专利名称：：含有布氏疏螺旋体ospg的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及源于布氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)的新抗原及其衍生物、制备它们的方法、其在人体和动物医学和诊断中的应用和含有它们的药物组合物。具体地说，本发明提供了一种布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)的新的多形态脂蛋白-OspG的克隆表达。OspG以前被人们认为是1p77。推断出的这一蛋白的氨基酸序列与其它已知的疏螺旋体抗原，如OspA、OspB、OspC、OspD、OspE、OspF和P27相比没有明显同源性。这些外层表面蛋白与OspG有41％-65％的相似性(表1)。莱姆病(Lymedisease)是温热气候下最常见的、由媒介动物传播的传染性疾病，其病原螺旋体中的布氏疏螺旋体造成人体多个系统的疾病，会影响皮肤、神经系统、关节和心脏(8，44)。从不同的生物学来源和地理区域中分离到的布氏疏螺旋体菌株具异源性(2，19，38，45，50)，人们认为疾病表现类型是受螺旋体株抗原的差异影响的。尽管最近已有报道有人尝试用免疫学或分子标准对布氏疏螺旋体进行分类，但布氏疏螺旋体的分类仍然是一个有争议而又活跃的研究领域。到目前为止，已有各种布氏疏螺旋体的抗原，如外层表面蛋白A(OspA)、OspB、PC和p100，被应用于血清学诊断和作为将来研制疫苗的选择(13，14，36，38，40，41)。然而由于它们明显的异质性，因而仍然缺少明确的尺度，以判断种特异性诊断标准的形成和研制一种多肽疫苗，使之能产生抗各亚种的保护作用。本发明的发明者从布氏疏螺旋体中进一步发现了一种脂蛋白，称为OspG。该分子的特征为表观分子量约22KDa，等电点PI＝5.2以及含有196个氨基酸。成熟蛋白的进一步特征为在OspG的氨基末端部分有一个约20个氨基酸的大的疏水性功能域。这一N-末端肽对应于典型原核生物脂蛋白前体的前导信号肽。疏水核心的羧基端是一个可能被布氏疏螺旋体信号肽酶所识别的切割位点。OspG中这一可能的切割位点位于19位丝氨酸和20位的半胱氨酸之间，OspG切割位点附近的序列为L-l-l-S-C。与OspA、B、C、D、E、F和P27的基因不同，OspG基因天然地位于布氏疏螺旋体ZS7的55Kb质粒上。还注意到OspG探针与45Kb的质粒有弱的交叉反应。OspG的氨基酸序列大致如图1所示。其进一步的特点为只在感染期间表达，而在体外培养的布氏疏螺旋体中检测不到。因此，本发明提供了从布氏疏螺旋体中得到的一种分离蛋白，其特征为采用双向SDS凝胶电泳所测定的分子量在20-22KDa之间，以及等电点在4.9-5.4之间。本发明的发明者还提供了一种蛋白，或者是免疫学上或抗体上相当的片段或其衍生物，它们与图1所示的氨基酸序列至少有80％的同源性。这一蛋白和其相应的DNA和RNA序列在疫苗和诊断方面都有用途。本发明优选提供了与图1所描述的蛋白质至少具85％同源性的一种蛋白，更优选的为90％的同源性而最优选的为至少具95％同源性。本发明的蛋白质可以是一种融合蛋白，这种情况下，其特征为它含有其氨基酸序列或其片段的一部分。优选这一部分与图1的蛋白序列相比，至少有80％的同源性，较优选的为85％，更优选为90％，而最优选为95％的同源性。优选的蛋白质纯度，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定至少在70％，最优选为80％，较为优选的纯度至少在90％以上。本发明的蛋白质可以是脂蛋白或者制备成不带脂的蛋白质。当用重组技术制备时，脂蛋白会同信号序列一起表达。切除信号序列，去掉N末端的19个氨基酸就形成了非脂化的分子。免疫印迹分析显示OspG能被预先用完整螺旋体感染过的小鼠血清所识别。这一分析结果表明这种天然蛋白质具免疫原性。本发明的发明者进一步鉴定和测定了OspG基因的序列。因此，本发明提供了编码OspG蛋白或其片段或衍生物的DNA序列。优选的DNA序列大致如图1所示。此处所用“大致”一词是指与图1序列至少有70％相同，优选为80％相同，更优选为85％以上，最优选为至少95％以上相同。特别地，本发明提供了与图1序列大致相同的DNA序列，或其片段，或者能与所述序列杂交并编码能显示OspG抗原性的一种蛋白质的DNA序列。本发明的DNA可以通过DNA的酶促聚合反应进行制备，可以在体外合适的缓冲溶液中用DNA聚合酶，如DNA聚合酶I(Klenow片段)来进行。