专利名称：基于光透射、反射的体内成像用造影剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及颗粒性造影剂在以光为基础的各种诊断成像技术中的应用，更具体地说，是涉及颗粒性光学成像造影剂。
造影剂是在各种诊断成像领域中用来增强图像的，其中最重要的是x-射线，磁共振成像(MRI)，超声成像和核医学领域。其它正在发展或现今在临床使用的医学成像方式包括磁源成像和应用电势x线断层照相术。x-射线造影剂几乎已有100年的发展历史了。
今天在临床使用的x-射线造影剂包括各种水溶性碘化芳族化合物，其每个分子中包括3到6个碘原子。该化合物可以是带电荷的(以生理上可接受的盐的形式)或是非离子。现今最普遍使用的试剂是非离子物质，因为广泛的研究已证明，非离子试剂比离子试剂更安全。这与患者的渗透负荷有关。除了水溶性碘化试剂以外。胃肠系统x-射线检查中仍经常使用硫酸钡。有几种不溶于水的或颗粒性试剂已被用作非胃肠给药的x-射线造影剂，主要用于肝或淋巴系统成像。一般用于非胃肠给药的颗粒性x-射线造影剂包括，例如固体碘化粒子的悬浮液、含有水溶性碘化试剂的脂质体的悬浮液，或碘化油的乳剂。
现行采用的MRI造影剂一般含有顺磁物质或强磁性、亚铁磁性或超顺磁性粒子(下文称“磁性粒子”)的物质。顺磁性MRI造影剂可以是，例如，象Mn EDTA和Gd DTPA这样的过渡金属元素螯合物和镧系元素螯合物。今天，在临床使用的几种钆基试剂，包括诸如Gd DTPA(钆喷酸Magnevist)，Gd DTPA-BMA(Omniscan)，Gd DOTA(Dotarem)和GdHPDO3A(Prohance)等。有几种颗粒性顺磁试剂已用于肝MRI诊断；例如含有顺磁性螯合物的脂质体的悬浮液，和诸如钆淀粉微球等这样的顺磁性固体粒子的悬浮液。推荐用作MR造影剂的磁性粒子是水不溶性物质，如可任意带有涂层或载体基质的Fe3O4或δ-Fe2O3。这样的物质是非常有效的MR造影剂，以生理上可接受的悬浮液的形式给药。
用作超声造影媒质的造影剂一般含有游离或封闭气泡的悬浮液。该气体可以是任何可接受的气体，例如空气，氮气或全氟化碳。常用的封闭胶囊物质是碳水化合物基质(例如Echovist和Levovist)，蛋白质(例如Albunex)，象磷脂(含有气体的脂质体)这样的液态物质，以及合成聚合物。
用于象闪烁扫描术这样的诊断核医学的标识物一般含有放射性元素，例如锝(99m)和铟(III)，它们以螯合复合物形式存在，而淋巴闪烁扫描术是用放射性标记的硫化锝胶体和氧化锝胶体来完成的。
本文所用的术语“光学成像”包括的应用范围很广，包括所有利用电磁谱的紫外、可见光或红外区域内的照明源的那些应用。在光成像中，透过躯体、经躯体散射或从躯体反射(或在荧光的情况下重发射)的光被检测后，直接或间接生成图像。光可以与物体相互作用而改变其传播方向，但能量没有明显变化。这一过程叫做弹性散射。光通过软组织弹性散射是伴随着组织介电常数中的显微变异而产生的。将每单位组织长度散射给定波长(λ)的光的概率称之为(线性)散射系数μs。软组织在约600-1300nm光窗中的散射系数分布在101-103cm-1的范围内，并随1/λ而递减。在这一范围内，μs＞＞μa(吸收系数)，并且尽管μs(和总的衰减)非常大，但向前散射使得光实际透入组织中。例如，630nm的光在组织中的有效穿透深度(1/e深度或37％光子存留)的范围是1-10mm。随着上述630nm波长的增加，该有效穿透深度也缓慢增加或基本恒定不变(尽管在水的975nm处吸收峰观察到轻微下降)。该散射系数仅随着波长增加而逐渐减小。
散射的光既可以从散射部位无规则地分散(各向同性的)，也可以以最小分散的特定方向(各向异性的)散射。为了方便和数学模拟的目的，假定光在组织中的散射是在不连续的独立的散射中心(“粒子”)上发生的。在从这样的“粒子”的散射中，散射系数和散射的平均余弦(相函数)取决于粒子与其周围介质之间的折射率的差别，以及粒子大小与波长的比值。光通过粒子的散射中，小于入射光波长的叫做瑞利(Rayleigh)散射，这种散射与1/λ4成正比，并且该散射近似为各向同性；与入射光波长相当或大于入射光波长的叫做Mie散射，这种散射与1/λ成正比，并且该散射是各向异性的(前向峰值的)。在可见/近红外区对组织进行的多次测试中，观察到的散射是与微量级的粒子(例如细胞和主要小器官)的Mie状散射相一致的。
由于散射系数对于光窗(600-1300nm)中光的波长来说如此大，所以在散射发生前由光子传播的平均距离只有10-100μm。这样我们就可以假定透入组织任何有效距离的光子发生了多次散射。在组织中多次散射意味着真实的光路长度远远大于光输入和输出点的实际距离，因此，这种散射使得光在组织中漫射(漫透射和漫反射)。多次散射给成像带来的困难体现在三个方面(i)由于多次散射而已混乱的光使通信信号受到损失，并对图像产生干扰(散射增加了噪声)；(ii)散射使得光在组织中停留的时间长了，从而增加了吸收的可能性，因此透过组织用于检测的光少了(散射降低了信号)；和(iii)由于散射使真实的光路长度不能知道，因而就不可能由Beer-Lambert定律测出组织(或造影剂)的如密度这样的物理性能(使光在组织中散射作用的定量变得复杂)。不过，尽管光在组织中不能穿透超过几十微米距离而不发生散射，但散射的平均余弦值大，这表明入射光束中的大部分光子可以经过多次散射，而并不会偏离最初光轴太远，因此能形成图像。这样，只要能将噪声成分反射，尽管有显著散射，但对组织进行成像仍是可能的。
基于上述原因，光成像技术最有价值的波长是大致在600-1300mm的范围内。这些波长能比较深地透入活组织而对人体无害的能力。不过，由于表面结构的光学分析或疾病的诊断与体表面或体腔表面或细胞腔非常接近，所以也可使用600nm波长以下的紫外光和可见光。
光也可用于治疗例如在光动力疗法(PDT)中，光子被吸收并将能量转化为热和/或可用于癌症治疗的光化反应。
当今所采用的光成像的主要方法包括简单透射法，各种x线体层照相技术，表面成像和荧光成像。这些方法利用了透射、散射或发射(荧光)光予或这些因素的组合。本发明的造影剂不仅可用于这些方法当中的任何一种，也可用于其它任何形式的光成像方法。
今天，人们对于开发光成像的新设备有着极大兴趣，尤其感兴趣的方法是各种类型的x线体层照相技术，特别是在日本发展的这种技术。对于光在诊断医学和PDT中的应用的科学依据参见下述文章，例如Henderson，B.和Dougherty，T.，光动力疗法基本原理和临床应用(1992)；Gonzalez，E.等人，牛皮癣(1991)519和603；Scrip 1815(1993)25；Andersson-Engeles，S.等人，医学中的激光4(1988)115；Andersson，P.等人，电气与电子工程师协会IEEE 23(1987)1798；Andersson，P.等人，医学中的激光2(1987)261；Anderson，R.等人，应用光学28(1989)2256；Amato，I.，科学260(1993)1234；Alfano，R.等人，IEEE 20(1984)1512；Lipowska，M.等人，ACS NatMeeting(1991)，临床528(1992)17；Anderson-Engles，S.等人，光学快报15(1990)1179；Andersson-Engles，S.等人，医学中的激光4(1989)241；Andersson-Engles，S.等人，医学中的激光4(1989)171；Andersson-Engles，S.等人，IEEE 26(1990)2207；Andersson-Engles，S.等人，光化学与光生物学53(1991)807；Andersson-Engles，S.等人，摄影-光学仪器工程师学会SPIE 908(1988)116；Andersson-Engles，S.等人，SPIE 1205(1990)179；Andersson-Engles，S.等人，分析化学61(1989)1367和分析化学62(1990)19；Andreoni，A.，光化学与光生物学52(1990)423；Ankerst，J.等人，应用光谱学38(1984)890；Anthony，D.等人，光化学与光生物学49(1989)583；Araki，R.等人，时间分辨光谱学与组织成像1431(1991)321；Arnfield，M.等人，光化学与光生物学51(1990)667；Arridge，S.等人，Phys.Med.Biol 37(1992)1531；Arridge，S.等人，SPIE1431(1991)204；Balzani，S.等人，光化学与光生物学52(1990)409；Barabash，R.等人，IEEE 26(1990)2226；Barker，D.等人，英国实验病理学杂志51(1970)628；Baum，R.等人，化学与工程新闻10月31日(1988)18；Baumgartner，R.等人，光化学与光生物学46(1987)759；Benaron，D.等人，科学259(1993)1463；Benson，R.等人，化学与工程数据杂志22(1977)379；Bickers，D.，放射学研究21(1986)885；Blasdel，G等人，自然321(1986)579；Blasse，G，光化学与光生物学52(1990)417；Bolin，F.等人，应用光学28(1989)2297；Boulnois，J.等人，医学中的激光1(1985)47；Brodbeck，k.等人，医用物理学14(1987)637；Carney，J.等人，分析化学65(1993)1305；Chan，W.