时，它并不能有选择性地被摄入风湿性关节炎受损部位，并对风湿性关节炎产生明显的治疗效果。
顺便提到的是，用于本发明的化合物本身是已知用于诊断和治疗肿瘤的药物。但本发明人从不知道有将相关化合物用于诊断和治疗关节炎的例子。本发明的技术领域当然不同于诊断和治疗肿瘤的技术领域。
再者，本发明人熟悉下列文献，但其研究的课题不同于本发明。
(a)“SystemicImmunosuppressionInducedbyPhotodynamicTherapy(PDT)isAdoptivelyTransterredbyMacrophages”，PHOTOCHEMISTRYANDPHOTOBIOLOGY，Vol.49,pp453-458,1989。
(b)“ImmunologicalSuppressioninMiceTreatedWithHematoporphyrinDerivativePhotoradiation”,CANCERRESEARCH,Vol.46,pp.1608-1611,1986。
因此，本发明的目的是提供一种用于诊断和治疗上述风湿性关节炎的药剂。本发明进一步提出一种光动力学诊断和光动力学治疗关节炎特别是类风湿性关节炎的药剂，其中有时也利用于关节窥镜和滑膜切除的常规诊断方法。
鉴于上述目的，本发明人进行了广泛地研究，结果发现了药剂的新的实用性，该药剂对于光动力学诊断和光动力学治疗类风湿性关节炎是有效的。
因此，本发明提供了用于诊断和治疗哺乳动物类风湿关节炎的药剂。该药剂包括至少一种选自下列一组中的荧光化合物由下列通式代表的至少有一个羧基基团的四吡咯羧酸、相应的二或四氢四吡咯羧酸、和带有氨基-一羧酸或氨基-二羧酸的所说四吡咯羧酸的一、二或多酰胺，及它们的盐。
式中，R1是甲基， R2是H，乙烯基、乙基、-CH(OH)CH3，乙酰基， ， -CH2CH2COOH或=CHCHO；R3是甲基、 R4是H，乙烯基，乙基，-CH(OH)CH3，-CH2CH2COOH，=CHCHO或 R5是甲基；R6是H，-CH2CH2COOH，-CH2CH2COOR或-COOH；R7是-CH2CH2COOH，-CH2CH2COOR或 R8是甲基或
R9是H，-COOH，-CH2COOH或甲基；条件是当R1、R2、R3、R4、R7和R8代表两个取代基或者是二价的并且连接到同一个碳上时，其所连接的各个吡咯环是二氢吡咯；R是低级烷基或苄基；R6和R9一起是 条件是R1到R9中至少一个是游离羧基基团。
用于本发明的所有药剂都是由上列通式代表的荧光化合物。四吡咯羧酸至少有一个且较好有三个羰基基团，并希望羧基基团是不对称连接的。例如，羧酸基团存在于分子的环上A和B侧，或存在于分子的环上C和D侧。
本发明的化合物中还包括有相应于上述四吡咯的二或四氢-四吡咯羧酸。此外还包括这些羧酸之羧基基团的医药上可接受的盐，如碱金属盐、碱土金属盐、铵和胺。
再者，用于本发明的化合物是氨基-羧酸与上述四吡咯羧酸的一、二或多酰胺。化合物的另一个可用基团是氨基羧酸与如上述同样四吡咯羧酸的一、二和多酰胺。另外还包括这些一、二或多酰胺羧基基团的医药上可接受的盐，如碱金属盐、碱土金属盐、铵和胺。
借助酰胺键与上述四吡咯羧酸连接形成一、二或多酰胺的上述氨基羧酸的例子有丝氨酸、甘氨酸、α-丙氨酸、β-丙氨酸、ε-氨基-正己酸、哌啶-2-羧酸、哌啶-6-羧酸、吡咯-2-羧酸、哌啶-6-丙酸、吡咯-5-乙酸及这类相似的酸。优选的氨基-羧酸是天然存在的α-氨基-羧酸，如丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸，这些氨基羧酸容易得到并可提供最好的结果。
氨基二羧酸的例子有α-氨基琥珀酸(天冬氨酸)、α-氨基戊二酸(谷氨酸)、β-氨基戊二酸、β-氨基癸二酸、2，6-哌啶二羧酸、2，5-吡咯二羧酸、2-羧基吡咯-5-乙酸、2-羧基哌啶-6-丙酸、2-氨基己二酸及α-氨基壬二酸。优选的氨基二羧酸是天然存在的α-氨基二羧酸如天冬氨酸和谷氨酸。这些化合物容易得到并可产生最佳结果。
本发明特别优选的是由下列通式代表的四吡咯化合物 其中X是H，乙烯基、乙基、乙酰或甲酰基；Y是甲基或甲酰基；M是甲基；E是乙基。
表1和2中示出了四吡咯类的典型化合物，其中四吡咯环结构的编号位置用于指定所指出之取代基的位置。在带有各组编号(环位置)的“二氢”下方指定环系统没有双键，表明指定的位置没有双键。
下面列举了用作本发明诊断和治疗剂的酰胺。首先给出氨基-羧酸之酰胺的例子。
二氢卟吩衍生物(D，L)-丝氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸ甘氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸα-(D，L)-丙氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸβ-丙氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸε-氨基-正己酰基-中二氢卟吩Ⅸ(D，L)-丝氨酰二氢卟吩e6(D，L)-丝氨酰-中二氢卟吩e6甘氨酰二氢卟吩e6甘氨酰中二氢卟吩e6α-(D，L)-丙氨酰二氢卟吩e6α-(D，L)-丙氨酰中二氢卟吩e6β-丙氨酰二氢卟吩e6β-丙氨酰中二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰基二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰基中二氢卟吩e6(D，L)-丝氨酰二氢卟吩e4(D，L)-丝氨酰中二氢卟吩e4(D，L)-丝氨酰异二氢卟吩e4(D，L)-丝氨酰中异二氢卟吩e4甘氨酰二氢卟吩e4甘氨酰中二氢卟吩e4
甘氨酰异二氢卟吩e4甘氨酰中异二氢卟吩e4α-(D，L)-丙氨酰二氢卟吩e4α-(D，L)-丙氨酰中二氢卟吩e4α-(D，L)-丙氨酰异二氢卟吩e4α-(D，L)-丙氨酰中异二氢卟吩e4β-丙氨酰二氢卟吩e4β-丙氨酰中二氢卟吩e4β-丙氨酰异二氢卟吩e4β-丙氨酰中异二氢卟吩e4ε-氨基-正己酰基二氢卟吩e4ε-氨基-正己酰基中二氢卟吩e4ε-氨基-正己酰基异二氢卟吩e4ε-氨基-正己酰基中异二氢卟吩e4(D，L)-丝氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸a甘氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸aα-(D，L)-丙氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸aβ-丙氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸aε-氨基-正己酰基焦脱镁叶绿甲酯-酸a(D，L)-丝氨酸脱镁叶绿甲酯-酸a甘氨酰脱镁叶绿甲酯-酸aα-(D，L)-丙氨酰脱镁叶绿甲酯-酸aβ-丙氨酰脱镁叶绿甲酯-酸aε-氨基-正己酰基脱镁叶绿甲酯-酸a