缓冲溶液含所需的核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dTTP，温度10°-37℃，通常体积为50μl或小于50μl。DNA片段的酶促连接可以用DNA连接酶，如T4DNA连接酶，在适当的缓冲液中，如含0.05MTris(pH7.4)，0.01MMgCl2，0.01M二硫苏糖醇、1mM亚精胺、1mMATP和0.1mg/ml牛血清白蛋白的缓冲液中进行，在4℃环境温度下反应，通常反应体积为50μl或少于50μl。DNA聚合物或片段的化学合成可以通过常规的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学方法进行，采用固相技术，如“基因片段的化学和酶促合成—实验室手册”(ChemicalandEnzymaticSynthesisofGeneFragments—ALaboratoryManual)(H.G.Gassen和A.Lang编，VerlagChemie，Weinheim，1982)所描述的方法，或见于其它的科学文献，如M.J.Gait，H.W.D.Matthes，M.Singh，B.S.Sproat和R.C.Titmas的“核酸研究”(NucleicAcidsResearch)，1982，10，6243；B.S.Sproat和W.Bannwarth的“四面体快报”(TetrahedronLetters)，1983，24，5771；M.D.Matteucci和M.H.Caruthers的“四面体快报”(TetrahedronLetters)，1980，21，719；M.D.Matteucci和M.H.Caruthers“美国化学协会杂志”(JournaloftheAmericanChemicalSociety)，1981，103，3185；S.P.Adams等的“美国化学协会杂志”(JournaloftheAmericanChemicalSociety)，1983，105，661；N.D.Sinha，J.Biernat，J.McMannus和H.Koester的“核酸研究”(NucleicAcidsResearch)，1984，12，4539；和H.W.D.Matthes等的“欧洲分子生物学协会杂志”(EMBOJoumal)，1984，3，801。另一种方法是用已知的技术(如mRNA逆转录产生互补的cDNA链)从布氏疏螺旋体mRNA和可购得的商品cDNA试剂盒获得所述编码序列。本发明并不限于所公开的特定序列，而是包含了上面所述的编码该蛋白或其具有免疫原性的衍生物的所有分子。编码本发明蛋白质突变体的DNA聚合物可以通过对编码该蛋白质的cDNA进行定点诱变的常规方法来制备。该方法披露于G.Winter等的“自然”(Nature)1982，299，756-758或Zoller和Smith1982的“核酸研究”(Nucl.AcidsRes.)，10，6487-6500。或者通过缺失诱变的方法制备，如由Chan和Smith在“核酸研究”(Nucl.AcidsRes.)，1984，12，2407-2419或Winter等在“生物化学协会学报”(Biochem.Soc.Trans.)，1984，12，224-225中的描述。一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括下列步骤i)制备一种可复制的或整合一种表达载体，该载体能在宿主细胞中表达一个DNA聚合物，其中含有一段编码所述OspG蛋白质或其具有免疫原性的衍生物的核苷酸序列；ii)用所述载体转化宿主细胞；iii)在所述DNA聚合物能够表达产生所述蛋白质的条件下，培养所述的转化后的宿主细胞；以及iv)回收所述蛋白。“转化”一词在此指用一种适当的质粒或病毒载体，将外源DNA以转化、转染或感染的方式导入宿主细胞。例如，用常规的方法，见“遗传工程”(GeneticEngineering)的描述(S.M.Kingsman和A.J.Kingsman编，英国牛津BlackwellScientificPublications出版，1988)。“经转化的”或“转化子”以下用于指含有并表达所需外源基因的所得的宿主细胞。表达载体新颖，也构成了本发明的一部分。可复制的表达载体可按本发明的方法进行制备。通过切开与宿主细胞相容的载体，形成带有完整复制子的线性DNA片段，并且与一个或多个DNA分子结合。这些DNA分子与所述能编码所需产物的线性片段结合，如编码OspG蛋白的DNA聚合物或其片段在连接条件下连接。