等人，光化学与光生物学50(1989)617；Chance，B.，SPIE1641(1992)162；Chance，B.等人，SPIE1204(1992)481；Cheong，W.等人，IEEE26(1990)2166；Cope，M.等人，SPIE1431(1991)251；Deckelbaum，L.等人，外科学与内科学中的激光7(1987)330；Delpy，D.等人，Phys Med.Biol33(1988)1433；Detty，M.等人，美国化学学会杂志112(1990)3845；Detty，M.等人，医药化学杂志33(1990)1108；Doiron，D.等人，临床及生物学研究进展170(1984)41；Driver，I.，Phys.Med.Biol36(1991)805；Feather，J.等人，医学中的激光5(1990)345；Fishkin，J.等人，SPIE1431(1991)122；Flock，S.，医用物理学14(1987)835；Gathje，J.等人，应用生理学29(1970)181；Gomer C.等人，癌症研究50(1990)3985；Grunbaum，F.等人，SPIE1431(1991)1431；Haglund，M.等人，自然358(1992)668；Hebden，J.等人，美国医学物理学家协会19(1992)1081；Hebden，J.等人，医用物理学17(1990)41；Hoek，A.V.等人，IEEE23(1987)1812；Hohla，k.等人，SPIE908(1988)128；Holbrooke，D.等人，纽约科学院汇刊267(1976)295；Hoyt，C.等人，外科学与内科学中的激光8(1988)1；Huang，D.等人，科学254(1991)1178；Jacson，P.等人，放射学研究20(1985)226；Jacques，S.等人，生命科学中的激光1(1987)309；Kittrell，C.等人，应用光学24(1985)2280；Lakowicz，J.，生物物理学杂志46(1984)463；Lam，S.等人，胸腔97(1990)333；Li，W.，眼科学100(1982)484；Lilge，L.等人，SPIE1203(1990)106；Lytle，A.等人，SPIE1200(1990)466；Macvicar，B.等人，神经科学杂志11(1991)1458；Maijnissen，J.等人，外科学与内科学中的激光2(1987)235；Marynissen，J.等人，泌尿学杂志142(1989)1351和临床与生物学研究进展170(1984)133；McCormick，P.等人，急救医学19(1991)89；Mcormick，P.等人，神经外科杂志76(1992)315；Mckenzie，A.等人，Phys.Med.Biol.30(1985)455；Moes，C.等人，应用光学28(1989)2292；Montan，S.等人，光学快报10(1985)56；Montforts，F.等人，应用化学(国际版)31(1992)1592；Morgan，A.等人，光化学与光生物学52(1990)987；Morgan，A.等人，医药化学杂志23(1990)1258；Morgan，A.等人，医药化学杂志32(1989)904；Navarro，G.等人，医用物理学15(1988)181；Nelson，J.等人，癌症研究4(1987)4681；Orbach，H.等人，神经科学杂志5(1985)1886；Pandey，R.等人，化学快报2(1992)491；Parker，F.等人，分析生物化学18(1967)414；Parrish，J.，J.Derm 17(1990)587；Parrish，J.等人，光化学与光生物学53(1991)731；Patterson，M.等人，应用光学28(1989)2331；Patterson，M.等人，SPIE1203(1990)62；Patterson，M.等人，SPIE1065(1989)115；Patterson，M.等人，光敏作用15(1988)121；Patterson，M.等人，医学中的激光6(1991)379；Peters，V.等人，Phys.Med.Biol 35(1990)1317；Profio，A.，光化学与光生物学46(1987)591；Profio，A.等人，医用物理学11(1984)516；Prout，G.等人，新英格兰医学杂志317(1987)1251；Roberts，W.等人，国立癌症研究所杂志80(1988)330；Rosenthal，I.，光化学与光生物学53(1991)559；Sartori，M.等人，IEEE23(1987)1794；Schmitt，J.，应用光学31(1992)6535；Schmitt，J.等人，Opt.Soc.Am.7(1990)2141；Schneckenburger，H.等人，光学工程师31(1992)1447；Selman，S.等人，SPIE997(1988)12；Selman，S.等人，泌尿学杂志143(1990)630；Sevick，E.等人，分析生物化学195(1991)330；Shen，N.等人，Pharmacologica Sinia4(1986)346；Shiner，W.等人，PhotonicsSpectra9月(1992)109；Spears，k.等人，IEEE36(1989)1210；Spikes，J.，光化学与光生物学43(1986)691；Star，W.等人，医学中的激光5(1990)107；Star，W.等人，光化学与光生物学46(1987)619；Steike，J.等人，J.Opt.Soc.Am.6(1988)813；Stekeil，W.，生理学杂志198(1960)881；Sullivan，F.等人，应用放射学1月(1993)26；Svaasand，L.等人，医用物理学12(1985)455；Svaasand，L.等人，医学中的激光5(1985)589；Svaasand，L.等人，光化学与光生物学41(1985)73；Svaasand，L.等人，光化学与光生物学38(1983)293；Svanberg，k.等人，癌症研究46(1986)3803；Svanberg，k.等人，物理学报26(1989)90；Tam，A.，超灵敏激光光谱学(1983)72；Toida，M.等人，日本电子学与通讯75(1992)137；Tsay，T.等人，SPIE 1646(1992)213；Tsuchiya，A.等人，泌尿学杂志130(1983)79；Unsold，E.等人，医学中的激光5(1990)207；Vergara，J.等人，生物物理杂志59(1991)12；Vitkin，I.等人，光化学与生物学杂志16(1992)235；Wang，L.等人，光学与光子学2(1991)38；Wang，L.等人，科学253(1991)769；Wang，L.等人，SPIE1431(1991)97；Watmough，D.，英国放射学杂志55(1982)；Wilson，B.等人，Phys.Med.Bio131(1986)327；Wilson，B.等人，医学中的激光1(1986)235；Wyatt，J.等人，应用生理学杂志68(1990)1086；Wyatt，J.等人，儿科病文献64(1989)953；Yoo，k.等人，光学快报16(1991)1068；Yoo，k.等人，光学快报15(1990)320。
有一些涉及光学成像技术和在光学成像中各种染料应用的专利出版物，它们是含羟基2，3-吡啶并氧化铝的标记荧光染料，Jp4,320,456(HitachiChem)；含有荧光标记的酞菁颜料的肿瘤治疗和诊断剂，JP4,288,022(HitachiChem)；利用可见的天然发光检测癌组织，US4,930,516(Alfano R.等人)；利用天然荧光检测癌组织的方法和设备，US5,131,398(Alfano，R.等人)；从组织发射的荧光来进行诊断的改进，WO90/10219(Andersson-Engles，S.等人)；作为荧光探针的荧光卟啉和荧光酞菁-聚乙二醇，多羟基化合物，以及糖类衍生物，WO91/18006(Diatron Corp)；无规媒质成像方法，US5,137,355(StateUniv.of New York)；四吡咯治疗剂，US5,066,274(Nippon Petrochemicals)；用于治疗剂中的四吡咯聚氨基一元羧酸，US4,977,177(NipponPetrochemicals)；四吡咯氨基羧酸，US5,004,811(Nippon Petrochemicals)；卟啉和癌症治疗，US5,162,519(Efamol Holdings)；二氢卟啉和治疗易坏死肿瘤的方法，US4,837,221(Efamd)；以含有合成磷脂的脂质体分散体形式的胃肠外给药的酞氰化锌化合物，EP451 103(CIBA Geigy)；检测肿瘤的仪器和方法，US4,515,165(Energy Conversion Devices)；测定缺氧的时间和频域光谱学，WO92/13598(Nim Inc)；用作荧光地高辛试剂的酞氰酰聚乙二醇和酞氰酰糖化物，WO91/18007(Diatron)；荧光计，US4,877,965(Diatron)；光学纤维荧光分光仪；WO90/00035(Yale Univ.)；组织氧测量系统，EP502,270(Hamamatsu Photonics)；从皮肤反射来测定胆红素浓度的方法，US4,029,084(Purdue Research Foundation)；在荧光治疗中有用的细菌叶绿素-a衍生物，US5,173,504(Health Research Inc.)