(D，L)-丝氨酰光原卟啉Ⅸ甘氨酰光原卟啉Ⅸα-(D，L)-丙氨酰-光原卟啉Ⅸβ-丙氨酰光原卟啉Ⅸε-氨基-正己酰基光原卟啉Ⅸ苏氨酰二氢卟吩e6酪氨酰二氢卟吩e6缬氨酰二氢卟吩e6亮氨酰二氢卟吩e6异亮氨酰二氢卟吩e6脯氨酰二氢卟吩e6蛋氨酰二氢卟吩e6组氨酰二氢卟吩e6精氨酰二氢卟吩e6赖氨酰二氢卟吩e6谷氨酰胺酰二氢卟吩e64-羟脯氨酰二氢卟吩e65-羟赖氨酰二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰基二氢卟吩e6γ-甲基组氨酰二氢卟吩e6з-甲基组氨酰二氢卟吩e6丙氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6缬氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6亮氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6
异亮氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6脯氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6蛋氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6甘氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6丝氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6苏氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6半胱氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6酪氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6天冬氨酰胺酰-2-乙酰二氢卟吩e6赖氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6精氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6组氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6谷氨酰胺酰-2-乙酰二氢卟吩e64-羟脯氨酰-2-乙酰-二氢卟吩e65-羟赖氨酰-2-乙酰-二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰-2-乙酰二氢卟吩e6γ-氨基丁酰-2-乙酰二氢卟吩e6з-甲基组氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6β-丙氨酰-2-乙酰二氢卟吩e6丙氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6缬氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6亮氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6异亮氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6组氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6
蛋氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6甘氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6丝氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6苏氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6半胱氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6酪氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6天冬酰胺酰-2-甲酰二氢卟吩e6赖氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6精氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6组氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6谷氨酰胺酰-2-甲酰二氢卟吩e64-羟脯氨酰-2-甲酰二氢卟吩e65-羟赖氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰-2-甲酰二氢卟吩e6γ-氨基丁酰-2-甲酰二氢卟吩e6з-甲基组氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6β-丙氨酰-2-甲酰二氢卟吩e6丙氨酰次二氢卟吩e6缬氨酰次二氢卟吩e6亮氨酰次二氢卟吩e6异亮氨酰次二氢卟吩e6脯氨酰次二氢卟吩e6蛋氨酰次二氢卟吩e6甘氨酰次二氢卟吩e6
丝氨酰次二氢卟吩e6苏氨酰次二氢卟吩e6半胱氨酰次二氢卟吩e6酪氨酰次二氢卟吩e6天冬酰胺酰次二氢卟吩e6赖氨酰次二氢卟吩e6精氨酰次二氢卟吩e6组氨酰次二氢卟吩e6谷氨酰胺酰次二氢卟吩e64-羟脯氨酰次二氢卟吩e65-羟赖氨酰次二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰次二氢卟吩e6γ-氨基丁酰次二氢卟吩e6з-甲基组氨酰次二氢卟吩e6β-丙氨酰次二氢卟吩e6缬氨酰中二氢卟吩e6亮氨酰中二氢卟吩e6异亮氨酰中二氢卟吩e6脯氨酰中二氢卟吩e6蛋氨酰中二氢卟吩e6丝氨酰中二氢卟吩e6苏氨酰中二氢卟吩e6半胱氨酰中二氢卟吩e6酪氨酰中二氢卟吩e6
天冬酰胺酰中二氢卟吩e6赖氨酰中二氢卟吩e6精氨酰中二氢卟吩e6组氨酰中二氢卟吩e6谷氨酰胺酰中二氢卟吩e64-羟脯氨酰中二氢卟吩e65-羟赖氨酰中二氢卟吩e6γ-氨基丁酰中二氢卟吩e6з-甲基组氨酰中二氢卟吩e6卟啉衍生物(D，L)-丝氨酰中卟啉Ⅸ甘氨酰中卟啉Ⅸα-(D，L)-丙氨酰中卟啉Ⅸβ-丙氨酰中卟啉Ⅸε-氨基-正己酰中卟啉Ⅸ(D，L)-丝氨酰原卟啉Ⅸ甘氨酰原卟啉Ⅸα-(D，L)-丙氨酰原卟啉Ⅸβ-丙氨酰原卟啉Ⅸε-氨基-正己酰原卟啉Ⅸ(D，L)-丝氨酰次原卟啉Ⅸ甘氨酰次原卟啉Ⅸα-(D，L)-丙氨酰原卟啉Ⅸβ-丙氨酰次原卟啉