这样，DNA聚合物就可以在载体构建中按需要进行制备或合成。载体的选择一部分取决于宿主细胞，这些宿主细胞可以是原核或真核生物。合适的载体包括质粒、噬菌体、粘粒和重组病毒。可复制的表达载体的制备可以通过常规的方法，用适当的酶进行DNA的限制性酶切、聚合反应和连接。例如按上面所引用的Maniatis等的方法进行。按照本发明，重组宿主细胞的制备是在转化条件下，用本发明中可复制的表达载体转化宿主细胞而实现的。合适的转化条件为常规条件，如见上述所引用的Maniatis等描述的方法，或“DNA克隆”(DNACloning)(Vol.II，D.M.Glover编，IRL出版公司，1985)。转化条件的选择取决于宿主细胞。对细菌宿主，如大肠杆菌(E.coli)可以用CaCl2溶液进行处理(Cohen等，“美国全国科学院学报”(Proc.Nat.Acad.Sci.)，1973，69，2110)或用含RbCl、MnCl2、乙酸钾和甘油的混合液处理，然后再用3-[N-吗啉代]-丙烷-磺酸、RbCl和甘油处理。培养的哺乳动物细胞可以通过钙共沉淀法将载体DNA转化到细胞上。本发明还扩展到用本发明的可复制的表达载体转化的一种宿主细胞。在所述DNA聚合物能够表达的条件下，培养转化了的宿主细胞，方法按常规的，如Maniatis等所述或上述所引用的“DNA克隆”(DNACloing)中的方法进行。这样，优选为给细胞提供营养物质，并在45℃以下培养。产物的回收是根据宿主细胞而按常规方法进行。当宿主细胞为细菌时，如大肠杆菌，可以用化学或酶法裂解，并将蛋白质产物从所得的裂解液或上清液中分离出来。当宿主细胞是哺乳动物细胞时，产物通常可以从营养培养基或不含细胞的抽提物中分离出来。常规的蛋白质分离技术包括选择性沉淀、吸收层析和包括单克隆抗体亲和柱在内的亲和层析。另一种方法是，表达可以用一种合适的载体，如杆状病毒，在昆虫细胞中进行。在本发明的一个特殊方面，所述蛋白质在鳞翅目昆虫细胞中表达，以便产生具免疫原性的多肽。对于在鳞翅目昆虫细胞中蛋白质的表达，优选为使用杆状病毒表达系统。在这种系统中，含有蛋白质编码序列、并有效连接到杆状病毒启动子上的表达盒，典型地位于穿梭载体内。这种载体含有足够数量的细菌DNA，能在大肠杆菌或其它合适的原核生物宿主中增殖穿梭载体。这种穿梭载体也含有足够量的杆状病毒DNA，位于所需的蛋白编码序列旁侧，使野生型杆状病毒和异源基因之间能进行重组。重组的载体然后与野生型杆状病毒DNA一起，通过共转染进入鳞翅目昆虫细胞。接着对由同源重组产生的重组杆状病毒按标准方法进行选择和噬斑纯化。见Summers等“德克萨斯农业实验站公报”(TexasAgriculturalExperimentalStationBulletin，TAESBull)，NR1555，1987年5月。在昆虫细胞中表达环子孢子蛋白(CS)的方法详细描述在SmithKlineRIT(WO/US89/05550)的USSN287,934中。在昆虫细胞中进行制备也可以通过感染昆虫幼虫的方法而实现。例如，可以在烟芽夜蛾(Heliothisvirescens)的幼虫中获取这种蛋白，即用本发明的重组杆状病毒和微量的野生型杆状病毒一起喂饲幼虫，约2天后从血淋巴中提取该蛋白。如见Miller等的PCT/WO88/02030。本发明的新的蛋白质也可以在酵母细胞中表达，如同在EP-A-0278941中CS蛋白的表达一样。本发明也涉及到包含OspG或其片段或衍生物的疫苗组合物。本发明的疫苗可以直接用蛋白质的水溶液。或者，经冷冻干燥或未经冷冻干燥的蛋白质，与任何已知的佐剂混合或用佐剂吸收。这些佐剂包括、但不限于氢氧化铝、胞壁酰二肽和皂苷(如QuilA)。特别优选的佐剂为单磷酰脂A(MPL)(monophosphoryllipidA)和3-脱-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)(3De-O-acylatedmonophosphoryllipidA)。优选的佐剂还有QS21。3D-MPL可从Ribi免疫化学公司得到或按英国专利No.2220211所公开的方法制得；QS21可从剑桥生物技术公司得到或按美国专利No.5,057,540所公开方法制得。作为另一种范例的方法是将蛋白质装入微颗粒，如脂质体的胶囊中，或者在水乳剂中与油混合。还有另一种作为例证的方法是将蛋白质缀合到一种具免疫刺激性的大分子上，如灭活的包特菌(Bordetella)或破伤风类毒素。在本发明的优选实施例中，本发明的抗原包含其它疏螺旋体的抗原，特别是OspA。