专利名称：以栾树提取物为有效组分的抗癌药物及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种以栾树提取物为有效总成分的抗癌药，以及该药物的制备方法；本发明还涉及从栾树中提取的抗癌有效部位，以及该有效部位的提取方法。
无患子科栾树属(Koelreuteria Laxm)植物，全世界共有4种，中国产3种，1个变种，另一种产于斐济群岛。落叶灌木至乔木，野生于山林或栽培于庭院。其中栾树(Koelreuteria paniculata Laxm)自西南、华南至华北、辽宁广有分布，台湾栾树(Koelreuteria henryiDummer)独产于台湾省，复羽叶栾树(Koelreuteria bipinnataFranch)产于广东、广西、华东和西南地区，俗名称为摇钱树。其中变种全缘叶栾树(Koelreuteria bipinnata var.integrifoliola(Merr)T.Chen)则常见于安徽、浙江等地。该植物资源丰富。
人们很早就发现该属植物具有一定的药用价值。《神农本草经》中记载其“主目痛，泪出伤眦，消目肿”；《唐本草》记载“和黄连共煎，疗目赤烂”，民间用来“疏风清热，解毒杀虫”。但是，有关该属植物的化学与生物活性研究，国内外均少报道。1070年Chirva，V.Ya.等从种子中分离到栾树皂甙A和B，并测定其化学结构为三萜皂甙(V.Ya.Chirva，P.K.Kintya，andV.A.sosnovski，Khim.Prir.soedin，6,328(1970))。1951年Carlson，H.J.等人发现栾树叶中含有没食子酸甲酯，对多种菌尤其是真菌有一定抑制作用(H.J.Carlson et al.Antibiotics andChemotheropy，vol.l，pp.431-442，1951；CA 1952，466188c)。1985年陈国联等进一步证实了该植物叶的提取物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和变形杆菌具有一定的抑制作用，但未见有效成分的报道(《陕西中医》1985，6(3)144)。1991年日本人hutano，T.等报告在栾树中发现了对黄嘌呤氧化酶(XOD)自由基具有清除作用的没食子酰槲皮甙(Planta Medica，Vol.57(1)83-84，1991)。1993年Abou-Shoer.M.等从台湾栾树枝叶中分离到对与癌症有关的酪氨酸蛋白激酶(PTK)有抑制作用的黄酮类化合物(J.Nat.Prod.，56(6)967-969，1993)。1994年Song YN等从台湾栾树醇提取物的弱极性部位分离到3种体外对人肺癌(A-549)、人乳腺癌(MCF-7)和大肠腺癌(HT-29)等8种细胞株有细胞毒作用和微管聚合酶抑制作用的环木质素类化合物，与抗癌鬼臼毒素相近，但均属脂溶性的木质素类化合物，开发有限。但未见有关栾树乙酸乙酯提取部位YQE及纯化部位YQE1，YQE2和YQE3在体内对实验动物肿瘤有抑制作用的报道。
我们对该属植物进行了较为系统的研究，从中分离得到乙酸乙酯提取的具有多种生物活性的总有效部位，并进行了一系列药效学实验，证实该有效成分具有多种药理作用；我们将该有效部位制成了药物制剂。
因此，本发明目的是制备一种具有抗癌和免疫抑制作用、抗病毒作用、自由基清除作用和活血化瘀作用的药物。
本发明还提供了栾树提取物有效部位的分离方法以及本发明该药物的制备方法。
本发明药物的有效成分提取步骤如下1、取原料药材栾树的枝叶、花、果实加10-80％乙醇水溶液回流提取或浸泡渗漉提取，得提取液，减压浓缩蒸去醇得到本发明所说的提取液A；2、上述提取液A，依次用有机溶媒分别提取，得到不同的有效部位，如提取物A溶于水，过滤去杂质后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和丁醇提取，分别得到提取液B1(石油醚提取物)、提取液B2(二氯甲烷提取物)、提取液C(乙酸乙酯和丁醇提取物)、提取液D(水提取物)；