ε-氨基-正己酰次原卟啉Ⅸ(D，L)-丝氨酰粪卟啉Ⅲ甘氨酰粪卟啉Ⅲα-(D，L)-丙氨酰粪卟啉Ⅲβ-丙氨酰粪卟啉Ⅲε-氨基-正己酰粪卟啉Ⅲ(D，L)-丝氨酰血卟啉Ⅸ甘氨酰血卟啉Ⅸα-(D，L)-丙氨酰血卟啉Ⅸβ-丙氨酰血卟啉Ⅸε-氨基-正己酰血卟啉Ⅸ细菌二氢卟吩衍生物(D，L)-丝氨酰细菌二氢卟吩e4甘氨酰细菌二氢卟吩e4α-(D，L)-丙氨酰细菌二氢卟吩e4β-丙氨酰细菌二氢卟吩e4ε-氨基-正己酰细菌二氢卟吩e4(D，L)-丝氨酰细菌异二氢卟吩e4甘氨酰细菌异二氢卟吩e4α-(D，L)-丙氨酰细菌异二氢卟吩e4β-丙氨酰细菌异二氢卟吩e4ε-氨基-正己酰细菌异二氢卟吩e4(D，L)-丝氨酰细菌异二氢卟吩e4甘氨酰细菌二氢卟吩e6
α-(D，L)-丙氨酰细菌二氢卟吩e6β-丙氨酰细菌二氢卟吩e6ε-氨基-正己酰细菌二氢卟吩e6(D，L)-丝氨酰焦细菌脱镁叶绿甲酯-酸a甘氨酰焦细菌脱镁叶绿甲酯-酸aα-(D，L)-丙氨酰焦细菌脱镁叶绿甲酯-酸aβ-丙氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸aε-氨基-正己酰焦细菌脱镁叶绿甲酯-酸a(D，L)-丝氨酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸a甘氨酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸aα-(D，L)-丙氨酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸aβ-丙氨酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸aε-氨基-正己酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸a下面进一步举出氨基-羧酸之二或多酰胺的例子。
二氢卟吩衍生物二-(D，L)-丝氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸ二-甘氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸ二-α-(D，L)-丙氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸ二-β-丙氨酰-反式中二氢卟吩Ⅸ二-ε-氨基-正己酰-中二氢卟吩Ⅸ二，三-(D，L)-丝氨酰二氢卟吩e6二，三-(D，L)-丝氨酰中二氢卟吩e6二，三-甘氨酰二氢卟吩e6二，三-甘氨酰中二氢卟吩e6
二，三-α-(D，L)-丙氨酰二氢卟吩e6二，三-α-(D，L)-丙氨酰中二氢卟吩e6二，三-β-丙氨酰二氢卟吩e6二，三-β-丙氨酰中二氢卟吩e6二，三-ε-氨基-正己酰二氢卟吩e6二，三-ε-氨基-正己酰中二氢卟吩e6二-(D，L)-丝氨酰二氢卟吩e4二-(D，L)-丝氨酰中二氢卟吩e4二-(D，L)-丝氨酰异二氢卟吩e4二-(D，L)-丝氨酰中异二氢卟吩e4二-甘氨酰二氢卟吩e4二-甘氨酰中二氢卟吩e4二-甘氨酰异二氢卟吩e4二-甘氨酰中异二氢卟吩e4二-α-(D，L)-丙氨酰二氢卟吩e4二-α-(D，L)-丙氨酰中二氢卟吩e4二-α-(D，L)-丙氨酰异二氢卟吩e4二-α-(D，L)-丙氨酰中异二氢卟吩e4二-β-丙氨酰二氢卟吩e4二-β-丙氨酰中二氢卟吩e4二-β-丙氨酰异二氢卟吩e4二-β-丙氨酰中异二氢卟吩e4二-ε-氨基-正己酰二氢卟吩e4二-ε-氨基-正己酰中二氢卟吩e4
二-ε-氨基-正己酰异二氢卟吩e4二-ε-氨基-正己酰中异二氢卟吩e4二-(D，L)-丝氨酰光原卟啉Ⅸ二-甘氨酰光原卟啉Ⅸ二-α-(D，L)-丙氨酰-光原卟啉Ⅸ二-β-丙氨酰光原卟啉Ⅸ二-ε-氨基-正己酰光原卟啉Ⅸ卟啉衍生物二-(D，L)-丝氨酰中卟啉Ⅸ二-甘氨酰中卟啉Ⅸ二-α-(D，L)-丙氨酰中卟啉Ⅸ二-β-丙氨酰中卟啉Ⅸ二-ε-氨基-正己酰中卟啉Ⅸ二-(D，L)-丝氨酰原卟啉Ⅸ二-甘氨酰-原卟啉Ⅸ二-α-(D，L)-丙氨酰原卟啉Ⅸ二-β-丙氨酰原卟啉Ⅸ二-ε-氨基-正己酰原卟啉Ⅸ二-(D，L)-丝氨酰次卟啉Ⅸ二-甘氨酰次卟啉Ⅸ二-α-(D，L)-丙氨酰次卟啉Ⅸ二-β-丙氨酰次卟啉Ⅸ二-ε-氨基-正己酰次卟啉Ⅸ二，三，四-(D，L)-丝氨酰粪卟啉Ⅲ
二，三，四-甘氨酰粪卟啉Ⅲ二，三，四-α-(D，L)-丙氨酰粪卟啉Ⅲ二，三，四-β-丙氨酰粪卟啉Ⅲ二，三，四-ε-氨基-正己酰粪卟啉Ⅲ二-(D，L)-丝氨酰血卟啉Ⅸ二-甘氨酰血卟啉Ⅸ二-α-(D，L)-丙氨酰血卟啉Ⅸ二-β-丙氨酰血卟啉Ⅸ二-ε-氨基-正己酰血卟啉Ⅸ细菌二氢卟吩衍生物二-(D，L)-丝氨酰细菌二氢卟吩e4二-甘氨酰细菌二氢卟吩e4二-α-(D，L)-丙氨酰细菌二氢卟吩e4二-β-丙氨酰细菌二氢卟吩e4二-ε-氨基-正己酰细菌二氢卟吩e4二-(D，L)-丝氨酰细菌异二氢卟吩e4二-甘氨酰细菌异二氢卟吩e4二-α-(D，L)-丙氨酰细菌异二氢卟吩e4二-β-丙氨酰细菌异二氢卟吩e4二-ε-氨基-正己酰细菌异二氢卟吩e4二，三-(D，L)-丝氨酰细菌二氢卟吩e6二，三-甘氨酰细菌二氢卟吩e6二，三-α-(D，L)-丙氨酰细菌二氢卟吩e6二，三-β-丙氨酰细菌二氢卟吩e6
二，三-ε-氨基-正己酰细菌二氢卟吩e6同样可使用其他氨基酸的下列酰胺，但它们并不是限制本发明。
二-苏氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-苏氨酰二氢卟吩e6二，三-苏氨酰中二氢卟吩e6二-苏氨酰二氢卟吩e4二-苏氨酰中二氢卟吩e4二-苏氨酰异二氢卟吩e4二-苏氨酰中异二氢卟吩e4二-苏氨酰光原卟啉Ⅸ二-苏氨酰中卟啉Ⅸ二-苏氨酰原卟啉Ⅸ二-苏氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-苏氨酰粪卟啉Ⅲ二-苏氨酰血卟啉Ⅸ二-苏氨酰细菌二氢卟吩e4二-苏氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-苏氨酰细菌二氢卟吩e6二-半胱氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-半胱氨酰二氢卟吩e6二，三-半胱氨酰中二氢卟吩e6二-半胱氨酰二氢卟吩e4二-半胱氨酰中二氢卟吩e4二-半胱氨酰异二氢卟吩e4