；在荧光治疗中有用的精制血卟啉二聚物和三聚物，US5,190,966(Health Research Inc.)；含有卟啉的药物，US5,028,621(Health Research Inc)；血卟啉衍生物及其制备方法，US4,866,168(Health Research Inc)；破坏或损伤靶细胞的方法，US5,145,863(Health Research Inc)；诊断肿瘤组织是否存在的方法，US5,015,463(Health Research Inc)；光动力治疗技术，US4,957,481(U.S.Bioscience)；检查活体组织的仪器，US2,437,916(PhilipMorris和Company)，由胸腔电子图像的校正方法来诊断胸腔肿瘤及其它胸部疾患所用的透射设备，US5,079,698(Advanced Light Inaging Technologies)；三羰花青红外吸收染料，US2,895,955(Eastman Kodak)；神经外科用光学成像系统，CA2,048,697(Univ.Techn.Int.)；新的卟啉衍生物及它们的金属配合物用作癌症诊断和/或治疗的PDT光敏剂，JP323,597(Hogyo，T)；外差法检测的光接收系统和用于光透射成像的图像形成设备，EP445,293(ResearchDevelopment Corp.of Japan)；外差法检测的光接收系统和利用光接收系统的光透射成像装置，WO91/05239(Research Development Corp.of Japan)；储存稳定的卟啉组合物及其制造方法，US4,882,234(Healux)；光学测量化学分析物的方法，WO92/19957(Univ.of Maryland at Baltimore)；波长特异性细胞毒素剂，US4,883,790(Univ.of British Columbia)；氢化-单苯并-卟啉波长特异性细胞毒素剂，US4,920,143(Univ.of British Columbia)；人体组织定量检查和高分辨率成像用的设备和方法，EP447,708(Haidien Longxing Med Co)；神经外科用光学成像系统，美国申请7,565,454(University Technologies Int.Inc.)；带有荧光配合基的特异性药物受体的品质鉴定，WO93/03382(Pharmaceutical Discovery Corp)；用作分子探针的4，7-二氯荧光素染料，US5,188,934(Applied Biosystems)；利用窄光谱带宽的非电离辐射进行高分辨率胸腔成像的设备，US4,649,275(Nelson，R.等人)；中四苯基卟啉配合物，其制备方法以及含有它的药物制剂，EP336,879(Schering)；13，17-丙酸和丙酸衍生物取代的卟啉配合物、其制备方法以及含有它的药物制剂，EP355,041(Schering)；光敏剂，US5,093,349(Health Research)；嗜焦素及其在荧光动力疗法中的应用，US5,198,460(Health Research)；利用喇曼光谱检测系统摘除异常组织的光组织化学分析，体内检测及快速导向，WO93/03672(Redd，D.)；四苯基三氮杂卟啉试剂及含有它们的试剂盒，US5,135,717(British Technology Group)；人脑内官能活性定位的系统及方法，US5,198,977(Salb.J.)；Sapphyrins的光动力活性，US5,120,411(Board ofRegents，University of Texas)；膨胀卟啉的制备方法，US5,152,509(Board ofRegents，University of Texas)；膨胀卟啉(Board of Regents，University ofTexas)；红外光辐射成像系统及方法，WO88/01485(Singer Imaging)；利用散射和漫射的成像，WO91/07655(Singer Imaging)；恶性肿瘤内蕴荧光的诊断仪器，US4,957,114；indacene化合物及其使用方法，US5,189,029(Bo-Dekk Ventures)；用5，10，15，20-四(羧苯基)卟吩检测肺癌的方法，US5,162,231(Cole，D.A.等人)；单一组织单元的成像方法，DE4327798(Siemens)；叶绿素和细菌叶绿素衍生物，它们的制备及含有它们的药物组合物，EPO584552(Yeda Research and Development Company)；波长特异性的光敏porphacyanine和膨胀卟啉状化合物以及它们的制备和使用方法，WO94/10172(Qudra Logic Technologies)；对于隐藏于半透明无规媒质中或之后的物体提高其成像的信噪比的方法和仪器，US5,140,463(Yoo，K.M.等人)；用于光动力疗法的苯并卟啉衍生物，US5,214,036(University of BritishColumbia)；利用δ-氨基乙酰丙酸对癌症的荧光诊断，WO93/13403(Svanberg等人)；Verfahren zum Diagnostizieren von mitfluoreszierenden Substansen angereicherten，inbesondere tumorφsenGewebebereichen，DE4136769(Humboldt Universitat)；三吡啶衍生物，WO90/00550(Wallac)。
现有技术中描述的所有光学成像染料或造影剂具有不同的性能，但是它们都能影响入射光，导致吸收和/或荧光。然而这些造影剂中没有一种用作颗粒造影剂。
在光成像方法中，我们发现引入颗粒物质作为散射造影剂可非常有效地增强造影。为了清楚起见，用“粒子”这个词是指任何生理上可接受的颗粒物质。这样的粒子可以是固体(例如色覆或未色覆的晶体物质)或流体(例如乳剂中的液体粒子)或者可以是聚集体(例如含有脂质体的液体)。优选颗粒物质的粒子尺寸小于入射光波长。
因此，本发明一个方面涉及使用生理上可接受的颗粒物质来制造含有造影媒质的颗粒性造影剂，用于体内诊断的光成像。
本发明的另一个方面还提供一种光学成像方法，使人或非人(优选哺乳类，鸟类，或爬行类)动物体产生图像，该方法的特征在于给予所述躯体使用一种造影有效量的生理上可接受的颗粒性造影剂，使至少有部分所述躯体产生图像。在这样一个方法中，造影有效量的颗粒剂的给药途径是，例如胃肠外的或注入外部排空的体内器官或通道，给药后检测经躯体发射、透射或散射的光，其中至少有部分存在造影剂的躯体生成了图像。
按照本发明所用的颗粒剂可以包括一个发色团或荧光团，即在成像过程中的检测波长范围内可以吸收或发射光，或者另一方面，可以主要依赖于光散射作用。在后者的情况下，人们可以仅仅使用生理上可接受的未用光标记的粒子，例如惰性有机或无机物质的粒子，如不溶的三碘苯基化合物或二氧化钛，它们看上去呈现白色或无色。含发色团或荧光团的粒子，即光标记的粒子，该发色团或荧光团可以是由一种颗粒状载体携带(例如通过粘合，涂覆、或包含或沉积其中)。或者，该载体本身也可以具有发色或荧光性能。光标记可以是黑色光标记(即吸收可见光，因此呈现黑色)，但优选非黑色光标记。
散射造影剂(和那一物体的吸收造影剂)在光学成像应用中使图像增强的机理有两种。第一种机理是直接图像增强作用，与x-射线成像中的x-射线造影剂的作用相类似。在直接图像增强中，造影剂直接促进造影图像的改进是由于含该造影剂的组织所发射的信号强度受该造影剂的影响。在光学成像中，在某一组织中的散射(和吸收)剂可以使光在该组织中的衰减不同于周围组织，从而增强了造影。
第二种机理是所用的散射(或吸收)剂起了噪声反射剂的作用。在这种情况下，该造影剂不是如上面所描述的那样直接成像，而是从成像信号中过滤掉噪声信号，从而使所需信号更易检测。在光学成像应用中的噪声是由多次散射引起的，它使图像的质量下降。这种噪声的来源是如前面所提到的，光通过无规媒质(如组织)传播时会发生多次散射。这种散射使得入射光分离成两种成分-相干成分和不相干成分。相干成分构成冲击信号，它通过组织正向传播，并携有该物体的信息。不相干成分则构成噪声，因为光在各个方向上已发生无规散射，使得有关于该物体的信息丢失了。当相干信号的强度降低到多次散射的噪声强度之下时，物体就看不见了。这种多次散射的噪声一般可通过空间滤光片除去，该滤光片可将散射的光从入射光的共线方向反射掉。不过，有部分从物体形成的噪声经多次散射后又重新结合到最初的冲击信号中。这种多次散射的光是无法通过空间滤光片除去的，因为它与所需的冲击信号的路径相同。
散射(和吸收)剂可以从所需的冲击信号中去除这些不希望的噪声成分。这是基于多次散射的光在组织中无规传播所经过的距离比冲击信号传播经过距离更长。冲击信号传播的距离基本上是成像组织(或躯体部分)的厚度。传播了更长距离的散射光衰减的可能性也更大。目前的技术是使用一种时间门(时间过滤器)来从冲击成分中去除散射信号(传播距离越长＝在组织中停留时间越长)。
少量各向同性散射剂的加入大大延长了散射信号成分的停留时间，而不会阻碍冲击成分的进程，这就有效地延长了冲击信号和散射信号之间的分隔时间，增加了散射(噪声)成分的反射作用，因而得到了更好的图像质量。此外，冲击信号强度随着传播距离(x)以指数级下降，而散射信号随着距离的平方(x2)以指数级下降。因此，散射信号强度远比冲击信号强度下降得快，从而改善了图像的信噪比。