3、收集乙酸乙酯和丁醇提取液C液，减压浓缩至干，得到本发明所说的有效部位提取物YQ-E(本申请将此提取物命名为YQE)。
4、用溶媒对YQE进行萃取，得到本发明所说的纯化有效部位提取物(本申请将此提取物命名为YQE1和YQE2)。
5、YQE用色谱法进行柱层析纯化，得到本发明所说的纯化有效部位提取物(本申请将此提取物命名为YQE3)。
上述步骤1中所用的提取溶媒可以是水、或含有10-80％水的1-4碳醇、纯丙酮及其含有20-30％水的丙酮。
上述步骤2、4中的有机溶媒包括C6-C7的烷烃，如，己烷，环己烷，石油醚；卤化烃，如，二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷，四氯化碳；醚和有机酸的酯类，如，乙醚，乙酸乙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯；C3-C5的脂肪醇等。
上述步骤5中的色谱纯化包括大孔树脂、硅胶、氧化铝等吸附及分配色谱纯化。例如，先上D101大孔树脂后，用0-90％乙醇洗脱，收集30-50％洗脱液，浓缩至干，即得纯化部位YQE3。
本发明的纯化有效成分YQE1、YQE2、YQE3含有没食子酸乙酯、没食子酸及栾树多酚类化合物(polyphenols)，总体构成本发明的有效部位YQE。
可以以本发明的栾树提取物为有效成分，按照常规的制剂工艺制成临床上常用的药剂。该药剂含有0.01-99.9％重量份的所述栾树提取物，优选含有1-80％重量份的所述栾树提取物，最佳含有10-60％重量份的所述栾树提取物。
本发明的栾树提取物也可以与其他中药或提取物配伍组成复方药物，例如1、与活血化瘀药物共用，如，与选自下述一种或一种以上的中药配伍组成复方药物三七、红花、当归、丹参、赤芍、莪术、元胡、乳香、没药；2、与益气养血药物共用，如，与选自下述一种或一种以上的中药配伍组成复方药物人参、党参、黄芪、五味子；
3、与清热解毒药及抗肿瘤中草药共用，如，与选自下述一种或一种以上的中药配伍组成复方药物黄连、大黄、黄芩、山豆根、苦参、白花蛇舌草、半枝莲、半边莲、夏枯草；4、与软坚消瘤药共用，如，与选自下述一种或一种以上的中药配伍组成复方药物海藻、昆布等。
在上述单方或复方药物的制备过程中，根据剂型和临床使用的需要，可以加入各种赋性剂，例如，粘合剂、崩解剂、填充剂、湿润剂、溶剂、矫味剂、乳化剂、防腐剂等。
本发明所说的药物剂型，可以是片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、外用擦剂、透皮吸收制剂以及注射剂等。
本发明药物具有抗肿瘤作用、免疫抑制作用、抗病毒作用、自由基清除作用、抗血栓作用、抑制血小板聚集作用。
一、栾树提取物YQE2的抗肿瘤作用1、YQE2对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用材料和方法实验动物C57/BL小鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，中科动管会合格证005。
瘤种Lewis肺癌。
药物YQE2为淡黄色粉末，用DMSO，吐温-80及生理盐水配成混悬剂备用。
方法小鼠接种肿瘤后，随机分组，于次日开始腹腔注射治疗，连续给药10天，停药后次日解剖称重肿瘤重量，并与对照组小鼠比较，计算给药组肿瘤抑制率。
结果由表1、表2、表3中可以看到，YQE2在给药剂量70mg/kg时，对小鼠肿瘤抑制率在40％以上。