本发明的蛋白质可以用活载体，如卡价菌(BCG)、李斯特菌(Listeria)或沙门氏菌(Salmonella)来表达，并用这些载体制成活疫苗。疫苗的制备基本描述在“疫苗新的趋势和研制”(NewTrendsandDevelopmentsinVaccines，Voller等编，马里兰巴尔的摩UniversityParkPress出版，1978)。装入脂质体胶囊的方法描述见Fullerton的美国专利4,235,877。蛋白质缀合到大分子上的描述见Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757。QuilA的使用见Dalsgaard等在“斯堪的纳维亚兽医学报“(ActaVetScand)，18349(1977)中的描述。在每一疫苗剂量中，本发明蛋白质的含量是根据在典型疫苗中该含量能诱导免疫保护反应，但又无明显的不利副作用而选定的。这一量的不同取决于所采用的特定免疫原和这一疫苗是否与佐剂结合。通常每一剂量中含1-1000μg的蛋白质，优选为1-200μg。对某一特定疫苗的最适量可以通过标准方法，包括观察抗体滴度和实验对象的其它反应来确定。在初始接种疫苗之后，可以对实验对象再施用疫苗以增强其免疫反应。本发明也涉及抗体，优选为针对OspG特异的单克隆抗体。这种单克隆抗体可用于莱姆病的诊断和预防。在另一个实施例中，本发明提供一种含有OspG抗原的诊断试剂盒。1材料和方法1.1疏螺旋体(Borrelia)菌株本研究中所用的布氏疏螺旋体(B.Burgdorferi)菌株描述在其它文献(45)中。将疏螺旋体在33℃下生长于改进的Barbour-Stoenner-KellyII(BSKII)培养基上。4℃下10,000g离心20分钟收获螺旋体，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两遍，在暗视野显微镜下计数。制备和筛选布氏疏螺旋体的表达文库布氏疏螺旋体ZS7株基因组DNA的制备是用溶菌酶/SDS方法，DNA片段通过超声波处理而产生。用衔接头克隆法(7，31)将平末端DNA插入pUEX1载体。连接后的DNA转化到大肠杆菌MC1061中，然后用取自DBA/2小鼠的免疫血清进行表达筛选，小鼠预先已接种过104个(或少于此数)的布氏疏螺旋体(ZS7)细菌。1.2DNA印迹杂交按前述方法(32)，从疏螺旋体生物中提取总基因组DNA。将约5μgDNA用100U的限制性内切酶(HindIII)进行消化，按生产厂家(Boehringer，Mannheim)推荐的方法进行。样品用0.7％的琼脂糖凝胶电泳。把DNA片段转移到HybondTM-N尼龙膜(Amersham)上，然后进行紫外交联和杂交。简要地说，即65℃下在含0.5MNaHPO4/7％NaDodSO4，pH7.2溶液中用32P标记的探针杂交过夜。室温下在40nMNaHPO4/1％NaDodSO4，pH7.2中洗膜30分钟，干燥后的膜在用增感屏条件下用柯达XAR-5胶片于-80℃放射自显影1-12小时。杂交探针是用含LA7编码区的500bp的DNA片段。所需的基因片段用低熔点琼脂糖凝胶回收，用乙醇处理使其沉淀，并用上述的随机引物反应进行放射性标记。1.5凝胶电泳按照Laemmli(21)的方法，在单向SDS/PAGE板凝胶上进行电泳，从每份裂解液取40μl(约相当于108生物体)同10μl5×的还原性样品缓冲液混合。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳按O′Farrel(29)所述方法进行，在第一向电泳中用等电聚焦(Pharmacia/LKB两性电解质1.45％pH3.5-10，0.1％pH2.5-4.0，0.2％pH4-6，0.2％pH9-11)。取与单向凝胶电泳相同量的裂解液进行电泳。凝胶用银染色或进行蛋白质印迹(15)。表面蛋白酶解按Barbour等的方法(20)，用蛋白酶K(Boehringer，Mannheim，德国)进行处理。然后用SDS-PAGE分离蛋白质，各抗原用免疫印迹进行鉴定。1.6蛋白质印迹(Westernblotting)双向SDS-PAGE电泳后，按生产厂家的推荐，在半干燥的电印迹盒(BIO-RAD，德国慕尼黑)中，将蛋白质以恒定的电流(60mA)在HybondC硝酸纤维素膜(Amersham)上电印迹1小时。在封闭缓冲液(50mMTris-HCl，150mMNaCl，5％脱脂干奶)中温育过夜后，将免疫印迹置于含1∶100(v/v)稀释的小鼠和人抗血清的50mMTris-HCl、150mMNaCl、1％干奶、0.2％Tween20的溶液或小鼠单克隆抗体(LA7)培养物上清中，室温下保温2小时。