在现有技术中公开的关于以粒子散射为基础的颗粒性造影剂的内容非常少，我们所知的与此有关的现有技术仅是US5,140,463(Yoo，K.M.等人)，其中公开了隐藏在半透明介质之中或之后的物体成像信噪比的改进方法和仪器。该专利概括地指出，要使无规媒质降低其无规性(这样就会减少散射光)，并且还提出要提高未散射(冲击)光与散射光之间的分离时间。按照该专利，为了达到这些目的所采用的方法之一是在无规媒质中掺入小散射剂。但对这些小散剂没有进一步论述，也没有建议在体内使用。
有人曾提出过脂质体形式的颗粒物质；Reddi E.等人，在医学中的激光5(1990)339中指出将脂质体或LDL给药的Zn(II)-酞菁作为治疗肿瘤用的光动力治疗剂；EP451103(CIBA Geigy)公开了非胃肠给药的酞菁锌组合物是以含合成磷脂的脂质体分散体形式；CA2,047,969(Liposome Company)公开了含有苯并卟啉衍生物的脂质体组合物，用于癌症的光动力疗法或抗病毒剂。这些颗粒物质曾被建议用作治疗剂，而与散射光学成像造影剂无关。
在本发明的一个实施方案中，用作光成像的造影剂含有生理上可接受的含气体粒子。优选的是，例如，可生物降解的含气体的聚合物粒子、含气体的脂质体或气溶胶粒子。
本发明的这一实施方案包括，例如有充气空隙的粒子在光学成像中的应用(US4,442,843)；带有气体的半乳糖粒子(US4,681,119)；产生微泡的微粒(US4,657756和DE3313947)；蛋白质微泡(EP224934)；含有气体的粘土粒子(US5,179,955)；固态表面活性剂微粒和气泡(DE3313946)；含有气体的直链淀粉或聚合物微粒(EP327490)；含有气体的聚合物粒子(EP458079)；气溶胶粒子(US5,086,085)；可生物降解的多醛微粒(EP441468)；带有气体的脂质体(WO9115244)；含有气体的脂质体(WO9222247)；和其它含有气体的粒子(WO9317718，EP0398935，EP0458745，WO9218164，EP0554213，WO9503835，DE3834705，WO9313809，WO9112823，EP586875，WO9406477，DE4219723，EP554213，WO9313808，WO9313802，DE4219724，WO9217212，WO9217213，WO9300930，US5,196,183，WO9300933，WO9409703，WO9409829，EP535387，WO9302712，WO9401140)。粒子的表面或涂层可以是任何生理上可接受的物质，气体可以是任何可接受的气体或气体混合物。尤为优选的气体是在超声造影剂中所用的气体，例如空气，氮气，低级链烷烃和低级氟代或全氟代链烷烃(例如含有最多7个，特别是4，5，或6个碳原子)。
按照本发明使用气体微泡(带有或不带有脂质密封膜)，好处是可利用已知的高强度超声激发能力来破坏这样的微泡。因此，造影剂在超声照射映像前后的分布不同，就可更加方便地比较所检测到的光信号(或图像)。
在本发明的另一个实施方案中，作为光成像方式中用的造影剂将含生理上容许的类脂物质的粒子，例如；乳剂，特别是含水乳剂。优选含有卤素的类脂物质。本发明的这一实施方案的例子包括；脂肪乳剂在光学成像中的应用(JP5186372)，碳氟化合物的乳浊液(JP2196730，JP59067229，JP90035727，JP92042370，WO930798，WO910010，EP415263，WO8910118，US5,077,036，EP307087，DE4127442，US5,114,703)；溴化全氟烃类的乳剂(JP60166626，JP92061854，JP5904630，JP93001245，EP231070)，全氟氯乳剂(WO9311868)或其它乳剂(EP321429)。
在本发明的又一个实施方案中，作为光成像方式中用的造影剂可含生理上容许的脂质体。优选的脂质体基团是磷脂脂质体和多层脂质体。
本发明的这一实施方案实例包括含有胆甾醇衍生物的磷脂脂质体在光学成像中的应用(US-A-4544545)；含有醛类的与脂质体有关的化合物(US-A-4590060)；类脂基质载体(US-4610868)；适用于肝和脾的x-射线检查的、含有三碘苯甲酸衍生物的脂质体(DE-2935195)；适用于淋巴系统造影术的脂质体型x-射线造影剂(US-4192859)；受体靶向脂质体(WO-8707150)；免疫活性脂质体(EP-307175)；含有特异抗肿瘤抗体的脂质体(US-4865835)；含有能使已分解的MRI造影剂(自旋转标记的)再生的氧化剂的脂质体(US-4863717)；适用于MRI的、含有大分子束缚顺磁性离子型的脂质体(GB-2193095)；适用于超声成像的、含有作为气体前体的生物碳酸钠或氨基丙二酸的磷脂脂质体(US-4900540)；稳定的多层气泡(US-4522803)；填充了油的、含有作为类脂的非离子表面活性剂的寡层脂质体(US-4911928)；含有与氧气可逆结合的配体的脂质磷脂聚合物(US-4675310)；含有非离子表面活性剂的单层大囊脂质体(US-4853228)；含有脂质体的气溶胶制剂(US-4938947和US-5017359)；含有两亲化合物的脂质体(EP-361894)；有机类脂溶液加水，然后蒸除溶剂，再加入类脂水相浓缩得到的脂质体(FR-2561101)；用来封装高浓度生物活性剂的、稳定的单相类脂囊(WO-8500751)；均匀的脂质体制剂(US-4873035)；含可液化凝胶悬浮体的稳定的脂质体化合物(US-5008109)；适用于受控制长期释放活性化合物的脂质球(涂覆有磷脂的固态亲水核芯)(WO-9107171)；凝胶隔绝的脂质体(US-4708861)；与脂质体结合的金属螯合物，及作为MR造影剂的用途(WO-9114178)；x-射线造影剂的类脂配合物(WO-8911272)；可俘获高溶质与类脂比的脂质体(WO-9110422)；含有共价结合于外表面上的PEG部分，以改善血清半衰期的脂质体(WO-9004384)；含顺磁和/或超顺磁剂的特定直径的脂质体胶囊的造影剂(WO-9004943)；可将成像剂输送到肿瘤部位，含由纯磷脂制得的小脂质体组成的脂质体(EP-179444)；象脂质体中的碘普罗胺这样的胶囊化的x-射线造影剂(US-5110475)；非磷脂脂质体组合物(US-5043165和US-5049389)；肝细胞方向的气泡输送系统(US-4603044)；适用作成像器官的超声造影剂的、填充有气体的脂质体(US-5088499)；由脂质体稳定的可注射用微泡悬浮体(WO-9115244)；与脂质体结合的顺磁螯合物(US-5135737)；用作固体肿瘤定位化合物的脂质体组合物(WO-9105546)；注射用x-射线不透明脂质体组合物(WO-8809165)；脂质体包括的铁螯合物(EP-494616)；通过二硫化物键连接到靶分子上的脂质体(WO-9007924)；由非放射性晶体x-射线造影剂和小粒的聚合表面改性剂组成的组合物(EP-498482)。
在单一水溶液中的水溶性化合物似乎并不是光散射剂或吸收剂，但掺入脂质体中后即可成为有效的散射剂。因此，碘克沙醇(和其它可购得的水溶性碘化x-射线造影剂)提供了一个溶于水的澄清溶液。不过，当做成脂质体胶囊时，所得到的颗粒产物为灰白色时，即表示其有良好的光散射能力。
除了用脂质体作为光成像造影剂载体以外，还可用由表面活性剂分子形成的简单胶束作为光标记物的载体，该表面活性剂的举例有十二烷基硫酸钠，十六烷基三甲铵卤化物，普流罗尼类(pluronics)，四聚醇胺(tetronics)等，该光标记物基本上是不溶于水的，但可通过两性胶束形成剂使其成为可溶，例如吲哚菁绿这样的光标记物。与此类似，象PEG改性聚天冬氨酸(参见Kwon等人，药理学研究10970(1993))这样可自发聚集成聚合物胶束的肽类也可用来携带这种光标记物。同样，光标记物载体聚集粒子可以通过多环芳香烃与阴离子表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠或硫酸pluronic F108)反应后，加入重金属离子(例如钍或银)来制得。用重金属处理可使胶束显示出磷光行为，这些可不掺入光标记物即用于本发明，特别是利用脉冲光源和时间缓发磷光的门控检测。
在本发明的又一个实施方案中，作为光成像方法的造影剂可包含有碘的生理上容许的粒子。这些粒子可以是，例如基本上不溶于水的、含有碘的固体或液体化合物的粒子，如无机或有机化合物，在后者的情况下，优选含有三碘苯基基团的化合物，或者另一方面，它们可以是聚集粒子(如脂质体)，其中至少有一种成分是碘化的化合物。在这种情况下，碘化化合物可以是成膜化合物，或者是用该膜做成的胶囊。例如乳化碘化油的用途(US4,404,182)；颗粒性x-射线造影剂(JP67025412，SU227529，DE1283439，US3,368,944，AU9210145，EP498482，DE4111939，US5,318,767)；碘化酯(WO9007491，EP300828，EP543454，BE8161143)和碘化类脂(EP294534)，这些都包括在本发明的这一实施方案中。
在本发明的又一个实施方案中，作为光成像方法的造影剂可含生理上容许的磁性粒子。此处所用的术语“磁性粒子”是指任何显示出强磁性、亚铁磁性或超顺磁性性能的粒子，优选的是复合粒子，含磁性粒子和生理上容许的聚合物基质或涂层物质，例如碳水化合物和/或留血延长的聚合物，如Pilgrimm或Illum在US-A-5160725和US-A-4904479中描述的聚氧化亚烷烃等(例如PEG)，例如含有磁性物质的可生物降解的基质/聚合物粒子。