表1 YQE2对小鼠Lewis肺癌的抗肿瘤作用组别剂量 给药 动物数 体重(g) 瘤重 抑瘤率P值mg/kg 途径 开始 最后 开始 最后 X±SD(g) ％NS 0.2*i.p10 10 16.2 20.1 2.67±0.7----BYQE35 i.p8815.9 19.8 2.19±0.56 18.0＜0.001BYQE70 i.p8816.0 18.3 1.57±0.58 41.2＜0.01CTX 30 i.p8816.0 18.9 1.57±0.61 41.2＜0.01*ml/只结论实验结果表明YQE2，70mg/kg对小鼠Lewis肺癌有明显的抗肿瘤作用。
2、YQE对P388小鼠白血病细胞的体外抑制作用样品与瘤细胞作用24小时，以抑制率％表示，结果见表5。
表5摇钱树提取物部位对P388小鼠白血病细胞的体外抑制作用样品1000μg/ml 100μg/ml 10μg/mlBLS-I-32A 45.727.2 12.1BLS-I-32B 100 95.3 67.7BLS-I-32C(YQE)100 58.2 78.9BLS-I-32D 79.962.9 59.1结论栾树提取物部位B2、C(YQE)和D在10μg/ml浓度均能显著抑制P388小鼠白血病细胞的增殖，其中以C(YQE)为最佳。
二、栾树提取物对免疫功能的影响1、栾树花70％乙醇提取物(YQH)按照5倍稀释，最低浓度0.128ng/ml，最高浓度500ng/ml。其对人扁桃体单核细胞增殖的作用见图1，BYH在100μg/ml和500μg/ml浓度时有明显的抑制作用。
2、栾树枝叶提取物YQE(包括YQE1、YQE2或YQE3)按照二倍稀释法稀释，最低浓度为0.31μg/ml，最高浓度100μg/ml。其中，YQE1在6.25-100μg/ml浓度范围内对人扁桃体单核细胞增殖表现出较为明显的抑制增殖作用，YQE2在100μg/ml也表现出一定的抑制增殖趋势，见图2。
3、栾树枝叶提取部位(YQE)对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖的作用见图3。在100-500μg/ml浓度范围内表现出较为明显的抑制增殖作用。
4、栾树种子提取物(YQZ)对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖作用的影响见图4，在100-500μg/ml浓度范围亦表现出明显的抑制增殖作用。
综上所述，本发明的栾树提取物具有明显的免疫抑制作用。
三、抗病毒作用病毒是致癌因素之一，栾树提取物的有效部位对几种病毒有抑制作用，其乙酸乙酯提取部位YQE对疱疹病毒I和II型最低抑制浓度为0.062-0.50mg/ml。对HIV-RT酶的抑制作用，IC50为0.033-0.012mg/ml。此外，对鸦肝病毒也有一定的抑制作用，当提取物浓度在1.0-2.0mg/ml时其抑制率可达到74.6-42.6％。
四、自由基清除作用目前国际上自由基与癌及衰老关系密切的学说，已被广泛接受并应用于临床。在抗癌治疗中不仅抑制细胞的生长至关重要，同时保护正常细胞和组织不受损害也是至关重要的。栾树提取物在实验中对氧自由基和羟基自由基的清除作用很明显，其对超氧阴离子和羟基自由基清除的最低有效浓度分别为12ng/ml和1.7ng/ml。
五、活血化瘀作用祖国医学对癌症的治疗一般采用活血化瘀、清热解毒、软坚散结和扶正祛邪等治疗药物及其组方，并已经取得一定进展。许多研究表明活血化瘀中药对抗癌有增效作用[邓有安等，活血化瘀中药加抗癌药治疗急性白血病疗效观察，山西医药杂志，1988，17(2)，P79]，有研究表明其通过改善荷瘤鼠血液凝固状态和血小板功能可实现抗肿瘤血行转移[胡素坤，赤芍801抗肿瘤的试验研究，中国医药学报，1990，5(3)，P22]。本发明的栾树提取物具有明显的抑制ADP诱发的血小板凝聚作用，对激光致血栓有防止作用，因而提示其具有活血化瘀作用。