二-半胱氨酰中异二氢卟吩e4二-半胱氨酰光原卟啉Ⅸ二-半胱氨酰中卟啉Ⅸ二-半胱氨酰原卟啉Ⅸ二-半胱氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-半胱氨酰粪卟啉Ⅲ二-半胱氨酰血卟啉Ⅸ二-半胱氨酰细菌二氢卟吩e4二-半胱氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-半胱氨酰细菌二氢卟吩e6二-酪氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-酪氨酰二氢卟吩e6二，三-酪氨酰中二氢卟吩e6二-酪氨酰二氢卟吩e4二-酪氨酰中二氢卟吩e4二-酪氨酰异二氢卟吩e4二-酪氨酰中异二氢卟吩e4二-酪氨酰光原卟啉Ⅸ二-酪氨酰中卟啉Ⅸ二-酪氨酰原卟啉Ⅸ二-酪氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-酪氨酰粪卟啉Ⅲ二-酪氨酰血卟啉Ⅸ二-酪氨酰细菌二氢卟吩e4
二-酪氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-酪氨酰细菌二氢卟吩e6二-缬氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-缬氨酰二氢卟吩e6二，三-缬氨酰中二氢卟吩e6二-缬氨酰二氢卟吩e4二-缬氨酰中二氢卟吩e4二-缬氨酰异二氢卟吩e4二-缬氨酰中异二氢卟吩e4二-缬氨酰光原卟啉Ⅸ二-缬氨酰中卟啉Ⅸ二-缬氨酰原卟啉Ⅸ二-缬氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-缬氨酰粪卟啉Ⅲ二-缬氨酰血卟啉Ⅸ二-缬氨酰细菌二氢卟吩e4二-缬氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-缬氨酰细菌二氢卟吩e6二-亮氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-亮氨酰二氢卟吩e6二，三-亮氨酰中二氢卟吩e6二-亮氨酰二氢卟吩e4二-亮氨酰中二氢卟吩e4二-亮氨酰异二氢卟吩e4
二-亮氨酰中异二氢卟吩e4二-亮氨酰光原卟啉Ⅸ二-亮氨酰中卟啉Ⅸ二-亮氨酰原卟啉Ⅸ二-亮氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-亮氨酰粪卟啉Ⅲ二-亮氨酰血卟啉Ⅸ二-亮氨酰细菌二氢卟吩e4二-亮氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-亮氨酰细菌二氢卟吩e6二-异亮氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-异亮氨酰二氢卟吩e6二，三-异亮氨酰中二氢卟吩e6二-异亮氨酰二氢卟吩e4二-异亮氨酰异二氢卟吩e4二-异亮氨酰中二氢卟吩e4二-异亮氨酰中异二氢卟吩e4二-异亮氨酰光原卟啉Ⅸ二-异亮氨酰中卟啉Ⅸ二-异亮氨酰原卟啉Ⅸ二-异亮氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-异亮氨酰粪卟啉Ⅲ二-异亮氨酰血卟啉Ⅸ二-异亮氨酰细菌二氢卟吩e4
二-异亮氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-异亮氨酰细菌二氢卟吩e6二-脯氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-脯氨酰二氢卟吩e6二，三-脯氨酰中二氢卟吩e6二-脯氨酰二氢卟吩e4二-脯氨酰中二氢卟吩e4二-脯氨酰中异二氢卟吩e4二-脯氨酰光原卟啉Ⅸ二-脯氨酰中卟啉Ⅸ二-脯氨酰原卟啉Ⅸ二-脯氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-脯氨酰粪卟啉Ⅲ二-脯氨酰血卟啉Ⅸ二-脯氨酰细菌二氢卟吩e4二-脯氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-脯氨酰细菌二氢卟吩e6二-苯丙氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-苯丙氨酰二氢卟吩e6二，三-苯丙氨酰中二氢卟吩e6二-苯丙氨酰二氢卟吩e4二-苯丙氨酰中二氢卟吩e4二-苯丙氨酰异二氢卟吩e4二-苯丙氨酰中异二氢卟吩e4
二-苯丙氨酰光原卟啉Ⅸ二-苯丙氨酰中卟啉Ⅸ二-苯丙氨酰原卟啉Ⅸ二-苯丙氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-苯丙氨酰粪卟啉Ⅲ二-苯丙氨酰血卟啉Ⅸ二-苯丙氨酰细菌二氢卟吩e4二-苯丙氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-苯丙氨酰细菌二氢卟吩e6二-色氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-色氨酰二氢卟吩e6二，三-色氨酰中二氢卟吩e6二-色氨酰二氢卟吩e4二-色氨酰中二氢卟吩e4二-色氨酰异二氢卟吩e4二-色氨酰中异二氢卟吩e4二-色氨酰光原卟啉Ⅸ二-色氨酰中卟啉Ⅸ二-色氨酰次卟啉Ⅸ二-色氨酰原卟啉Ⅸ二，三，四-色氨酰粪卟啉Ⅲ二-色氨酰血卟啉Ⅸ二-色氨酰细菌二氢卟吩e4二-色氨酰细菌异二氢卟吩e4
二，三-色氨酰细菌二氢卟吩e6二-蛋氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-蛋氨酰二氢卟吩e6二，三-蛋氨酰中二氢卟吩e6二-蛋氨酰二氢卟吩e4二-蛋氨酰中二氢卟吩e4二-蛋氨酰异二氢卟吩e4二-蛋氨酰中异二氢卟吩e4二-蛋氨酰光原卟啉Ⅸ二-蛋氨酰中卟啉Ⅸ二-蛋氨酰原卟啉Ⅸ二-蛋氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-蛋氨酰粪卟啉Ⅲ二-蛋氨酰血卟啉Ⅸ二-蛋氨酰细菌二氢卟吩e4二-蛋氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-蛋氨酰细菌二氢卟吩e6二-组氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-组氨酰二氢卟吩e6二，三-组氨酰中二氢卟吩e6二-组氨酰二氢卟吩e4二-组氨酰中二氢卟吩e4二-组氨酰异二氢卟吩e4二-组氨酰中异二氢卟吩e4
二-组氨酰光原卟啉Ⅸ二-组氨酰中卟啉Ⅸ二-组氨酰原卟啉Ⅸ二-组氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-组氨酰粪卟啉Ⅲ二-组氨酰血卟啉Ⅸ二-组氨酰细菌二氢卟吩e4二-组氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-组氨酰细菌二氢卟吩e6二-精氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-精氨酰二氢卟吩e6二，三-精氨酰中二氢卟吩e6二-精氨酰二氢卟吩e4二-精氨酰异二氢卟吩e4二-精氨酰中异二氢卟吩e4二-精氨酰光原卟啉Ⅸ二-精氨酰中卟啉Ⅸ二-精氨酰原卟啉Ⅸ二-精氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-精氨酰粪卟啉Ⅲ二-精氨酰血卟啉Ⅸ二-精氨酰细菌二氢卟吩e4二-精氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-精氨酰细菌二氢卟吩e6