硝酸纤维素滤膜在稀释缓冲液中洗5次，再与碱性磷酸酶缀合的羊抗兔抗血清(德国汉堡，Dianova，1∶400v/v)一起温育1小时。印迹在上述缓冲液中洗4遍，再在TBS中洗2遍，然后加入20mlDEA缓冲液，其中补充了5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP，Sigma；165μg/ml)和氮蓝四唑(NBT，Sigma；330μg/ml)作为底物，使免疫反应带显色。在50mMTris-HCl，150mMNaCl、5mMEDTA中洗膜以终止反应。1.7DNA序列克隆到pUEX1质粒(Amersham)的布氏疏螺旋体基因组DNA片段，用T7测序试剂盒(Pharmacia)，按照厂家推荐方法测序。1.8氨基酸序列分析用HUSAR软件同时进行蛋白质序列对比和系统树的构建。1.9免疫荧光将布氏疏螺旋体在PBS中洗两遍，转到粘附玻片上(德国BadMergentheim，Superior)(1×105螺旋体/反应区)，用无水酒精(2分钟，-20℃)固定并风干。固定的螺旋体与各稀释后的单抗温育，螺旋体再在异硫氰荧光素湿盒中保温30分钟。在PBS中洗三遍后，用荧光显微镜镜检，并用400ASA的黑白胶卷(HP5；英国Illford)拍摄记录。1.10免疫荧光将布氏疏螺旋体在PBS中洗两遍，转到粘附玻片上(德国BadMergentheim，Superior)(105螺旋体/每反应区)，用无水酒精固定(2分钟，-20℃)，风干。固定的螺旋体与在PBS中稀释的单抗一起在湿盒中温育30分钟。用PBS洗三遍后，将螺旋体与异硫氰荧光素标记的羊抗小鼠免疫球蛋白抗血清(Medac，德国汉堡)一起，在暗的湿盒中温育30分钟。经PBS中三次洗涤，将制备物在荧光显微镜下镜检，并用400ASA的黑白胶卷(HP5；英国Illford)照相记录。ELISA布氏疏螺旋体特异性抗体的测定采用如前面所述方法(15)，在固相ELISA系统中用布氏疏螺旋体B31抗原进行测定。2.1一部分ospG基因的PCR扩增缺少编码疏水性前导肽的ospG基因，用寡核苷酸引物5′-GTGGATCCAAGATTGATGCGAGTAGTG-3′(对应于第61位至79位核苷酸)和5′-GTGAATTCTATTTTTTATCTTCTATATTTTGAGGCTCTG-3′(对应于第560位至590位核苷酸)进行PCR扩增。pZS7质粒DNA在DNA热循环仪(Bio-Med60)上进行30个循环的PCR扩增。变性用94℃60秒，退火48℃90秒，延伸72℃90秒。扩增后片段经BamHI和EcoRI消化，连接到谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的框架并转入pGEX-2T载体，将其用于转化DH5α宿主细胞。2.2重组OspG的表达和纯化在大肠杆菌DH5α菌株中表达谷胱甘肽S-转移酶-OspG融合蛋白。亲和纯化和用内切蛋白酶凝血酶酶切融合蛋白的方法，均按生产厂家(Pharmacia)的推荐方法进行。2.3[3H]棕榈酸标记和TritonX-100相分配将用带有截短的全长ospG基因(pOspG)的质粒(pZS77)转化后的大肠杆菌，培养在含有[9，10-(n)-3H]棕榈酸(比活≈50Ci/mmol，Amersham)的培养液中。放射性标记的脂蛋白按前述方法(46)用TritonX-114相分配法提取。2.4免疫血清的生成和血清学免疫血清取自小鼠，它们事先在尾巴中接种108(C.B-17；免疫血清(IS)抗-108)或103(DBA/2；免疫血清抗-103)活的布氏疏螺旋体ZS7株，或者先用5-10μg脂化的OspA(lipOspA)(BALB/c；免疫血清抗lipOspA)或含佐剂(ABMZ；德国AidenbachSebac)的重组(rec)recOspG(BALB/c，免疫血清抗-recOspG)皮下注射(s.c.)，10-20天后再加强剂量。所有血清如前所述用ELISA法对总的螺旋体裂解液(B.bIg)或重组OspA(OspAIg)或重组OspG(OspGIg)中的螺旋体特异性免疫球蛋白的(Ig)的量进行分析。2.5保护实验重度联合免缺陷病(SCID)小鼠不经处理，或用正常小鼠血清(NMS)或混合免疫血清(IS)重建。用个体IS转移的螺旋体特异性免疫球蛋白(IG)的量(ELISA测定总布氏螺旋体细胞裂解液)如下IS抗-108，4.4μgIg/小鼠；IS抗-103，4.5μg/小鼠；IS抗-lipOspA，5μg/小鼠；IS抗-重组OspG(recOspG)，72ng/小鼠。