综上所述，栾树提取物及其药物制剂具有抗癌和免疫抑制作用、抗病毒作用、自由基清除作用以及抗血小板凝聚和抗血栓形成作用。
图1是栾树花70％乙醇提取物(YQH)对人扁桃体单核细胞增殖的作用。
图2是栾树枝叶提取物YQE对人扁桃体单核细胞增殖的作用。
图3是栾树枝叶提取部位(YQE)对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖的作用。
图4是栾树种子提取物(YQZ)对ConA诱导的小鼠脾细胞增殖作用的影响。
实施例11)、取原料药材栾树的枝叶0.2公斤，加70％乙醇水溶液1.6升，浸渍48小时后，倾出浸出液，再加70％乙醇1.6升，浸24小时，倾出浸出液，合并，蒸去乙醇，得约400毫升水溶液A；2)、400毫升水溶液A过滤，在分液漏斗中加200毫升石油醚(60-90℃)萃取两次，每次振荡5分钟，静置30分钟，分层，分去上层提取液(B1)；3)、将上述2)中下层水溶液在分液漏斗中加二氯甲烷200毫升萃取两次，每次振荡5分钟，静置30分钟，分层，分去下层二氯甲烷提取液(B2)；4)、将上述3)中上层水溶液置于分液漏斗中，加200毫升乙酸乙酯萃取4次，每次振荡5分钟，静置30分钟，分层，取上层乙酸乙酯提取液；合并乙酸乙酯提取液，减压浓缩至于，得棕黄色粉末14克，即为本发明所说的有效部位提取物YQE。
实施例2
将上述实施例1中得到的提取物YQE10克，加蒸馏水350毫升，加热溶解，放冷，加100毫升乙醚萃取2次，每次5分钟，静置30分钟，分得乙醚层，加水25毫升洗后，浓缩至干，得棕黄色粉末3.3克(YQE1)；水层加乙酸乙酯150毫升萃取4次，每次10分钟，静置30分钟，合并乙酸乙酯提取液，加水50毫升洗，静置30分钟，分去水层，乙酸乙酯提取液加无水硫酸镁干燥、过滤，减压浓缩至干，得棕黄色粉末5.3克，即为本发明所说的有效部位提取物YQE2。
实施例3取实施例1制备的有效部位提取物YQE10克加水100毫升溶解，上D101大孔树脂柱(3×30cm)，用0-90％乙醇水溶液梯度洗脱，收集30-50％乙醇水溶液的洗脱液，减压浓缩至干，得本发明所说的有效部位提取物YQE3 5.5克。
实施例4取实施例1制备的本发明有效部位提取物YQE2 90克，加淀粉10克，硬脂酸镁0.1克，混合均匀，过60目筛，细粉装胶囊，每粒胶囊装量0.3克，含YQE2 0.25-0.30克。口服成人每日1-3次，每次1-5粒。
实施例5取黄芪、丹参、赤芍、莪术、白花蛇舌草各1000克，将其用水煮法提取两次，提取液浓缩至浸膏，烘干，并粉碎，过80-100目筛。取实施例2制备的YQE2 250克，与制备的黄芪、丹参、赤芍、莪术、白花蛇舌草浸膏粉混合均匀，加干燥淀粉10％混匀，用95％乙醇为湿润剂制成软材，过16目筛制粒，晾干、整粒。加硬脂酸镁1％，混匀，计算片重，使每片含栾树提取物0.07克，压片，包糖衣。每日2-3次，每次1-5片，或遵医嘱。
权利要求
1.一种含有栾树提取物的药物，其特征在于它含有0.01-99.9％重量份的下述栾树提取物，该栾树提取物是从无患子科栾树属(Koelreuteria Laxm)植物中提取的有效部位，其主要成分是没食子酸、没食子酸乙酯、没食子酸糖甙、没食子酸黄酮等多酚类化合物；其理化参数是呈棕黄色粉末状，遇三氯化铁试剂呈兰绿色，盐酸镁粉反应阳性呈樱桃红色；紫外光谱为λmax(甲醇)215和271nm处有最大吸收峰，215nm E％1值约为1.02，271nm E％1值约为0.44；红外光谱为cm-1(KBr压片)3700-2500(OH)，1700(-O-C＝O)，1600，1510，1520，1440(芳香核)，1300，1200，1090(-C-O-)等处有吸收峰。
