专利名称：：消炎药的制作方法
技术领域：
：本发明涉及消炎药，具体涉及抗诸如迁延性炎性反应(慢性进展性炎症)或有免疫机制参与的炎性反应。更具体地说，本发明涉及一种增强免疫抑制剂消炎作用的增效剂，或者是一种加强消炎作用的药物。本发明可以预防和治疗诸如肾小球性肾炎、胶原性疾病或其相关疾病、顽固性脉管炎、伴随有炎症发生的免疫异常或自身免疫等疾病的发生和/或发展。
背景技术：
：有免疫机制参与的炎症，例如肾小球性肾炎、胶原性疾病或其相关疾病、顽固性脉管炎、伴随有炎症发生的免疫异常或自身免疫疾病等，通常通过反复急性发作而呈慢性发展，如果不加以治疗，则会导致器官损伤，造成肾功能衰竭或其它器官衰竭，并最终导致死亡。大多数这类慢性进展性炎症是难治疗的，发病原因曾被认为是免疫功能异常以及相伴随的炎性介体的不断激活。人们已经研究了针对这些病因的疗法。例如，对于免疫功能异常，通常以常规方法或在抢救静脉输注疗法(脉冲疗法)中使用肾上腺皮质类甾醇、环磷酰胺、咪唑立宾、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤等免疫抑制剂。但是，肾上腺皮质类甾醇具有严重的副作用，例如肾功能抑制、易感染性、消化道溃疡、高血压、骨质疏松等。此外，其它免疫抑制剂也表现出极为严重的副作用，例如骨髓抑制、引发胃肠功能紊乱、肝损伤、间质性肺炎、肾紊乱或出血性膀胱炎等。而且，由于此类药物疗法不是针对病因的疗法，并且是通过长期使用某种药物来进行并由此导致严重的副作用，这会造成极其严重的问题。而且，以上疾病中有些是具有药物抗性的。对抗那些主要损伤为肾炎或脉管炎的疾病可以使用抗血小板药或抗凝药。但是，在使用肝素或华法林(商品名即通用名华法林钾(Warfarinpotassium))等抗凝药时，必须注意防止出血副作用。对于抗血小板药也必须考虑出血的危险性。由于在胶原性疾病中有许多病人的血小板水平下降，例如系统性红斑狼疮(SLE)，或者，许多病人发生了肺出血，例如伴随有肾小球性肾炎的Goodpasture综合征，所以在上述病症中很难使用抗血小板药。此外，虽然最近有报道称，肝素或低分子量肝素可有效预防伴发SLE的肾炎(日本待审专利申请40327/1990，ArthritisRheum.33，1554，1990)，根据本发明后文的试验结果，效果并不确定。本发明的说明有免疫机制参与的炎症，例如肾小球性肾炎、胶原性疾病或其相关疾病、顽固性脉管炎、伴随有炎症发生的免疫异常或自身免疫性疾患包括前文所述的SLE。考虑到上述情况，并用MRL小鼠(IzuiS.等，鼠类系统性红斑狼疮的基因调控机制，《系统性红斑狼疮》(SystemicLupusErythematosus)，pp.3-12，PeterA.编写，Miescher，Springer-VerlagBerlin，1995)作为SLE的动物模型考察了硫酸皮肤素或其药学上认可的盐对此类炎性疾病的作用后，本发明发现，该化合物不仅抑制炎性反应并减缓疾病的发展，而且具有良好的安全性，可长期使用。而且，还使用人多发性硬化症动物模型、患试验性变应性脑脊髓炎的大鼠作为免疫机制参与的另一种炎症的实例考察了硫酸皮肤素的作用，发现对这些疾病同样有效。在多种类型的硫酸皮肤素中，某种具有特定物理特性或特定来源的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐被发现其血清浓度能够维持较长的时间，因而是较好的。即，我们发现，适用于本发明的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐包含2-9％，更好的是3-8％Di-0S(ΔHexAL→3GalNAc)；特性粘度(100ml/g)为0.8-2.0；利用高效液相色谱通过凝胶渗透法，以已知分子量的葡糖胺聚糖作为标准物测得的分子量为25,000-100,000，30,000-60,000更好(参见实施例1，(1)《生物化学生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta.)1117，60-70，1992中所述的分子量测定方法)；或者是来自鸡冠(cerst)的硫酸皮肤素。本发明是基于以上结果完成的。本发明的目的之一是提供一种利用硫酸皮肤素或其药学上认可的盐的消炎作用的消炎药，它具有优良的消炎作用，对于预防和治疗顽固性炎症，例如与免疫机制或迁延性炎性反应相关的肾小球性肾炎、胶原性疾病或其相关疾病、顽固性脉管炎、伴随有炎症发生的免疫异常或自身免疫疾病等尤其有效。本发明的另一目的是提供一种与具有硫酸基团的葡糖胺聚糖合用加强免疫抑制剂消炎效果的药物。