当对recOspG试验时，IS抗-recOspG中特异性Ig量比IS抗-103中约高10-20倍。腹膜注射(i.p.)IS，一小时以后用105螺旋体(布氏螺旋体ZS7株)皮下注射感染接受IS的小鼠。观察小鼠在蒙敝条件下其临床关节炎的发病，和按前面所述(37，40)的BSK培养基上培养耳的活组织方法观察螺旋体的存在。2.6病理学胫跗关节部位关节炎的发病在如前所述(37，40)的蒙敝条件下进行监测。分级标准如下，++严重；+较严重；(+)中度；+/-，轻度肿胀；(+/-)微红肿；-无关节炎临床症状。结果OspG的克隆和重组结构的分析布氏疏螺旋体菌株ZS7的基因组DNA表达文库，用事先感染103螺旋体(IS抗-103)的小鼠免疫血清进行筛选。这一IS以前显示出缺少对OspA和OspB的抗体，但能在SCID小鼠中保护其免受后来的感染(35)。而且，这一IS在免疫印迹试验中，能识别4种不同的相对分子量19-20KDa的蛋白质，和2种分子量约40KDa的蛋白质。这些蛋白来自ZS7株全细胞裂解液，通过双向凝胶电泳进行分离。鉴定了约20个克隆，其中一个定名为pZS77的具有特殊的反应性。对这一重组的pZS77质粒进行限制性酶切分析、亚克隆和测序。ospG的核苷酸序列及推断的OspG的氨基酸序列如图1所示。共有的核糖体结合位点(GGAG)位于ospG基因的ATG起始密码子上游10bp的位置。这一翻译起始序列的再上游是-70至-64位的-10区(TATATT)和-105至-100位的-35区(TTGTTA)。位于-118至-49位的这一上游区含有2个短的反向重复序列ATATTT和TTACATTT。在+1位的ospG基因的ATG起始密码子后，是一个588个核苷酸的可读框，对应于196个氨基酸的蛋白质，其计算的分子量为22,049Da。确定在620位和656位之间可能有一个不依赖于ρ的终止子。将ospG基因的ATG起始密码子上游的DNA序列，与最近报导的ospE-ospF操纵子的启动子区序列比较，用GAP公式计算的相似性为94％。还发现ospG启动子含有2个高度保守的八聚体DNA基序ATGTATTT(在-187位至-180位)和AATTACAT(在-120位至-113位)，这两个基序以前的研究表明是与称为MATα2的负调节分子的蛋白结合位点有关，以及在酵母分化过程中调节基因表达(5，25)。这两个基序在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的两个基因MFα2和BAR1中分别得到了鉴定，并且它们还包含了与免疫球蛋白八聚体基序ATTTGCAT相似的不完整反向重复基序。最有趣的是，在两个类酿酒酵母基序之间，还含有免疫球蛋白八聚体的类似序列ATTTGCAA(位于-154至-147之间)，它与免疫球蛋白八聚体基序的差别仅仅为一个碱基的转换替代。OspG氨基酸序列分析OspG的亲水性分布图提示这一蛋白质主要为亲水性，但在氨基末端部分有一个约20个氨基酸的疏水区域。这一N末端区表现出与典型原核生物脂蛋白中前导信号肽有相似性(51，52)。在信号序列的羧基末端是一个推定的信号肽酶II识别基序Leu-X-Y-Cys(图3a)。OspG中潜在的切割位点位于第19位的丝氨酸和第20位的半胱氨酸之间。计算出的等电点PI＝5.2。将OspG的氨基酸序列与所有已知的布氏疏螺旋体的外层表面蛋白OspA-OspF和P27比较，结果显示OspG与OspF同源性最高(65％)(表1)。而且，OspG的基本N-末端肽基序M-N-K-K-M与OspE和OspF中观察到的一致。OspG作图几种布氏疏螺旋体株的质粒和染色体DNA通过脉冲电场凝胶电泳进行分离，并与ospA和ospG特异性探针杂交。我们估算德国布氏疏螺旋体的分离株ZS7中含有ospA的质粒大小为53Kb。由于在凝胶上所加的DNA量少，ACA-1菌株中含ospA的质粒电泳后勉强可见，但延长曝光时间后可以看出来(数据未显示)。用ospG探针看到一条明显的带，约为48Kb的线性质粒，还有一条较弱的带为ZS7株45Kb的质粒。与之形成对照的是，在美国B31菌株中，大小为45Kb和约35Kb的两个质粒与ospG基因探针杂交。还发现当采用嘎氏疏螺旋体(B.garinii)ZQ1株、20047株和日本疏螺旋体(B.japonica)HO14株时，未观察到杂交现象。在对照实验中，用来自ZS7株的ospE-ospF探针进行测定，以观察用这些基因组DNA时是否能观察到不同的带。这一实验表明了ZS7、B31、20047和21038株含45Kb和35Kb的两种质粒。