二-赖氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-赖氨酰二氢卟吩e6二，三-赖氨酰中二氢卟吩e6二-赖氨酰二氢卟吩e4二-赖氨酰中二氢卟吩e4二-赖氨酰异二氢卟吩e4二-赖氨酰中异二氢卟吩e4二-赖氨酰光原卟啉Ⅸ二-赖氨酰中卟啉Ⅸ二-赖氨酰原卟啉Ⅸ二-赖氨酰次卟啉Ⅸ二，三，四-赖氨酰粪卟啉Ⅲ二-赖氨酰血卟啉Ⅸ二-赖氨酰细菌二氢卟吩e4二-赖氨酰细菌异二氢卟吩e4二，三-赖氨酰细菌二氢卟吩e6二-谷氨酰胺酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-谷氨酰胺酰二氢卟吩e6二，三-谷氨酰胺酰中二氢卟吩e6二-谷氨酰胺酰二氢卟吩e4二-谷氨酰胺酰中二氢卟吩e4二-谷氨酰胺酰异二氢卟吩e4二-谷氨酰胺酰中异二氢卟吩e4二-谷氨酰胺酰光原卟啉Ⅸ
二-谷氨酰胺酰中卟啉Ⅸ二-谷氨酰胺酰原卟啉Ⅸ二-谷氨酰胺酰次卟啉Ⅸ二，三，四-谷氨酰胺酰粪卟啉Ⅲ二-谷氨酰胺酰血卟啉Ⅸ二-谷氨酰胺酰细菌二氢卟吩e4二-谷氨酰胺酰细菌异二氢卟吩e4二，三-谷氨酰胺酰细菌二氢卟吩e6二-天冬酰胺酰反式中二氢卟吩Ⅸ二，三-天冬酰胺酰二氢卟吩e6二，三-天冬酰胺酰中二氢卟吩e6二-天冬酰胺酰二氢卟吩e4二-天冬酰胺酰中二氢卟吩e4二-天冬酰胺酰异二氢卟吩e4二-天冬酰胺酰中异二氢卟吩e4二-天冬酰胺酰光原卟啉Ⅸ二-天冬酰胺酰中卟啉Ⅸ二-天冬酰胺酰原卟啉Ⅸ二-天冬酰胺酰次卟啉Ⅸ二，三，四-天冬酰胺酰粪卟啉Ⅲ二-天冬酰胺酰血卟啉Ⅸ二-天冬酰胺酰细菌二氢卟吩e4二-天冬酰胺酰细菌异二氢卟吩e4二，三-天冬酰胺酰细菌异二氢卟吩e6
下面列举氨基二羧酸之一、二或多酰胺的例子。
二氢卟吩衍生物一和二天冬氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ一和二谷氨酰反式中二氢卟吩Ⅸ一，二和三天冬氨酰二氢卟吩e6一，二和三天冬氨酰中二氢卟吩e6一，二和三谷氨酰二氢卟吩e6一，二和三谷氨酰中二氢卟吩e6一和二天冬氨酰二氢卟吩e4一和二天冬氨酰中二氢卟吩e4一和二天冬氨酰异二氢卟吩e4一和二天冬氨酰中异二氢卟吩e4一和二谷氨酰二氢卟吩e4一和二谷氨酰中二氢卟吩e4一和二谷氨酰异二氢卟吩e4一和二谷氨酰中异二氢卟吩e4一天冬氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸a一谷氨酰焦脱镁叶绿甲酯-酸a一天冬氨酰脱镁叶绿甲酯-酸a一谷氨酰脱镁叶绿甲酯-酸a一和二天冬氨酰光原卟啉Ⅸ一和二谷氨酰光原卟啉Ⅸ一和二-L-α-氨基己二酰反式中二氢卟吩Ⅸ卟啉衍生物
一和二天冬氨酰中卟啉Ⅸ一和二谷氨酰中卟啉Ⅸ一和二天冬氨酰原卟啉Ⅸ一和二谷氨酰原卟啉Ⅸ一和二天冬氨酰次卟啉Ⅸ一和二谷氨酰次卟啉Ⅸ一，二，三和四天冬氨酰粪卟啉Ⅲ(异构体混合物)一，二，三和四谷氨酰粪卟啉Ⅲ一和二天冬氨酰血卟啉Ⅸ一和二谷氨酰血卟啉Ⅸ细菌二氢卟吩衍生物一和二天冬氨酰细菌二氢卟吩e4一和二谷氨酰细菌二氢卟吩e4一和二天冬氨酰细菌异二氢卟吩e4一和二谷氨酰细菌异二氢卟吩e4一，二和三天冬氨酰细菌二氢卟吩e6一，二和三谷氨酰细菌二氢卟吩e6一天冬氨酰焦细菌脱镁叶绿甲酯-酸a一谷氨酰焦细菌脱镁叶绿甲酯-酸a一天冬氨酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸a一谷氨酰细菌脱镁叶绿甲酯-酸a可使用文献中记载的各种合成方法制备用于本发明的四吡咯化合物。例如，就二氢卟吩e6来说可列举出下列文献。
(1)Willstatter,R.andStoll,A.;“InvestigationsonChlorophyll”，(Trans.:Schertz,F.M.,Merz,A.R.),P.176,SciencePrintingPress,Lancaster,Pennsylvania,USA,1928。
(2)Willstartter，R.andIsler,M.;Ann.Chem.;390,269(1912)。
本发明中所利用的化合物可用来光动力学诊断和光动力学治疗类风湿性关节炎。当用上述化合物处理患有类风湿关节炎的病人时，化合物选择性地积聚在关节受损部位，并且当将适当波长和强度的光射线施加于损伤处时，化合物可发出荧光并产生活泼氧。从而可经检查所产生的荧光诊断关节损伤并利用活泼氧的细胞毒性作用治疗所受到的损伤。
用药的活体宿主是其体内有类风湿性关节炎的哺乳动物。
用于光动力学诊断和光动力学治疗的化合物应具有下列性质(a)在被光线激活之前正常诊断或治疗剂量没有毒性；(b)应选择性地积聚在关节损伤部位；(c)在特定波长应有选择性地光活性；(d)当用光线或电磁波照射时，它们产生可检测的特异性荧光；(e)当用光线或电磁波照射时，它们在关节损伤处被激活至细胞毒性水平；并且(f)在诊断和治疗处理后容易被代谢或排出。
作为用于本发明的诊断或治疗剂，前述化合物必须具有活性性质，并且还有在生理PH下在水中有合理溶解度的特征。
与使用前述PhotofrinⅡ的血卟啉衍生物这类常规四吡咯相比，以同样剂量本发明的上述化合物可在关节炎损伤处产生更大的荧光。因此，使用上述化合物时，与关节炎损伤部位周围的正常组织相比，关节炎损伤可呈现更强的对照。
此外，由某些常规使用的四吡咯产生的荧光强度有所变异，或者每天之间在宿主体内产生的荧光有所不同，但由上述化合物产生的荧光强度则是很稳定的。
用于本发明的化合物吸收在300至800nm波长范围内的进行光动力学诊断和光动力学治疗的活化能，其中优选的化合物在360至760nm范围有吸收，即较长波长的光更容易使能量穿透到关节炎损伤处，以有利于达到光动力学诊断和光动力学治疗的目的。
应顺便提到的是，与溶在磷酸盐缓冲盐水溶液中的同样化合物相比，由积聚在关节炎损伤处的用于本发明的化合物发射之荧光的特定波长约移动10nm。根据这一事实，认为用于本发明的化合物并不是从物理上被简单地接收在关节炎损伤部位内，而是通过某些互连机制与损伤相接通。当波长移动时，也常常会引起荧光强度的改变。然而，对于前述化合物来说，荧光的强度不是被减弱，而是增强。因此，上面提到的化合物最适用于光动力学诊断和光动力学治疗。
根据已有经验，因为上述化合物可均匀地分布于所有关节炎损伤的周围，所以所用剂量可大为降低。因为可降低使用剂量，故有可能在既使服用的化合物未被排出时亦可出现光动力学致敏作用。
前述化合物的给药量依据用药学目的而定。用于诊断目的时，仅1mg/kg(活体体重)的剂量即产生检测效果。但这个量通常高达约5mg/kg。同于治疗目的的给药剂量一般在大约0.1至20mg/kg范围内。鉴于上述用于本发明之化合物的可从活体内排泄这一优点，用于诊断和治疗的给药量可有很宽范围的变化。在上述诊断和治疗剂量下，本发明的化合物显然是无毒无害的。例如，在以高达20mg/kg的剂量用本发明化合物进行实验，没有引起试验动物的死亡。