本发明的这一实施方案的实例包括光学成像的磁性液体的应用(SU1187221)；涂覆有阴电荷胶体的铁氧体粒子(DE2065532)；铁氧体粒子(US3832457)；含有磁敏物质的液体微球(EP42249)；带有涂覆硅胶的金属氧化物核芯的磁性粒子(EP125995)；基于蛋白质基质的磁性粒子(DE3444939)；磁性小泡(JP60255728)；磁性粒子(SU106121)；包埋惰性载体的磁性粒子(JP62167730)；带有特异抗体的强磁性粒子(DE3744518)；涂覆有生物学上可接受的糖类聚合物的超顺磁性粒子(WO8903675)；含有磁性物质的聚合类脂泡(US4,652,257)；可生物降解基质中的超顺磁物质(US4,849,210)；含有顺磁或强磁性物质的可生物降解的基质粒子(US4,675,173)；带有组织亲合物质的强磁性粒子(WO8601112)；铁氧体粒子(JP47016625，JP47016624)；强磁性粒子(NL6805260)；磁性聚合物粒子(WO7800005，JP62204501，JP94016444，WO870263)；铁酸钡粒子(WO8805337)；磁性氧化铁粒子(US4,452,773)；含有磁性粒子的氨基酸聚合物(US4,247,406)；复合双金属氧化物粒子(EP186616)；磁性粒子(GB2237198)；密封的超顺磁性粒子(WO8911154)；可生物降解的磁性粒子(WO8911873)；与蛋白质共价结合的磁性粒子(EP332022)；带有糖类基质的磁性粒子(WO8301768)；带有硅基质的磁性粒子(EP321322)；覆盖磁性粒子的聚合物(WO9015666)；聚合物保护的胶态金属分散体(EP252254)；可生物降解的超顺磁性粒子(WO8800060)；涂覆的磁性粒子(WO9102811)；铁流体(DE4130268)；金属有机涂覆的磁性粒子(WO9326019)；和其它磁性粒子(EP125995，EP284549，US5,160,726，EP516252，WO9212735，WO9105807，WO9112025，WO922586，US5,262,176，WO9001295，WO8504330，WO9403501，WO9101147，EP409351，WO9001899，EP600529，WO9404197)。
本发明所用的颗粒性造影剂可以是象上面提到的非光标记的或光标记的。在后者的情况下，这意味着该粒子或是入射光波长处的有效的光吸收剂(即带有发色团)或是可吸收入射波长的并以不同波长发光的荧光物质(即带有荧光团)。适宜的荧光团的实例包括荧光素及荧光素衍生物和类似物、吲哚菁绿，若丹明、三苯甲炔、聚甲炔、花青、酞花青，萘花青，部花青，镧系元素配合物(例如US-A-4859777中描述的)，或穴状化合物等，它们包括在600nm以上波长处具有最大发射的特定荧光团中(例如WO-A-92/08722中描述的荧光团)。其它标记物包括富洛伦尼斯(fullerenes)、oxatellurazoles(例如US-A-4599410中描述的)，LaJolla blue，卟啉及卟啉类似物(例如verdins、羟基茜草素、rhodins、perphycenes、texaphyrins、sapphyrins、rubyrins、苯并卟啉、photofrin、金属卟啉等)、和天然发色团/荧光团、如叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮、后胆色素类、光敏色素、藻胆色素、藻红素、藻青素，如retinoins和retinates这样的视黄酸及类似物。
一般来说，含有发色团的光标记物能显示出较大的摩尔吸光系数，例如＞105cm-1M-1，并在光窗600-1300nm内具有最大吸收。借助于吸收性能而用作噪声反射剂的颗粒应与之类似，优选具有大于105cm-1M-1的摩尔吸光系数，和在600-1300nm1范围内的最大吸收。对于荧光粒子来说，荧光量子产率是最重要的特性之一。它应该尽可能地高，不过，所需的荧光团的摩尔吸光系数也应大于105cm-1M-1，对于漫反射研究的最大吸收也应在600-130nm范围内，或对于表面研究来说，在400-1300nm范围内。
如果这些光标记的物质基本上是水不溶性的和生理上容许的，则它们可以用作固体或液体粒子，或者可以是与颗粒载体(例如无机或有机粒子或脂质体)共轭的或截留于其中的。这其中尤其为优选的是式I的轭合物I3Ph-L-C*(I)其中I3Ph为三碘苯基部分，L是连接部分，C*是发色团或荧光团(例如上面所描述的那些)。这样的化合物构成了本发明的另一方面内容。
I3Ph部分优选在3和5位上带有羧基或胺基的2，4，6三碘基或取代的这些基团，例如烷氧羰基、氨基羰基、烷基氨基羰基、烷氧羰基烷氧羰基、或烷基羰基氨基，其中烷基或亚烷基是羟基取代或不取代的，优选含有最多20个，一般是1-6个，最好是1-3个碳原子。连接基团L可以是任何能将基团C*连接到I3Ph部分上的基团，例如酰胺、胺、NHSO2或羧基或其硫代类似物；或C1-20亚烷基链其终端为这样的基团并带有或没有被硫杂或氧杂替代的1个或多个亚甲基以及被诸如硫、氧、羟基或烷基等取代或不取代。L基团的实例包括-NHSO2-和-CO2(CH2)2O-CS-NH-。
这样的化合物可以通过发色团或荧光团分子与Nycomed，SterlingWinthrop，或Bracco在他们的众多专利出版物中建议用作x-射线造影剂的三碘苯基化合物(例如US-A-5264610，US-A-5328404，US-A-5318767和US-A-5145684)共轭而制得。
在本发明一个具体的实施方案中，非光标记的粒子(例如聚合物或碘化x-射线造影剂)必须带有如荧光剂这样的光标记物的涂层或外壳，例如通过化学方法或物理化学方法将光标记物粘合到粒子上(例如使用电荷相反的光标记物和粒子)。所得涂覆的粒子，优选毫微级粒了尺寸(例如5-800nm，特别是10-500nm)，如果是以荧光团标记的，就可使该核芯所吸取的光能转移到发光表面，以增强荧光团发射的光。含有这样粒子的组合物构成了本发明的另一方面。
另外，光标记物可截留在固体聚合物基质中，例如通过聚合物和光标记物的共沉淀作用，或将光标记物沉积在多孔无机或有机基质的孔隙之中。
适于用作光标记物载体或核芯的有机聚合物基质基本上是水不溶性的生理上容许的聚合物，例如聚苯乙烯胶乳、聚交酯共乙交酯、多羟基丁酸酯共戍酸酯等。
在本发明光成像方法的造影剂中也可使用其它生理上可接受的粒子。优选的物质的基团是，例如可生物降解的聚合物粒子，聚合物或共聚物粒子，以及含有顺磁物质的粒子。这些粒子可以是，例如交联明胶粒子(JP60222046)，涂覆有亲水物质的粒子(JP48019720)，溴化全氟化碳乳剂(JP58110522)，全氟化碳乳剂(JP63060943)，口服粒子和乳剂(DE3246386)，聚合物粒子(WO8601524，DE3448010)，类脂泡(EP28917)，金属氧化物粒子(JP1274768)，金属铁传递蛋白葡聚糖粒子(US4735796)，单分散磁性聚合物粒子(WO8303920)，聚合物粒子(DE2751867)，含有顺磁金属化合物的微粒(US4,615,879)，含有顺磁物质的多孔粒子(SO8911874)，亲水聚合物粒子(CA1109792))，水可溶胀的聚合物粒子(DE2510221)，聚合物粒子(WO8502772)，金属负荷分子筛(WO9308846)，硫酸钡粒子(SU227529)，金属粒子(DE2142442)，交联聚糖粒子(NL7506757)，可生物降解的聚合物粒子(BE869107)，铌粒子(SU574205)，可生物降解的聚合物粒子(EP245820)，两性嵌段共聚物(EP166596)，大小均匀的粒子(PT80494)，有色粒子(WO9108776)，聚合物粒子(US5,041,310，WO9403269，WO9318070，EP520888，DE4232755)，多孔聚合物粒子(WO9104732)，聚糖粒子(EP184899)，类脂乳剂(SU1641280)，碳水化合物粒子(WO8400294)，聚腈基丙烯酸酯粒子(EP64967)，顺磁粒子(EP275215)，聚合物纳粒子(EP240424)，纳粒子(EP27596，EP499299)，纳胶囊(EP274961)，无机粒子(EP500023，US5,147,631，WO9116079)，聚合物粒子(EP514790)，磷灰石粒子(WO9307905)，颗粒微球(EP546939)，凝胶粒子(WO9310440)，亲水胶体(DE2515426)，颗粒聚电解质配合物(EP454044)，共聚物粒子(EP552802)，顺磁聚合物粒子(WO9222201)，亲水聚谷氨酸微胶囊(WO9402106)，和其它粒子(WO9402122，US4,997,454，WO9407417，EP28552，WO8603676，WO8807870，DE373809，US5,107,842，EP502814)。
一般来说，如果颗粒剂是准备用作非胃肠给药的(例如注入脉管系统)，则这些粒子在血液滞留时间要求长些，这可通过附着一种由Pilgrimm在US-A-5160725或Illum在US-A-4904479的实施例中描述的能延长血液滞留时间的聚合物，则可象期望的那样延长粒子的血液滞留时间。在血管系统以这种方式成像时，由于延迟了粒子经网状内皮系统的吸收，因此使成像变得更为方便。在使用脂质粒子的情况下，可将血液停留延长聚合物结合到预制脂质体上，或将其连接到脂质成膜分子上，可将其用作两性成膜成分，这样得到的脂质体表面带有亲水的滞留血液的聚合物成分。另一方面或另外，这些粒子也可以连接到生物靶基团上(例如WO-A-94/21240中描述的)，以使粒子能优先分布到预期的组织或器官，例如分布到肿瘤组织。