从其它种的疏螺旋体，如革质疏螺旋体(B.coriaceae)Co53、美西部回归热赫氏疏螺旋体(B.hermsii)、特里蜱疏螺旋体(B.turicatae)和从梅毒密螺旋体(Treponemapallidum)分离的DNA不与ospG探针杂交，表明了ospG对布氏疏螺旋体的特异性。ospG基因的限制性片段长度多态性(RFLP)用核酸内切酶HindIII对ospG进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析，结果显示，在所试验的20个布氏疏螺旋体的分离株中至少有7种不同的杂交带型大多数狭义上的布氏疏螺旋体分离株的特征是含有1.8Kb和3.8Kb的两个杂交片段(图6，1泳道)；所试的6个嘎氏疏螺旋体分离株中的3株不与ospG探针杂交，而嘎氏疏螺旋体20047株和S90株分别出现1.8Kb片段和1.7、3Kb片段(数据未显示)；在阿氏疏螺旋体的菌株中，至少可观察到三种不同的杂交型ACA-1(电泳泳道3)菌株有一条2.4Kb的带，MMS菌株(电泳泳道4)有1.9和2Kb的两条带，NE40菌株(电泳泳道5)有2kb和5kb的带。大肠杆菌中OspG重组蛋白的表达为了用PCR扩增OspG，引物选择是根据这样一条原则即使得最终的重组产物缺少组成前导肽的20个氨基酸残基(46)。扩增后的OspG编码产物插入表达载体pGEX-2T(Pharmacia，德国Freiburg)的载体蛋白框架中，经过异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，得到约44KDa的GST-OspG融合蛋白。采用谷胱甘肽-琼脂糖小珠，然后用位点特异性蛋白酶消化结合态的GST-OspG融合蛋白的方法，从大肠杆菌裂解液中富集GST-OspG融合蛋白。[3H]棕榈酸标记为测定OspG在大肠杆菌DH5α株中是否表达为脂蛋白，将细胞用pZS77或pOspG质粒进行转化，并用[3H]棕榈酸标记(图8)。质粒pZS77编码带有正常N末端信号序列的OspG前体蛋白的全长，而pOspG编码的蛋白质，其OspG前体的前面21个残基被Met-Lys序列所替代。经过除垢剂-相分配抽提和用SDS-PAGE分离，放射性产物通过荧光显影而显现。含有ospG基因(pZS77质粒)全长的大肠杆菌细胞表达20kDa的脂蛋白，该脂蛋白分配到除垢剂相中。而在含有截短的ospG基因的DH5α细胞中观察不到脂蛋白。OspG的亚细胞定位为确定OspG在完整生物体中的亚细胞定位，用蛋白酶K处理螺旋体。随后用免疫印迹进行分析。所用的抗-103血清为用于从表达文库中分离ospG的血清。抗-103免疫血清检测到4种低分子量的蛋白质，它们经蛋白酶解后部分消失，而分子量约为40kDa的两种结构不受蛋白酶处理的影响(17)。用蛋白质印迹测定rOspG是否被抗-103血清所识别。rOspG吸收抗-103血清后，能识别同样大小的一些主要蛋白质(图7A)，这一结果提示在体外培养的ZS7菌株裂解液所含的低分子量蛋白质中可能没有OspG，或者发生了OspG的蛋白酶解。为了证实OspG的身份以及它是否能够在体外培养的布氏疏螺旋体ZS7菌株中表达，超免疫的鼠抗-rOspG血清不能从109的体外培养的ZS7菌株中检测到OspG。在一些实验中，可以观察到40KDa多肽具有意想不到的弱活性，这可能是OspG的变体或表明了与OspG有一些共同抗原表位的布氏疏螺旋体的蛋白质。为测定从体外培养的布氏疏螺旋体ZS7菌株中ospG基因的表达，将总RNA分离出来，并用RNA印迹杂交法分析ospG转录物的存在。用ospA基因探针检测硝酸纤维素膜，作为体外表达和RNA降解的对照。与ospA探针能与单个约2kb的转录物相结合形成对照的是，ospG探针检测不到ospG转录产物。这些结果提示，体外培养中OspG的表达缺陷似乎是因ospG在转录水平的mRNA稳定性所致。在体外培养的布氏疏螺旋体ZS7菌株的裂解液中，OspG是检测不到的，而在哺乳动物宿主的生长过程中，OspG表达可能有差异。用代表性的莱姆病患者和实验感染的小鼠的血清样品进行免疫印迹分析，结果表明其中出现对OspG特异性的抗体。从已证实的莱姆疏螺旋体病患者13个血清标本中，发现其中6个含有抗-OspG的抗体。相反，所有健康的献血者(n＝8)的血清中都不含有识别rOspG的抗体(数据未显示)。这些发现提示了OspG只在感染过程中表达。