用适当方法给待诊断或治疗的活体宿主使用溶解于适当含水溶液如磷酸盐缓冲盐水溶液中的用于本发明的化合物。除含水溶液外，还可以是含有适当分散剂的含水分散液。较好用直接方法如静脉内注射法投用此药物化合物。同时，也可以口服、肌肉内或皮下给药。还可以直接向关节腔内给药。在任何情况下，上述化合物的溶液都可含有下列已知物质粘结剂如黄蓍胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖；防腐剂如Paraben；香料如樱桃香味剂；溶剂或分散介质如水、乙醇或乙二醇；抗菌剂和等渗剂如糖和氯化钠。
这些化合物较好作为碱性盐来制备，例如冰干的无色素无菌化合物形式的钠盐。优选的药制制型是适于注射的等渗压溶液。
虽然尚不明确其原因，但用于本发明的化合物可以特异性地和选择性地积聚在活体的关节炎损伤处(增生的滑膜)。因此，在静脉内给药适当时间如几分钟至几小时后，即对关节炎损伤施加光线照射。
照射量必须能足以使化合物产生诊断所需的荧光并发挥治疗所需的细胞毒性效应。对光动力学诊断和光动析学治疗中照射用的光源没有限制，但一般是使用激光束，因为这样可选择性地施加在所需波长范围内的强度光线。
可用的激光束照射源是通过滤光器、发射染料激光或其他激光之装置及透射束系统的强连续光源。如上所述，激光束的波长范围为360至760nm。一般照射的强度是从10至1000nw/cm2，较好20至500mw/cm2范围内适当选择的。激光装置的能力至少是500mw。一些商品激光装置适合这些要求。
在光动力学诊断实践中，将上述化合物用于人或动物体内，并在一定时间之后将光线施加于待检查的损伤处。如可使关节窥镜检查时或膝关节损伤，则可使用关节窥镜进行照射。风湿性关节炎的损伤选择性地产生荧光，可用裸眼或借助CRT屏幕上的影象来观察损伤。
在光动力学治疗和实践中，在给用化合物后从石英纤维束的尖端进行激光束照射。这可通过将石英纤维束的尖端插入关节炎损伤处以及照射关节炎损伤的表面来进行。直接用裸眼或借助CRT屏幕上的影象观察被照射的状况。
使用上述药剂进行诊断和治疗，可适用于引起关节腔内滑膜生长或炎症的疾病，如引起关节炎的疾病、与类风湿性关节炎相似的疾病或类风湿性关节炎的并发症。例如，青少年类风湿性关节炎、系统性红瘢狼疮、莱特尔氏综合症、关节病性牛皮癣和色素沉着性绒毛小节滑膜炎等类似疾病。
下面用涉及上述医药化合物之医药效果试验的实施例更详细地描述本发明。
给受佐剂诱发之关节炎影响的大鼠(下文称为“A.A.大鼠”)服用上述化合物以进行光动力学诊断和光动力学治疗。A.A.大鼠患有在形态学和生物化学特征上与人类风湿性关节炎十分相似的关节炎损伤。
使用一-L-天冬氨酰二氢卟吩e6(下文称之为“NPe6”)作为试验化合物。
用PhotofrinⅡ(商品名，PhotofrinMedicaInc.生产)作为与之比较的化合物。这些化合物被溶解在磷酸盐缓冲盐水(PH7.4)中使用。
制备实施例1一-L-天冬氨酰二氢卟吩e6的制备按照Fischer和Stern(Di Chemie Des Pyrroles,Vol.Ⅱ,Second half,Leipzig 1940,Akademische Verlagsgesellschaft,pp.91-93)所述的方法制备二氢卟吩e6。
将150mg二氢卟吩e6(游离酸形式)和250mg盐酸L-天冬氨酰二叔丁基酯溶解在20ml二甲基甲酰胺中。于1小时间隔总共加入3-100mgN，N′-二环己基碳二亚胺。4小时后，用300ml乙醚稀释反应混合物，用200mlH2O洗两次，然后用40ml1MKOH提取。使KOH溶液水解过夜，然后于70℃加热10分钟。
将溶液的PH调到7，然后经闪蒸法除去残留的醚。将溶液加于反相(C-18硅胶)柱(1.5Cmφ×30Cm)上层析。用甲醇/0.01MKPO4缓冲液(PH6.85)分步洗脱以纯化产物。用5%甲醇洗脱直到除去不要的极性色素。用6-8%甲醇洗脱掉一天冬氨酰二氢卟吩e6，并用25%甲醇除去未反应的二氢卟吩e6。
闪蒸除去甲醇后于PH3沉淀产物，然后用稀乙酸经反复离心洗3次。
真空干燥产物。一-L-天冬氨酰二氢卟吩e6的产率为50mg。
制备实施例2一-L-丝氨酰二氢卟吩e6的制备按照实施例1所用的相似方法制备二氢卟吩e6。100mg二氢卟吩e6和35mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸化物溶解在2mlN，N′-二甲基甲酰胺中。5分钟后，加入125mg盐酸L-丝氨酰苄酯，强烈搅拌直到溶液完全形成，然后于室温放置2小时。此时，加入0.5ml冰乙酸，再加入30ml甲醇和12mlH2O。
将溶液加于C-18反相柱上。先用100mlH2O，然后4ml1MNH4OH，再用50mlH2O洗柱。用MeOH/H2O洗脱产物。在C-18反相板上用70%MeOH/30%缓冲液(0.1M磷酸钠，PH6.85)(V/V)的溶剂进行TLC检测，可见用30%至80%MeOH洗脱的部分含有产物及碳二亚胺活化的二氢卟吩。
合并这些洗脱部分并加入足量3NNaOH使之成为0.1N的NaOH溶液。1小时后，用上述系统进行TLC检测到水解完成。旋转蒸发除去甲醇，并用HCl将溶液的PH调到7.5。然后再将二氢卟吩溶液上同样的反相柱，用水洗，并使用10至50%甲醇的渐增梯度，用MeOH/水洗脱。合并经TLC检测含有纯一-L-丝氨酰二氢卟吩e6部分(Rf稍大于未被取代的二氢卟吩e6)，旋转蒸发除去甲醇，经冷冻干燥得到作为三钠盐的产物。
动物试验使用人工造成类风湿性关节炎的正常Lewis系统LEW/Crj大鼠(由JapanCharlesRiver提供)作实验用的A.A.大鼠。因为这些大鼠的疾病模型与人类疾病十分相符，所以很适于进行这种类型的试验。
将由Difco制造的MycobacteriumtuberculosisH37RA佐剂注入8周令雄性Lewis系统LEW/Crj大鼠右后肢的足部(0.6mg/动物)。接种的24小时内发生腿部红肿。2-3周后，在表现慢性关节炎的关节周围发生慢性增殖性骨膜炎。
实验中，分别用各治疗剂对每组5只大鼠进行诊断试验或治疗试验。
试验装置用于这些实验的装置包括直径2.1mm的导管(Sumitomo Electric Industries,Ltd.制造)、激发光敏物质的氩染料激光器(Spectrum Physics制造)和荧光光谱分析系统。可将激发光敏物质之氩染料激光器的波长调到相当于各个物质之吸收带的405mm、630nm或664nm，并以100mw/Cm2的照射剂量使用之。将此激光束引入芯直径300μm的石英纤维束中，然后使之通过导管。