按照本发明所用的粒子大小将取决于粒子是非胃肠给药的，还是注入向外排空的体腔，同时还取决于粒子是否为光标记的。一般说来，粒子大小在5-1000nm范围内，特别是15-1500nm，最好是50-400nm；对于利用它们的散射作用的粒子来说，粒子大小优选在1/15-2λ范围内，或更优选1/10λ-λ，特别是λ/4π-λ/π，最好是约λ/2π(其中λ是成像技术中入射光的波长)。通过选择在大于血液最大吸收波长处可有效散射的粒子尺寸(例如在600-1000nm范围内)，并通过在这一范围波长内照射，可增强非光标记的粒子的造影功效。
以人或动物为对象用药时，粒子可适当地与惯用的药物或兽药载体或赋形剂配制在一起。按照本发明所用的造影剂可适当含有药物或兽药调剂辅佐剂，例如稳定剂、抗氧剂、渗克分子浓度调节剂、缓冲剂、pH调节剂、着色剂、香料、粘度调节剂等。它们可以适宜的非胃肠或小肠内给药形式给药，例如，注射或静脉输注或直接给药到带有外部排空导管的体腔中，例如胃肠道，膀胱和子宫。因此，本发明的造影剂可以是惯用的药物给药形式，象片剂，包衣片剂，胶囊，粉剂，溶液，悬浮液，分散体，糖浆，栓剂，乳剂，脂质体等；不过，一般优选的是如注射用水这样的生理上可接受的载体基质中的溶液、悬浮液和分散体。当配制的造影剂是用于胃肠外给药时，掺入粒子中的载体介质优选等渗的或稍微高渗的。
本造影剂可用于体内光学成像，特别是带有外部排空的器官或导管(例如胃肠道、子宫、膀胱等)、脉管系统、吞噬器官(例如肝、脾、淋巴结等)或肿瘤的光学成像。成像技术可以包括内窥镜检查，例如将光发射器和检测器插入腹腔、胃肠道等，并检测从器官或导管表面透射、散射或反射的光。在适当情况下，单色入射光可以用来检测暂时延迟光的发射(例如利用脉冲光选通检测)或检测波长不同于该入射光的光(例如造影剂中荧光团的最大发射波长)。与此类似，图像可以是所选目标的暂时成像，证明在该目标的位置有造影剂聚集或通过。所用的光可以是单色或多色的，连续或脉冲的；但一般优选单色光，例如激光。该光可以是紫外到近红外的，例如100-1300nm波长的，但优选波长在300nm以上，特别是600-1000nm的。
本发明的造影剂的粒子浓度一般为1·10-6g/ml-50·10-3g/ml，优选5·10-6g/ml-10·10-3g/ml。剂量为1·10-7g/kg-5·10-1/kg，优选1·10-6g/kg-5·10-2g/kg的，一般足以得到适当的造影，但通常优选剂量为1·10-4g/kg-1·10-2g/kg。
本文中所提到的各种出版物均引用作为参考文献。
本发明将通过下述非限制性的实施例来作进一步的阐述。百分数和比率都是按重量计，除非另有说明。实施例1含有脂质体的碘克沙醇按A.D.Bangham等人在“膜生物学方法”(E.D.Kom，ed).Plenum Press，NY.pp1-68(1974)中描述的“薄膜水合法”的改进方法制备平均直径300-600nm的脂质体。由该方法生产的一次最大批量为2.0L。在70℃水溶下，通过振摇使氢化磷脂酰胆碱(10g H-PC)和氢化磷脂酰丝氨酸(1g H-PS)溶于氯仿/甲醇/水(4∶1∶0.025，体积比)中。旋转式蒸发除溶剂，直到出现PLs的干燥混合物。在60-70℃下，将该磷脂混合物加入碘克沙醇和补剂的等渗水溶液中，并用混匀器将其搅匀(在65-70℃下，6000rpm搅10分钟)。所形成的脂质体通过3个聚碳酸酯滤器一次压出。将5.0ml该脂质体悬浮液装入20ml玻璃瓶中，用灰色橡胶塞盖住并用铝膜密封。用高压釜将该脂质体消毒灭菌(121℃，20分钟)。实施例2脂肪乳剂由下列物质制备水包油型乳剂豆油 10g红花油 10g卵磷脂 1.2g甘油 2.5g水调节渗克分子浓度至258mOsm/L，pH8.3-9.0(这样的乳剂可从Abbott Laboratories，Chicago，Ill，USA以商品名LiposynII购得)。可用生理盐水将其稀释到所需浓度。实施例3A.固体微粒以油酸和人血清清蛋白作为微泡外壳物质，制备粒子尺寸为1-12μm的充气(例如充空气)的微泡悬浮液。
用0.1N HCl将216ml的0.5％油酸钠水溶液样品滴定到pH3.9-4.0范围内。由于形成了油酸悬浮液，所以溶液变得非常混浊。用光学显微镜测得粒子大小在0.1微米范围内。
给该悬浮液加压以提高气体在该油酸悬浮液中的溶解度。将该悬浮液置于500ml装配有6个叶片的汽轮式高速搅拌机(来自Dispersimax)的高压釜(由Autoclave Engineers，Inc.制造的Zipperclave)中。将此容器密封并加载1000磅/平方英寸空气(一般压力范围是900-1100psig)。该悬浮液在室温下(23-25℃)以1000rpm(搅拌速度范围750-1500rpm)搅拌1小时。一般在搅拌过程中温度会升高2-3℃。搅拌停止后放空容器，悬浮液在使用前先放置30分钟。用光学显微镜测得粒子大小在0.1微米范围内。
将2g的25％人血清清蛋白(HSA)水溶液加入到28g水和20g上述乳剂中。将该混浊溶液加热到65℃，同时通入氧气。然后用Omni-搅拌器(匀化器)在中等沉降状态搅拌5分钟。将该泡沫混合物倒入分液漏斗并静置30分钟。将液体从底部放出并向该泡沫体中加入10ml新鲜的1％HSA溶液。30分钟后放出液体并加入10ml新鲜的5％HSA溶液，以使该泡沫体再次悬浮于溶液中。迅速从底部收集液体。粒子(微泡)直径为1-12微米，壁厚1-2微米。B.充气的微粒按照WO-A-95/01187，将人血清清蛋白水溶液与全氟烷烃(例如十二氟戊烷)这样的水不溶性气体混合，从而制得包在荚膜内的气体微球。实施例4聚合物粒子将生物可降解的聚合物聚羟基丁酸酯-共-戊酸酯溶解于合适的有机溶剂中，如丙酮、二氯甲烷等，在水中沉淀后，通过真空蒸馏或渗滤作用除去有机溶剂，从而制得聚合物粒子悬浮液。选择表面活性稳定剂，溶剂蒸发速率，搅拌作用等本领域技术人员熟知的条件，可选择所得粒子大小使之在0.05μm-10μm范围内。实施例5经或未经光标记的纳颗粒悬浮液将WIN 70177(按照下文实施例24制备的碘化造影剂)和含或不含荧光素(摩尔比为100∶1，较好50∶1，更好25∶1)的DMSO(或DMF)溶液在水中淀析。将所得沉淀物按US-A-5145684中描述的那样，与表面活性剂稳定剂(例如Pluronic F108或Tetronic T-908或1508)一起研磨，使粒子大小为0.2μm，并分散在含水介质中，使造影剂浓度为0.5-25％(重量)，表面活性剂含量为0.1-30％(重量)。也可包含US-A-5352459中公开的如聚乙二醇400(PEG400)或丙二醇这样的浊点调节剂，以确保高压釜稳定作用的稳定性。实施例6光标记的纳颗粒悬浮液将光敏色素加入十二烷基硫酸钠水溶液(pH＞10)中。将所得溶液加入含有表面活性剂(选自PVP，pluronics和tetronics)的乙酸的搅拌溶液中，并将该混合物渗滤以除去悬浮液中的可溶盐、过量酸等，得到10-100nm粒子的分散体。实施例7光标记的胶束将吲哚菁绿(ICG)(0.1-10％)与3％Pluronic F108水溶液混合形成过滤灭菌的胶束组合物。
所用的ICG含量可以是高的(70.5％)以生产混合胶束，或是低的(＜0.5％)以生产ICG的胶束溶液。优选ICG浓度为0.2-0.5％。实施例8光标记的脂质体用0.01M吲哚菁绿溶液和5-10％的磷脂(卵磷脂与二(十六烷酰)磷酯酰丝氨酸的比为10∶1)制备脂质体悬浮液。制备按常规技术(例如超声)进行，之后通过孔径可控的滤器挤压并进行渗滤或微流化作用。所得脂质体是蒸汽灭菌和无菌过滤的，已证明其在氮气下物理稳定性超过6个月。实施例9光标记的乳剂由10g红花油、10g芝麻油、1.2g卵磷脂、2.5g甘油、0.5-10g光标记物(例如荧光素或吲哚菁绿)和加到总量为100g的水制备水包油型乳剂。用常规方法进行乳化作用，所得乳剂通过0.2μm灭菌滤器进行过滤灭菌，或采用常规的蒸汽灭菌。实施例10颗粒性碘化化合物将WIN 70146(按照下面的实施例23制备的碘化x-射线造影剂)分别加到每个含有约12ml硅胶锆，1.1mm直径微球的3×1.5OZ棕色玻璃瓶中，加入量足以使终悬浮液达到15％(wt/vol％)。瓶A制成含3％(wt/vol％)Pluronic F-68，瓶B制成含3％(wt/vol％)Pluronic F-108，瓶C制成含3％(wt/vol％)Tetronic T-908。所得悬浮液以约150rpm共研磨9天，在不同区间测定的粒子大小值如下所示。
研磨天数平均粒径(nm)F-68 F-108T-9082 1939*158 1623 223 161 1627 157 158 1569 158 159 159室温下一周后166 166 161121℃高压灭菌20分钟后+181 190 183*在此时将二辛基硫代琥珀酸钠(DOSS)加入以使研磨量等于0.2％(wt/vol％)。+将DOSS加到用高压灭菌的F108和T908样品中，作为浊点调节剂(0.2％wt/vol％)。
这些数据表明用这种试剂(即WIN 70146)在F108和T908中制备小粒子极其容易，且对热(高压，灭菌)和搁置时间非常稳定。实施例11WIN 70146在Pluronic F108中的纳粒子悬浮液制剂和急性安全性试验按照实施例10制得WIN 70146，并以3ml/kg、15ml/kg和30ml/kg(即0.45gm/kg，2.25gm/kg和4.5gm/kg)的剂量注射入小鼠尾静脉。在7天期间内，没有看到注射不同剂量的任何一只小鼠有不适当的反应，之后将这些动物处死。肉眼观察这些动物，没有显示任何明显伤痕或外形损伤。