本发明涉及包含上述硫酸皮肤素或其药学上认可的盐作为有效成份的消炎药。具体地说，本发明涉及的包含硫酸皮肤素作为有效成份的消炎药表现出对迁延性炎症或涉及免疫机制的炎症，例如伴发自身免疫疾病的炎症，具有消炎作用。更具体地说，本发明涉及用于伴发多发性硬化症的炎症、胶原性疾病或其相关疾病、肾小球性肾炎、顽固性脉管炎等的消炎药。此外，本发明还涉及包含具有特定物理特性或特定来源的硫酸皮肤素或其药学上认可盐的消炎药。而且，本发明还涉及一种增效剂，它增强免疫抑制剂的效果，并包含具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐作为有效成份。本发明还涉及增强免疫抑制剂效果的药物，它包含具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐和免疫抑制性化合物(免疫抑制剂)。作为与免疫抑制剂合用的具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖。本发明列举了硫酸皮肤素、硫酸肝素、肝素、硫酸软骨素和硫酸胶质素。其中，较好的是硫酸皮肤素，前文所述具有特定物理特性或特定来源的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐更好。图l显示使用不同来源硫酸皮肤素之后，大鼠血液中硫酸皮肤素浓度测定的结果(残余率)。图中，○表示来自鸡冠(crest)的硫酸皮肤素，●表示来自牛肠的硫酸皮肤素，×表示○和●的交点。图2显示在实施例1中，在小鼠体内，硫酸皮肤素对血液凝聚的作用。图中，○代表使用低分子量肝素，●代表使用硫酸皮肤素。图3显示在实施例2中，在小鼠体内，硫酸皮肤素对反映肾功能的血清成份的血清水平的作用。“a”代表BUN的分析结果，b代表肌酸酐的分析结果。b中的*代表用Bonferroni检查法测得p＜0.05的显著差异。图4显示的是组织学显微照片，显示使用了硫酸皮肤素后小鼠肾脏的尸体剖检(放大500倍，短横-为10微米)。“a”代表正常的肾组织，b代表有MC(最小改变)的肾组织，c代表对应于WHO定义的弥漫性肾小球性肾炎中的增殖性肾小球性肾炎、并为功能障碍的DP肾组织。图5显示在实施例2中，将硫酸皮肤素用于小鼠时，异常肾小球的比例。“a”代表(最小改变)MC肾小球数量与肾小球总数之比，b表示DP肾小球数量与肾小球总数之比。图6显示的是组织学显微照片，显示在实施例2中对小鼠使用硫酸皮肤素后的肾动脉(放大204倍，-(短横)为50微米)。“a”表示正常对照的组织学，b、c和d分别表示轻度、中度和严重脉管炎的组织学。图7显示在实施例2中对小鼠使用硫酸皮肤素后血液中血纤维蛋白原的分析结果。图8显示在实施例3中对小鼠合用硫酸皮肤素(25mg/kg)和不同剂量的环磷酰胺以及单独使用环磷酰胺后对血清肌酐的影响。DS表示硫酸皮肤素，End表示环磷酰胺。*表示用Bonferroni检查法测得的p＜0.05的显著差异。图9显示在实施例3中对小鼠单独或合用硫酸皮肤素(25mg/kg)和不同剂量的环磷酰胺后对脾脏重量的作用。DS表示硫酸皮肤素，End表示环磷酰胺。图10显示在实施例3中对小鼠单独或合用硫酸皮肤素(25mg/kg)和不同剂量的环磷酰胺后对肠淋巴结重量的作用。**表示用Bonferroni检查具有显著差异p＜0.01。本发明的最佳实施方式硫酸皮肤素主要包含由N-乙酰基-D-半乳糖胺-4-硫酸和L-艾杜糖醛酸和少量D-葡糖醛酸构成的二糖重复结构(Ido-CalNAc)。根据动物种属、组织或器官的不同，硫酸皮肤素的硫酸根含量、硫酸根的连接位置和D-葡糖醛酸的含量各不相同。通常，用下列原料来制备硫酸皮肤素，例如牛、猪、马、绵羊、山羊、兔等哺乳动物或鸡、鸭、鹅等禽类的肠粘膜、皮肤、肺、肾、肝、胰脏、动脉、脾脏、脑、胸腺、软骨、冠等。作为用于本发明的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐，(下文除非特别指出，“硫酸皮肤素”包括其药学上认可的盐)，本领域已知可以使用的任何化合物都可使用，对其物理特性和来源没有限定。本发明所举的实例为来自例如动物(哺乳动物及鸟类等)器官(肠、皮肤、肾、血管)，更具体地说是来自鸡冠、牛肠、猪肠、猪皮、牛肾、猪肾、牛主动脉，并具有表1所示物理特性(平均分子量、特性粘度、二糖含量)的化合物。具有较低分子量即1,600-10,000的硫酸皮肤素是已知的(参见Dol，F.等，《临床医学实验室杂志》(J.Lab.Clin.Med.)1990，第115卷，43-51或Bianchini，P.