用抗-OspG免疫血清部分地保护SCID小鼠为测定抗-OspG免疫血清的保护能力，用以下量的、来自混合免疫血清(IS)制备物的布氏疏螺旋体的特异性免疫球蛋白(Ig)处理SCID小鼠C.B-17IS抗-108(4.4μgB.bIg/小鼠)，DBA/2IS抗-103(4.5μgB.bIg/小鼠)，BALB/cIS抗-lipOspA(5μgB.bIg/小鼠)和BALB/cIS抗-recOspG(72ngB.bIg/小鼠)。但抗-recOspG免疫血清与抗-103免疫血清相比，所含的抗-recOspG抗体量前者比后者多10倍以上。SCID小鼠用所述任何一种IS腹膜内注射，随后用105量的布氏疏螺旋体进行感染试验。观察临床关节炎的发病和耳组织活检中螺旋体的出现。接种了螺旋体而未作其它处理的或NMS(正常小鼠血清)-处理的SCID小鼠，从感染后第6天起出现关节炎，而到第13天至第24天(终止时间)，胫跗关节出现严重的肿胀。如前所述，用抗-108或抗-103和抗lipOspA免疫血清被动免疫的SCID小鼠，不出现或只出现轻微的临床关节炎的症状。而与之对照的用抗-recOspG被动免疫的SCID小鼠，根据其在第6天至第18天出现的轻度肿胀，表明只是推迟了关节炎的发病。在晚些时候，这些小鼠出现了更加严重的关节炎症状，表明了这一免疫血清与其它免疫血清相比控制感染的效果较差。抗recOspG免疫血清比抗-103免疫血清所含的针对recOspG的抗体多10倍以上，但保护作用却差得多，这表明在抗-103免疫血清中，另有专一性物质在控制感染中发挥着作用。表1布氏疏螺旋体外层表面脂蛋白</tables>表2未注射免疫血清或用所指的免疫血清预先腹膜注射后再接种1×105布氏疏螺旋体ZS7菌株的SCID小鼠临床关节炎的发病情况o评定标准++严重；+较严重；(+)中度；±轻度肿胀；(±)微红肿；-左右胫跗关节无临床症状。*mAB前面有描述(20，35，39)参考文献1.Aron，L.，M.Alekshun，L.Perlee，I.Schwartz，H.P.Godfrey和F.C.Cabello.1994。“bmpC-一个编码布氏疏螺旋体的潜在膜脂蛋白基因的克隆和DNA序列分析”(CloningandDNAsequenceanalysisofbmpC，ageneencodingapotentialmembraneliproproteinofBorreliaburgdorferi)。“欧洲微生物学会联合会微生物学快报”(FEMSMicrobiol.Lett.)12375-82。2.Barbour，A.G.，S.L.Tessier和S.F.Hayes.1984。“莱姆病螺旋体主要表面蛋白的变异”(VariationinamajorsurfaceproteinofLymediseasespirochetes)。“感染与免疫”(Infect.Immun.)4594-100。3.Barbour，A.G.和H.G.Stoenner.1985。“美西部回归热赫氏疏螺旋体抗原的变异”(AntigenicvariationofBorreliahermsii)。“加州洛杉矶大学分子细胞生物学新系列论文集”(UCLASymp.Molcell.Biol.NewSer.)20123-125。4.Bergstrom，S.，V.G.Bundoc和A.G.Barbour.1989。“莱姆病螺旋体布氏疏螺旋体的线性质粒编码的主要表面蛋白OspA和OspB的分子分析”(Molecularanalysisoflinearplasmid-encodedmajorsurfaceproteins，OspAandOspB，oftheLymediseasespirochaeteBorreliaburgdorferi)。“分子微生物学”(Mol.Microbiol.)3479-486。5.Borst，P和D.R.Greaves.1987。“改变基因表达的程序性基因重排”(Programmedgenerearrangementsalteringgeneexpression)。“科学”(Science)235658-667。6.Brandt，M.E.，B.S.Riley，J.D.Radolf和M.V.Norgard.1990。“布氏疏螺旋体的免疫原性的整合膜蛋白为脂蛋白”(ImmunogenicintegralmembraneproteinsofBorreliaburgdorferiarelipoproteins)。“感染与免疫”(Infect.Immun.)58983-991。7.Bressan，G.M.和K.K.Stanley.1987。“相关于pEX具广泛宿主特异性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