诊断实施例1接种佐剂1，2，3和4周后，以每kg体重1mg的剂量通过尾静脉给A.A.大鼠注射试验化合物。给药后6小时，在Nembutal麻醉下切开已接种佐剂的右后肢膝关节，并使用能通过激光束的内窥镜导管将405nm的激光束施加可损伤处。用荧光分析器观察由受损部位(增生性滑膜)摄入之物质产生的特定荧光光谱。根据600-700nm范围内荧光光谱的积分面积计算荧光强度，并采用所得数值作为被积聚之化合物的判断标准。
光动力学诊断之后，麻醉下杀死动物，切掉膝关节作为标本。用苏木精-伊红染色法对标本进行组织学检查并比较荧光强度和炎症程度。
用同周令的正常大鼠作基本对照。作为比较实施例，给带有相似疾病状态的A.A.大鼠使用PhotofrinⅡ并对其进行相似试验。
治疗处理实施例1按照表3中指出的治疗条件，在接种佐剂后3周，通过尾静脉以每公斤体重0.5mg的量给A.A.大鼠注射试验化合物。给药后6小时，在Nembutal麻醉下切开接种了佐剂的右后肢膝关节并激光束直接施加于关节腔内。用荧光分析器观察受损处(增生的滑膜)摄入之物质产生的特定荧光光谱。然后对待观察的摄入了足够量化合物的受损伤部位施加50J/Cm2的405-664nm激光束以进行治疗处理。处理后，缝合切口并向伤口和关节腔内注射抗生素，然后将大鼠喂养1周。处理后1周，给动物注射1mg/kg的同一试验化合物并进行光动力学诊断。诊断后，在麻醉下杀死动物，切除膝关节用作标本。用苏木精-伊红染色法对标本进行组织学检查，以比较荧光的强度和炎症的程度。
将施加50J/Cm2激光照射但没有给予试验化合物的处于相似疾病状态的A.A.大鼠作为对照。作为比较实施例，给处于相似疾病状态的A.A.大鼠使用Photofrin Ⅱ并对它们进行相似的试验。
表3，治疗处理的方法化合物剂量时间(*)激光波长激光强度照射mg/kg 小时 nm mw/Cm2J/Cm2PhotofrinII0.5640510050PhotofrinII0.5663010050NPe60.5 6 405 100 50NPe60.5 6 664 100 50对照--66410050(*)从给药到照射的时间长度试验结果1以下说明诊断实施例1的结果。
在接种佐剂后3周给患有佐剂关节炎的大鼠使用各化合物。对膝关节施加激光束照射并用光动力学诊断法检测膝关节中化合物的荧光强度。结果如表4所示。
结果可见，Photofrin组动物的关节炎损伤(增生的滑膜)中荧光强度为3.5，而其他正常软骨组织中这一值为1.2。正常组织的跟腱和肌肉中该值为0.5。另一方面，NPe6组动物的关节炎损伤(增生的滑膜)中荧光强度为16.0，而正常组织的其他软骨中该值为1.0。正常组织的跟腱和肌肉中该值为0.2。
在同样周令的正常大鼠中，使用Photofrin Ⅱ组的正常滑膜中荧光强度为0.2，其他正常软骨、跟腱和肌肉组织中则测不到荧光。另外，使用NPe6组的正常滑膜中荧光强度为0.2，且其他正常软骨、跟腱和肌肉组织中未检测到荧光。
表4光动力学诊断中包括受损部位(增生的滑膜)在内的各组织中的荧光强度组织 Photofrin II NPe6佐剂关节炎大鼠受损组织3.516.0(增生的滑膜)软骨1.21.0跟腱0.50.2肌肉0.50.2正常大鼠受损部位0.20.2软骨0.00.0跟腱0.00.0肌肉0.00.0接种佐剂后1至4周给患不同程度炎症的A.A.大鼠投服NPe6以进行相似诊断。通过检测荧光强度来研究所测得的强度与组织学诊断的炎症程度之间的相互关系。结果示于表5中。
接种佐剂后1周滑膜细胞的荧光强度为2.0。其他正常软骨、跟腱和肌肉组织中几乎观察不到荧光。根据对同样损伤的组织学诊断，滑膜细胞的生长不太大并且软骨是正常的(+1)。接种佐剂的左腿肿胀轻微。
佐剂接种后2周，滑膜细胞的荧光强度为10.5。其他正常软骨、跟腱和肌肉组织中几乎观察不到荧光。根据对同一损伤的组织学诊断，观察到滑膜细胞生长(+4)，且肿胀程度为正常值的2倍以上。
佐剂接种后3和4周滑膜细胞的荧光强度都是16.0。在其他正常组织中，软骨为1.0，足腱和肌肉为0.2。根据对同一损伤的组织学诊断，观察到滑膜生长剧烈，并由于颗粒形成而构成绒毛和形成血管翳(+5)。肿胀为正常值的2倍以上。上述观察表明发生了佐剂引起的关节炎损伤。
如上所述，NPe6的荧光强度与佐剂关节炎的强度有一定关系。因此，比较NPe6的摄入可确定炎症的程度。
表5NPe6的荧光强度对类风湿性关节炎的程度和诊断结果试验项目接种佐剂后A.A.大鼠周令0周(正常)1周2周3周4周荧光强度软骨0.00.00.21.01.0跟腱0.00.00.00.20.2肌肉0.00.00.00.20.2滑膜0.02.010.516.016.0诊断结果组织学诊断(1)±0+1+4+5+5肿胀程度(2)5.57.512.513.013.0注(1)组织学诊断受损伤组织滑膜细胞的生长程度和血管翳形成。
评价±0指示滑膜细胞量和形态正常，软骨亦正常↓+5指示过度增生的滑膜细胞状态及血管翳形成(2)肿胀程度接种佐剂之右后腿的直径(mm)。
试验结果2下面描述治疗处理1的结果。
接种佐剂后3周给患有类风湿性关节炎的A.A.大鼠注射各化合物。对膝关节腔施予激光束照射进行光动力学诊断，以便进一步证实有足够的药制摄入。用50J/Cm2激光束照射受影响的损伤部位(过度增生的滑膜)以进行治疗处理。处理后1周，给予同一药剂进行光动力学诊断，从而将所得数值与治疗处理前的数值相比较。结果示于下列表6中。
结果可见，使用Photofrin Ⅱ的实验组动物，受损部位的荧光强度在治疗处理前为3.5至3.6，处理后为1.8至2.0。同时，使用NPe6的动物组，受损部位的荧光强度处理前为16.0-16.2，处理后为1.9-2.4。
有同样疾病状态且没有使用药剂的A.A.大鼠中，于治疗处理前和后均未观察到荧光。
在Photofrin Ⅱ组中，治疗处理后相对于处理前受损部位中荧光强度的平均比率为54%。而在NPe6组中，此平均比率低达13%。因此可以肯定，与Photofrin Ⅱ组相比，NPe6组经治疗处理可更为有效地缓解炎症的进展。
表6光动力学治疗前后受损部位(增生的滑膜)中药剂的荧光强度项目波长(1)荧光强度(2)药剂(nm)处理前处理后PhotofrinII4053.52.0PhotofrinII6303.61.8NPe6405 16.0 2.4NPe6663 16.2 1.9不给药6630.00.0注(1)波长用于治疗处理的激光束的波长。
(2)荧光强度处理前和处理后1周在损伤处经光动力学诊断所观察到的荧光强度。
表7中显示的是对被治疗的损伤处组织标本进行组织学诊断和直观诊断的比较结果。在PhotofrinⅡ治疗组中，只见有轻度的滑膜细胞改变，未观察到任何明显差异及显著治疗效果(+3)。
另一方面，在NPe6治疗组中，滑膜细胞有空泡形成或萎缩，并且观察到滑膜细胞的脱落。由于上述效果，观察到肿胀减轻并且损伤有所改善(±0至+1)。
在施加405和664nm两种波长激光束照射的NPe6治疗组中，得到同样好的治疗效果。
对于没有给用药剂的一组有相似疾病状态的A.A.大鼠，用50J/Cm2激光束照射，观察到所受损伤没有改变(+5)。
如上所述，NPe6组的治疗效果高于Photofrin Ⅱ组，而且显然地观察到类风湿性关节炎病情的缓解和改善。