等，《凝血酶与止血法》(ThrombosisandHaemostasis)，1991，第65卷，1315或Barbanti.M.等，1993，第69卷，147-151)，可用于本发明。本发明中的二糖含量是由本领域已知方法测得的不饱和二糖的含量(％)，该方法中，硫酸皮肤<p>表4上述硫酸皮肤素都可用于本发明，但是可以优选以下硫酸皮肤素，它们具有特定物理特性和来源的，具有在血液中的活性周期长、出血等副作用少的特点(1)ΔDi-0S(ΔHexAl→3GalNAc)含量为2-9％，3-8％更好；(2)特性粘度(100ml/g)为0.8-2.0；(3)利用高性能液相色谱通过凝胶渗透法，以已知分子量的葡糖胺聚糖作为标准物测得的分子量为25,000-100,000，30,000-60,000更好(参见实施例1，(1)《生物化学生物物理学学报》(Biochim.Biophys.Acta.)1117，60-70，1992中所述的分子量测定方法)；(4)或者是来自鸡冠的硫酸皮肤素。更优选的是有上述四个特征的硫酸皮肤素或其等同物。本发明发明者以按照专利申请说明书(参见PCT国际公开，WO95/09188)中的方法制备的硫酸皮肤素钠盐(表1)作为这类硫酸皮肤素的实例。经尾静脉对SD雄性大鼠给药来自鸡冠和牛肠的硫酸皮肤素(WO95/09188中的参照实施例2)，测定硫酸皮肤素在血液中残留水平随时间的改变，并计算相对给药时硫酸皮肤素初始水平的残留率(参见上述国际公开中的实施例1)。图1显示了这两种化合物在血液中残留率随时间的改变。图中，○表示来自鸡冠的硫酸皮肤素，●表示来自牛肠的硫酸皮肤素。图1显示的结果为，给药5分钟后，来自鸡冠的硫酸皮肤素的残留率是来自牛肠的硫酸皮肤素的两倍，即使在120分钟后，来自鸡冠的硫酸皮肤素仍残留约10％，而来自牛肠的硫酸皮肤素则很难测得。所以，由于来自鸡冠或具有与之相当的物理特性的硫酸皮肤素在血液中具有很长的活性周期，因而有持续的消炎效果，所以，在治疗中不需要很大的剂量，因而来自鸡冠(crest)或具有与之相当的物理特性的硫酸皮肤素是最好的。作为本发明的消炎药，可以使用硫酸皮肤素药学上认可的盐。虽然对这类盐没有特别限定，但是优选的是钠盐、钾盐、锂盐或钙盐、其中最常使用的是钠盐。硫酸皮肤素通常经静脉给药，但是在必要时也可以经动脉内、肌内或经皮给药。可以将其与合适的可认可的辅助成份混合制备成滴眼液，并用于滴注。也可以与合适的基料混合将其制备成膏剂或霜剂，涂在皮肤或粘膜上。此外，还可以利用可分开的剂量形式制备口用药物。为了制备本发明的药剂，即一种消炎药、或消炎增效药，可以适当将有效量的硫酸皮肤素或具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖和/或免疫抑制化合物(免疫抑制剂)与常用稳定剂、乳化剂、等渗剂和/或pH调节之类的辅助成份合用，以上辅助成份都是医学上认可的。硫酸皮肤素或其药学上认可的盐的成人日用量是50-3,000mg。以上剂量可以一次性给药，也可以分2次以上给药，或可持续数天进行连续输注。此外，具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖与免疫抑制剂合用可以显著加强免疫抑制剂的消炎效果，并减少免疫抑制剂的用量。结果，由此减轻了因为使用免疫抑制剂造成的免疫抑制剂的严重副作用。所以，包含具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖为有效成份的药物能够增强免疫抑制剂的消炎效果，可以用作增强免疫抑制剂消炎效果并减少其用量的药物，减轻免疫抑制剂副作用的药物，或是与免疫抑制剂合用后加强其消炎效果并减少其用量的药物。作为与免疫抑制剂合用的具有硫酸根的葡糖胺聚糖，尤其好的是具有前文所述物理特性和来源的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐。只要具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖和免疫抑制剂是用于同一个体(病人)，对其合用形式(给药时间，给药途径)并没有限制，在这些形式中，可以单独制备包含单独有效成份的药物，而包含具有硫酸根的葡糖胺聚糖的药物可以在免疫抑制剂给药之前或之后给药，或者，也可以制备和给药包含以上两种成份的药物组合物。更具体地说，具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐可以制备成输注形式的，而免疫抑制剂可以制备成口服或输注形式的。