2.根据权利要求1的药物，其特征在于它含有1-80％重量份的所述栾树提取物。
3.根据权利要求1的药物，其特征在于它含有10-60％重量份的所述栾树提取物。
4.根据权利要求1的药物，其特征在于该药物的剂型可以是片剂、丸剂、胶囊剂、冲剂、喷雾剂、口服液、混悬液、外用擦剂、透皮吸收制剂以及注射剂中的任何一种。
5.一种栾树提取物，其特征在于它是以溶媒提取无患子科栾树属植物栾树的枝叶、花、果实及树皮、根所得的提取物。
6.根据权利要求5的提取物，其特征在于提取用溶媒是水、或含有10-80％水的1-4碳醇、或纯丙酮及含有20-30％水的丙酮。
7.根据权利要求6的提取物，其特征在于对该提取物的纯化可用不同的有机溶媒萃取得到不同的有效部位，所说的溶媒包括C6-C7的烷烃，如，己烷，环己烷，石油醚；卤化烃，如，二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷，四氯化碳；醚和有机酸的酯类，如，乙醚，乙酸乙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯；C3-C5的脂肪醇。
8.根据权利要求6的提取物，其特征在于该提取物是对有机溶媒萃取的提取物再用有机溶媒或用色谱法纯化的提取物，所说的纯化是指用溶媒进一步萃取，所说的溶媒是指C6-C7的烷烃，如，己烷，环己烷，石油醚；卤化烃，如，二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷，四氯化碳；醚和有机酸的酯类，如，乙醚，乙酸乙酯，乙酸丁酯，乙酸戊酯；C3-C5的脂肪醇；或用大孔树脂、硅胶、氧化铝吸附及分配色谱等纯化。
9.一种栾树提取物，其特征在于它是以下述方法提取的有效部位1)、取原料药材栾树的枝叶、花、果实加10-80％乙醇水溶液回流提取或浸泡渗漉提取，提取液浓缩除去醇，得提取液A；2)、对提取物A的水溶液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正-丁醇提取，分别得到提取液B1、提取液B2、提取液C和提取液D；3)、收集乙酸乙酯提取液C液浓缩，得提取物E(下称YQ-E)；4)、提取物E(YQ-E)进一步溶媒萃取，得到本发明所说的纯化有效部位提取物(YQ-E1和YQ-E2)，用色谱法对提取液E进行柱层析纯化，得到本发明所说的纯化有效部位提取物(YQ-E3)。
10.一种栾树提取物，其特征在于它是以下述方法提取的有效部位1)、取原料药材栾树的枝叶、花、果实加水浸泡渗漉提取，过滤，减压浓缩，得提取液A；2)、加水将上述提取液A稀释，然后加石油醚，进行萃取，静置分层，分去上层石油醚液；3)、将上述2)中保留的下层提取液，加二氯甲烷进行萃取，静置分层，分去下层二氯甲烷提取液；4)、将上述3)中保留的上层水溶液再加乙酸乙酯进行萃取，静置分层，收集上层乙酸乙酯液备用；5)、将上述4)中备用的乙酸乙酯提取液浓缩至干(YQE)，加水溶解后，上大孔树脂色谱柱进行层析纯化，用含水0-90％乙醇洗脱，收集30-50％乙醇洗脱液，减压浓缩至干，得到本发明所说的纯化有效部位提取物(YQ-E3)。
全文摘要
本发明公开了一种栾树提取物以及含有该提取物的药物制剂，该提取物及其药物制剂具有抗癌和免疫抑制作用、抗病毒作用、自由基清除作用以及抗血小板凝聚和抗血栓形成作用。
文档编号A61P35/00GK1162461SQ9610467
公开日1997年10月22日 申请日期1996年4月18日 优先权日1996年4月18日
发明者马广恩, 申雅维, 鲁学照, 赵咏丽, 罗何生 申请人:中国医药研究开发中心