表7光动力学治疗的结果(1)(2)(3)(4)药剂波长(nm)荧光强度组织学诊断直观诊断PhotofrinII4052.0+3+3PhotofrinII6301.8+3+3NPe6405 2.4 +1 +1NPe6664 1.9 ±0 ±0不给药6640.0+5+5注(1)波长用于治疗照射的激光束波长。
(2)荧光强度治疗处理后1周经光动力学诊断所观察到的被治疗损伤处的荧光强度。
(3)组织学诊断受损部位滑膜细胞过度增生的程度和血管翳形成。
评价±0表示滑膜细胞处于正常形态和正常量，且软骨正常。
↓+5表示增生的滑膜细胞状态和血管翳形成。
(4)直观诊断(肿胀程度)表示肉眼观察到的肿胀和改变的程度。
评价±0表示右腿的直径为正常值。
↓
+5表示右腿肿胀并伴有功能障碍。
针对上述化合物的毒理学性质进行了急性毒性试验。
给大鼠(品系Sprague-Dawley)静脉内注射NPe6以确定50%致死量(LD50)。雄性大鼠的LD50值为176mg/kg，雌性大鼠的LD50值为184mg/kg。对小鼠(品系C3H/HEJ)静脉内给药，测得雄性小鼠的LD50值为214mg/kg，雌性为187mg/kg。
试验结果的总结(1)发现使用NPe6进行光动力学治疗对于类风湿性关节炎的消退和治愈损伤是有效的。在与使用已知的Photofrin Ⅱ进行比较中，对有同样疾病程度的关节炎损伤使用同样量的治疗效可望获得更好的治疗效果(关节炎损伤消退)。
(2)在用NPe6进行的光动力学诊断中，证实与使用Photofrin Ⅱ相比，可更好地选择性摄入关节炎损伤部位。即使使用小剂量化合物，它也能鉴定关节炎损伤，从而能够特异性地对关节炎损伤集中发挥治疗效果。
(3)NPe6的荧光强度与类风湿性关节的严重程度有相互关联。因此，可通过比较NPe6的摄入量来确定疾病的程度。
(4)在使NPe6中，用相当于其吸收带的波长为405或664nm的激光束处理，可以提供良好治疗效果。
本发明的效果给患有关节炎的哺乳动物使用上述化合物并进行光动力学诊断和光动力学治疗。结果确定有下列效果(1)因药物化合物能选择性地积聚在关节炎损伤处，故可直接关准确地诊断和治疗疾病。
(2)治疗后1周，关节中异常生长的滑膜所表现的细胞空泡形成和萎缩，以及肿胀均得到缓解。
(3)与常规使用的PhotofrinⅡ等药剂相比，当给有同样严重程度的关节炎损伤施用同样量的药剂时，可望产生更为明显的治疗效果。
权利要求
1.用于诊断和/或治疗哺乳动物关节炎的药剂，该药剂包括至少一种选自下列一组中的荧光化合物由下列通式代表的至少有一个羧基基团的四吡咯羧酸，相应的二氢四吡咯或四氢四吡咯羧酸、所说四吡咯羧酸与氨基-一羧酸或氨基-二羧酸的一酰胺、二酰胺或多酰胺，以及它们的医药上可接受的盐； 其中R1是甲基， R2是H，乙烯基，乙基，-CH(OH)CH3，乙酰基， -CH2CH2COOH或=CHCHO；R3是甲基、 R4是H，乙烯基、乙基，-CH(OH)CH3，-CH2CH2COOH，=CHCHO或 ；R5是甲基；R6是H，-CH2CH2COOH，-CH2CH2COOR或-COOH；R7是-CH2CH2COOH，-CH2CH2COOR或 ；R8是甲基或 ；R9是H，-COOH，-CH2COOH或甲基；条件是当R1、R2、R3、R4、R7和R8代表两个取代基或者是二价的并且连接到同一个碳上时，其所连接的各个吡咯环为二氢吡咯；R是低级烷基或苄基；R6和R9一起是 条件是R1至R9中至少一个是游离羧基基团。
2.根据权利要求1的药剂，其中被诊断和治疗的损伤是关节中滑膜的增生性颗粒形成。
3.根据权利要求1的药剂，其中所说氨基-一羧酸或二羧酸是天然α-氨基-一羧酸或α-氨基-二羧酸。
4.根据权利要求1的药剂，其中所说的四吡咯羧酸至少有3个羧基基团。
5.根据权利要求4的药剂，其中所说的四吡咯羧酸是由下列通式代表的 其中X是H、乙烯基、乙基、乙酰基或甲酰基；Y是甲基或甲酰基；M是甲基；且E是乙基。
6.根据权利要求3的药剂，其中所说的天然α-氨基-一羧酸或α-氨基-二羧酸至少是选自丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的一个成员。
7.根据权利要求1的药剂，其中所说的酰胺是一-L-天冬氨酰二氢卟吩e6或一-L-丝氨酰二氢卟吩e6。
8.诊断和/或治疗哺乳动物关节炎的方法，该方法包括给哺乳动物投用积聚在所说哺乳动物体内关节炎损伤处的有效量荧光四吡咯化合物，并施加足够波长和强度的光以在所说关节炎损伤中产生荧光和/或细胞毒性效应，其中所说的四吡咯化合物选自于由下列通式代表的具有至少一个羧基基团的四吡咯羧酸，和相应的二氢四吡咯或四氢四吡咯羧酸，和所说四吡咯羧酸与氨基-一羧酸或二羧酸的一酰胺、二酰胺与多酰胺，以及它们的医药上可接受的盐 其中R1是甲基， R2是H，乙烯基，乙基，-CH(OH)CH3，乙酰基， ，-CH2CH2COOH或=CHCHO；R3是甲基， R4是H，乙烯基，乙基，-CH(OH)CH3，-CH2CH2COOH，=CHCHO或 R5是甲基；R6是H，-CH2CH2COOH，-CH2CH2COOR或-COOH；R7是-CH2CH2COOH，-CH2CH2COOR或 R8是甲基或 R9是H，-COOH，-CH2COOH或甲基；条件是当R1、R2、R3、R4、R7或R8代表两个取代基或是二价的并且连接在同一个碳上时，则其所连接的各个吡咯环为二氢吡咯；R是低级烷基或苄基R6和R9合在一起是 条件是R1至R9中至少一个是游离羧基基团。
9.根据权利要求8的方法，其中用所说的方法诊断和治疗的损伤是关节中滑膜的增生性颗粒形成。
10.根据权利要求8的方法，其中所说光的波长约为300nm至800nm。
11.根据权利要求10的方法，其中所说的波长约为360nm至760nm。
12.根据权利要求8的方法，其中所说光的强度约为10mw/cm2至1000mw/cm2。
13.根据权利要求8的方法，其中所说四吡咯化合物的剂量约为0.1至20mg/kg。
14.根据权利要求8的方法，其中所说的氨基-一羧酸或二羧酸是天然α-氨基-一羧酸或α-氨基-二羧酸。
15.根据权利要求8的方法，其中所说的四吡咯羧酸至少有3个羧基基团。
16.根据权利要求15的方法，其中所说的四吡咯羧酸是由下列通式代表的 其中X是H，乙烯基，乙基、乙酰基或甲酰基；Y是甲基或甲酰基；M是甲基；且E是乙基。
全文摘要
对哺乳动物的类风湿性关节炎进行光动力学诊断或光动力学治疗的方法和药剂，所说的药剂包括选自下列一组中的至少一种荧光化合物至少有一个羧基基团的四吡咯羧酸，相应的二或四氢四吡咯羧酸，四吡咯羧酸与氨基-一或二羧酸的一、二或多酰胺，以及它们的盐。
文档编号A61P19/02GK1099613SQ9410495
公开日1995年3月8日 申请日期1994年4月21日 优先权日1993年4月22日
发明者会泽胜夫, 黑岩友佳力 申请人:日本石油化学株式会社