对小鼠做进一步的深度安全性研究，没有显示出显著的安全性问题，这是由于WIN 70146/F108的单个剂量浓度小于等于30ml/kg(4.5gm/kg)。这些研究包括了深度组织病理学，临床化学，以及生命活动观测。实施例12WIN 70146在Pluronic F108(1-404)中的制剂在无菌条件下，将WIN 70146与1.1mm直径的硅酸锆微球一起研磨3天。在4％Pluronic F-108存在的条件下，这一试剂的浓度为15％WIN70146。不再加另外的盐或表面活性剂。通过光散射作用测得所得纳粒子悬浮液的平均粒子大小为162nm。实施例13利用Pluronic F-108和PEG400制备高压灭菌的WIN 70146制剂在Pluronic F-108存在下，将WIN 70146与1.1mm直径的硅酸锆微球一起研磨3天。最终粒子大小测定为235nm。在这时向该悬浮液中加入无菌PEG400，这一操作完成后，该制剂含有15％(wt/vol％)WIN 70146，3％(wt/vol％)Pluronic F-108和10％PEG400。然后将这种制剂在标准条件下高压灭菌(即121℃，20分钟)，得到最终粒子大小为248nm。实施例14用WIN 70146的纳粒子悬浮液证明入射波长600nm以上的光散射象实施例10中那样，用4.25％F108/10％PEG400制备WIN 70146的纳粒子悬浮液，高压热处理后得到的粒子平均直径为228nm。然后将该悬浮液用水稀释到不同浓度，列表如下。然后检测每个悬浮液在各个波长处入射光透射的百分率(见下表)。之后加入甲醇使悬浮液溶解，以等量溶剂作为空白对照，检测透射光百分率。结果如下纳颗粒性WIN 70146和 溶解的WIN 70146在632nm，700nm和820nm处的透射百分率样品浓度 ％T悬浮液 ％T溶液632nm 700nm 820nm 632nm700nm 820nm0.015％ 54.764.577.0100.4100.3 100.50.0375％25.436.653.899.9 99.999.90.075％ 7.7 15.431.899.9 99.899.90.150％ 0.5 1.9 8.6 41.4*51.9*66.2*0.300％ 0.0 0.1 0.8 1.2*4.0*13.5**这些样品未完全溶解，可看到混浊这些结果证明该悬浮液是有效的光散射剂，在这些波长区域内不吸收大量入射光(即溶解的WIN 70146不吸收600nm以上光)。对溶解的试剂的吸收与波长的关系作进一步检测表明没有吸收600-800nm的光，而由于入射光的散射，使得纳粒子试剂显示出典型的吸收衰减。实施例15WIN 70177的纳粒子悬浮液的制备将WIN 70177(按照实施例24制备的碘化x-射线造影剂)的制剂制备成15gmWIN 70177/100ml悬浮液和4.25gm Pluronic F108/100ml悬浮液和10gmPEG400/100ml悬浮液。这些悬浮液研磨5天后，通过光散射测得平均粒子大小为约235nm。在新鲜大鼠血浆和模拟胃液中进行稳定性试验，没有出现任何凝聚现象。实施例16纳颗粒性WIN 70177在600nm入射波长以上光散射的验证如实施例15中那样，用4.25％F108/10％PEG400制备WIN 70177的纳粒子悬浮液，高压灭菌后所得粒子平均直径为236nm。然后将该悬浮液用水稀释到不同浓度，列表如下。之后测定每份悬浮液在不同波长处入射光的透射百分率(见下表)。再加入甲醇使该悬浮液溶解，以等量溶剂作空白，测定透射光百分率。结果如下。
纳颗粒性WIN 70177和溶解的WIN 70177在632nm和700nm处的透射百分率样品浓度 ％T悬浮液 ％T溶液632nm 700nm 800nm632nm700nm800nm0.015％53.362.873.1 102.2101.9101.80.0375％ 34.645.759.1 102.3101.9101.80.075％25.836.851.1 100.9100.8101.00.150％6.7 13.626.3 59.5*67.8*77.0*0.300％0.1 0.6 3.2 7.4*14.4*26.8**没有完全溶解；粒子仍然存在。
这些数据证明了粒状WIN 70177的散射能力，而溶解物质对所检测的波长光不吸收任何能量。另外，对粒状WIN 70177的吸收和溶解的WIN 70177吸收的检测表明颗粒性物质的对光的吸收随波长呈指数下降，正如人们所预料的这是由于悬浮粒子引起散射的结果；而可溶性物质在所有情况下，即使5倍浓度，实际上也都没有吸收。实施例17WIN 67722的纳粒子悬浮液的制备如实施例1那样，用3％Pluronic F108和15％PEG1450制备WIN67722(US-A-5322679中描述的碘化x-射线造影剂)制剂。该悬浮液研磨3天，用Coulter N4MD粒子大小测定仪通过光散射作用测得粒子大小为213nm(小部分为537nm)。实施例18纳颗粒性WIN 67722在600nm以上入射波长处光散射的验证如实施例17那样，用3％Pluronic F108和15％PEG1450制备WIN 67722的纳粒子悬浮液，高压灭菌后得到粒子平均直径为214nm。将该悬浮液用水稀释到下面表中所列的不同浓度。然后测定每份悬浮液在几个波长处(见下表)入射光透射百分率。加入甲醇使该悬浮液溶解，以等量溶剂为空白，测定透射光百分率。结果如下。
纳颗粒性WIN 67722和溶解的WIN 67722在632nm和700nm处的透射百分率样品浓度 ％T悬浮液 ％T溶液632nm 700nm 820nm 632nm 700nm820nm0.015％47.957.169.299.9 99.9 100.60.0375％ 20.529.945.6100.2 100.2100.40.075％4.8 9.9 22.1100.1 100.2100.40.150％0.2 1.0 4.9 48.2*55.3*65.5*0.300％0.0 0.0 0.2 1.3*3.5*10.7**没有完全溶解；仍存在粒子这些数据证明了粒状WIN 67722的散射能力，而溶解物质对所检测波长以上的光不吸收任何能量。另外，对粒状WIN 67722的吸收和溶解的WIN67722的吸收的检测表明颗粒物质的对光吸收随波长呈指数下降预计这是由于悬浮粒子散射的结果；而可溶性物质在所有情况下即使5倍浓度也没有吸收。实施例19WIN 72115的纳粒子悬浮液的制备WIN 72115与Pluronic F108(BASF，Parsippany，NJ)在玻璃瓶中，以15gm/100ml悬浮液浓度和3gm/100ml悬浮液浓度合并，从而制得纳粒子WIN72115(下面的实施例21中描述的荧光碘化造影剂)。然后将该瓶用1.0mm直径硅酸锆微球填充到一半并加入足够的水，达到如上所述的试剂/表面活性剂的所需浓度。或者，表面活性剂(有或没有通过0.2微米过滤器进行无菌过滤)在加入瓶中以前，可先溶于水中。
然后转动该瓶转动，转速要足以使瓶中的小球顺着瓶壁“阶梯式”下降，转动时间不少于24小时或超过14天(参见US-A-5145684)。循环研磨后，从瓶中收取该物质，并与研磨微球分离开。
以这种方式制备的WIN 72115纳粒子由光散射作用测得的平均粒子大小为225nm。
将WIN 72115设计成用氩离子激光(绿色，接近514nm)发射的光激发的，发射的波长高于这一值。因此，注射后，带有绿光病人的发光将激发用于诊断目的而波长稍不同的光的发射。这一试剂的关键特征在于它可制备成纳粒子，在脉管系统中停留15分钟以上，并产生光学成像的散射和荧光造影。
也可用下面的实施例22的光标记的试剂代替WIN 72115。实施例20从聚合物粒子散射光-对粒子大小和浓度的依赖性将聚苯乙烯胶乳粒子的三个样品稀释到不同程度，并检测它们在几个不同波长处对透射光的影响。结果证明粒子越大，浓度越高，则入射光的散射越好。
样品浓度透射百分率(wt/vol％)600nm 700nm 820nm170nm .0025 97.9 98.3 98.7.02594.8 96.3 97.4.07589.3 92.8 95.2300nm .0025 99.3 99.5 99.6.02592.4 94.5 95.8.07583.1 88.3 91.8500nm .0025 98.8 99.1 99.4.02588.1 91.4 93.9.07568.3 76.5 83.0实施例213-(N-乙酰基-N-乙氨基)-5-[(5-二甲氨基-1-萘基磺酰基)氨基]-2，4，6-三碘苯甲酸乙酯(WIN 72115)向在冰浴上冷却的、搅拌的3-(N-乙酰基-N-乙氨基)-5-氨基]-2，4，6-三碘苯甲酸乙酯(11.6g，18.5mmol)的吡啶(75ml)溶液中加入60％NaH/油分散体(1.8g，46.3mmol)。NaH与氨基反应后，加入丹磺酰氯(5g，18.8mmol)。所得反应混合物在冰浴中搅拌4小时，在室温下搅拌20小时。用乙酸(10ml)终止反应后，在旋转式蒸发器上浓缩该棕色溶液。棕色残余物首先用己烷洗涤，然后在水中(200ml)淤浆。所得污黄色胶质固体经收集后，用水洗涤，干燥，并从乙醇结晶，得到5.3g(33％)亮黄色晶体mp 238-240℃，ms(FAB)862(90％，MH).C25H26I3N3O5S计算值C，34.86；H，3.05；N，4.88；I，44.20.
实测值C，34.91；H，3.02；N，4.74；I，44.53.1H-NMR和13C-NMR谱符合下列结构
实施例222-(3，5-双乙酰氨基-2，4，6-三碘苯甲酸基)乙基N-荧光素硫代甲氨酸酯将2-羟乙基-3，5-(双乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酸酯(0.658g，1mmol)，异硫氰酸荧光素(0.389g，1mmol)，60％NaH/油分散体(0.24g，6mmol)和DMF(25ml)的混合物在室温下搅拌26小时后，用6N HCl(2.5ml)终止反应。所得混合物在旋转式蒸发器上减压浓缩。黄色固体残余物用水洗涤，并从DMF重结晶，得到产率为65％的黄色晶体产物。元素分析和光谱数据符合下述结构
实施例233，5-双(乙酰氨基)-2，4，6-三碘-1-(乙氧羰基)苯甲酸戊酯(WIN 70146)在室温下，向泛影酸钠(150g，235.2mmol)的干燥DMF(1200ml)搅拌溶液中加入2-溴己酸乙酯(63.8g，285.8mmole，1.09eq.)。该溶液在90℃加热过夜，然后冷却到60℃。边搅拌边将该反应混合物倒入20l水中。所得白色沉淀经过滤收集后，在90℃、高真空下干燥。粗物质从DMF/水重结晶，干燥后，得到分析纯产物，mp263-265℃。MS和1H-NMR(300MHz)谱数据与预期结构一致。C19H23I3N2O6计算值C 30.15，H 3.04，N 3.70，I 50.35实测值C 30.22，H 3.00，N 3.66，I 50.19实施例24[[3.5-双(乙酰氨基)-2，4，6-三碘苯甲酰基]氧]甲基-双(1-甲乙基)丙二酸酯(WIN 70177)在室温下，和泛影酸钠(393g，616mmol)在500ml DMSO中的搅拌混合物中加入173g(616mmol)2-溴-2-甲基丙二酸二异丙酯，在氩气氛下将该溶液在90-100℃加热56小时。冷却后，边在上面用机械搅拌，边将溶液缓慢加入10升水中。沉淀的固体沉降6小时后过滤收集。粗产物用水(4升)充分洗涤后在室温下干燥过夜。该固体用碳酸氢钾溶液(3g溶于含有15ml异丙醇的700ml水中)、水加热浸提后，空气干燥12小时。从DMF重结晶后，用水洗涤，并在高真空下干燥，得到255g(51％)分析纯产物，mp258-260℃。MS和1H-NMR(300MHz)谱数据与预期结构相一致。C21H25I3N2O8计算值C 30.98，H 3.10，N 3.44，I 46.76实测值C 30.96，H 3.00，N 3.44，I 46.77实施例25体内光学成像研究A.颗粒性散射剂给后侧腹植入了肝细胞9L肿瘤的白鼠注射40％(wt/vol％)碘克沙醇溶液中形成的多层脂质体悬浮液。对该注射作用的成像是在宾夕法尼亚大学Dr.Britton Chance的实验室中进行的，利用时间门控二极管激光器在780nm处入射，用纤维光缆和相敏检测设备在与入射光成180°处检测散射组分。在所给剂量(即3ml/kg)下，肿瘤中的脂质体粒子增强的散射超过背景信号4倍以上。尽管不是最好的，但这些数据表明了散射剂用于光学成像造影的可行性。B.用于光学成像造影的荧光粒子在0.7微克/毫克吲哚菁绿(ICG)存在下，制备脂质体的悬浮液，并用蒸汽和压力灭菌。用Horiba 910粒子大小测试仪通过光散射测得所得粒子平均直径约120nm。注射入大鼠侧腹肿瘤模型中后，这些脂质体在肿瘤的荧光剂(即ICG)中停留时间明显长于在仅有ICG单一溶液的肿瘤中的停留时间。这一点对于成像来说，可应用信号平均技术来增强图像，并标记出渗漏的脉管系统部位是有用的。这些研究也是在宾夕法尼亚大学Dr.Britton Chance的实验室中完成的。
权利要求
1.通过光学成像使人或非人动物体产生图像的方法，其特征在于，给所述躯体使用生理上容许的颗粒性造影剂，使至少有部分所述躯体生成图像。
2.按照权利要求1所述的方法，其中所述图像是空间图像。
3.按照权利要求1所述的方法，其中所述图像是时间图像。
4.按照权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述图像是光通过至少部分所述躯体透射产生的。
5.按照权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述图像是光从至少部分所述躯体上反射产生的。
6.按照权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述图像是由所述试剂发射的荧光而产生的。
7.按照权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述图像是由所述试剂发射的磷光产生的。
8.按照上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述图像是所述躯体中脉管系统的图像。
9.按照上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述图像是所述躯体中吞噬器官的图像。
10.按照权利要求1-9中任一项所述的方法，其中光是发射并用内窥镜检测的。
11.按照权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述躯体是用单色光照射的。
12.按照权利要求1中所述的方法，其中所述颗粒剂的粒子大小为λ/4π-λ/π，其中λ是所述单色光的波长。
13.按照权利要求12所述的方法，其中所述粒子大小约为λ/2π。
14.按照权利要求1-5和8-13中任一项所述的方法，其中所述颗粒剂不是光标记的。
15.按照权利要求14所述的方法，其中所述试剂包含气体微泡。
16.按照权利要求14所述的方法，其中所述试剂包含固体或液体粒子。
17.按照权利要求14所述的方法，其中所述试剂包含脂质体。
18.按照权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述颗粒剂包含摩尔吸收度至少为105cm-1M-1并在300-1300nm范围内有最大吸收的光标记物。
19.按照权利要求18所述的方法，其中所述颗粒剂包含脂质体。
20.按照权利要求18所述的方法，其中所述颗粒剂包含固体或液体粒子。
21.按照权利要求18所述的方法，其中所述颗粒剂包含用所述光标记物包覆的固体粒子。
22.按照权利要求18所述的方法，其中所述颗粒剂包含胶束。
23.生理上容许的颗粒物质在制备含有体内光学成像诊断用的颗粒性造影剂中的应用。
24.按照权利要求23所述的用途，用于成像过程中用的造影媒质的制备，包括权利要求1-22中任一项所述的方法。
25.一种诊断成像组合物，包括含有固体粒子的生理上容许的颗粒剂，该固体粒子包覆有摩尔吸收度至少为105cm-1M-1在300-1300nm内有最大吸收的光标记物。
26.权利要求1-22中任一项定义的试剂在体内用光谱诊断疾病中的应用。
全文摘要
本发明涉及颗粒性物质在体内的光学成像中作为造影剂的应用。
文档编号A61K49/00GK1179108SQ9619266
公开日1998年4月15日 申请日期1996年2月2日 优先权日1996年2月2日
发明者乔·克莱文尼斯, 比乔恩·富格拉斯, 帕尔·罗格维德, 埃德温·约翰尼森, 保罗·M·亨利希斯, 沃尔夫冈·H·H·冈瑟, 爱德华·R·培根, 约翰·L·托纳, 格雷戈里·L·麦金太尔 申请人:耐克麦德英梅金公司