与具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖合用的免疫抑制剂的剂量取决于免疫抑制剂的种类、病人的情况(年龄、性别、疾病类型、严重程度等)、给药方法(给药途径、剂型等)，不可一概而论，但是通常以免疫抑制剂单用剂量的30-70％为佳。作为与消炎效果增效剂或具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖合用的免疫抑制性化合物或免疫抑制剂，可以使用任何具有消炎效果的、任何市售的或者已知的免疫抑制剂(参见“今日治疗方法(1994)”(“Today’sremedy(1994)”)，1994，Nankodopubl；157-161p“免疫抑制剂”“Immunosuppressants”，和162-183p，“肾上腺皮质类甾醇”“Adrenocorticalsteroid”)。免疫抑制剂或免疫抑制性化合物的实例有肾上腺皮质类甾醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、咪唑立宾、cyc1osporine、甲氨蝶呤、tacrolimushydrate等。典型的肾上腺皮质类甾醇的实例有泼尼松龙、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、帕拉米松、曲安西龙、氢化可的松和乙酸可的松。本发明的消炎药表现出对伴发以下疾病的炎症的消炎效果，可以预防、治疗或缓解包括人在内的哺乳动物(包括人在内的灵长目动物；狗、猫等宠物；牛、猪、马等牲畜)和禽类(鸡等)的这些疾病。(1)肾小球性肾炎根据WHO的分类(Churg，J.&Sokin，LH；“肾脏疾病分类及肾小球性疾病图谱”“Renaldiseaseclassificationandatlasofglomerulardisease”，TokyoandNewYork，Igaku-shion，1982)，肾小球性肾炎分为(1)原发性肾小球性疾病，(2)系统性疾病中的肾小球性肾炎，(3)血管性疾病中的肾小球损伤，(4)代谢性疾病中的肾小球损伤，(5)遗传性肾病变，(6)混合性肾小球性疾病，(7)末期肾和(8)移植后的肾小球损伤。本发明的消炎药对以上(1)所述的原发性肾小球性疾病(A.轻度肾小球异常，B.局灶性/节段性损伤，C.弥漫性肾小球性肾炎和D.未分类的肾小球性肾炎)有效和(2)系统性疾病中的肾小球性肾炎中具体的某些疾病(红斑狼疮性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病(Berger疾病)，Goodpasture综合征)有效。此外，它对(3)血管性疾病中的肾小球损伤(结节性动脉周炎，Wegener肉芽肿病，血栓形成性微循环异常症，肾小球性血栓形成，良性肾硬化，恶性肾硬化和硬皮病)和(8)移植后的肾小球损伤有效。(2)胶原性疾病及其相关疾病胶原性疾病及其相关疾病是指美国风湿病学协会(AmericanRheumatologyAssociation)(Decher，J.L.等，风湿性关节炎(ArthritisRheum.)26，1029，1983)分类的弥漫性结缔组织疾病。属于以上分类的疾病包括风湿性关节炎、青少年性关节炎、红斑狼疮、硬皮病、弥漫性筋膜炎、多肌炎、坏死性血管炎以及其它形式的血管病(结节性多发动脉炎、变应性肉芽肿病、超敏性脉管炎、肉芽肿性动脉炎、Kawasaki病，Behcet病等)，Sjogren综合征，Overlap综合征，以及其它(风湿性多肌痛、复发性脂膜炎、复发性多软骨炎、淋巴瘤样肉芽肿病、结节性红斑等)。此外还包括由以上疾病引起的肾小球性肾炎和脉管炎。本发明的消炎药对以上疾病有效。而且这些药物对人自身免疫淋巴增殖性综合征(《细胞》(Cell)81，935-946(1995)，《科学》(Science)268，1347-1349(1995))也有效。(3)顽固性脉管炎根据Fauci，AS(“脉管炎综合征。Harrison的内科医学原理”(Thevasculitissyndrome.Harrison’sPrincipleofInternalMedicine)，第11版，McGraw-HillCompany，1986)，顽固性脉管炎分为系统性坏死性脉管炎(古典多发动脉炎、变应性肉芽肿性脉管炎(Churg-Strauss综合征)、结节性多发动脉炎复杂综合征)，超敏性脉管炎(已证实或怀疑是外源性刺激引起的；Schoenlein-Henoch紫癜，血清病或血清病样反应，其它药物诱导的脉管炎，与感染性疾病相关的脉管炎，很可能涉及内生抗原；与肿瘤相关的脉管炎，与连接组织相关的脉管炎，与其它潜伏疾病相关的脉管炎，与补体系统先天缺陷相关的脉管炎)，Wegener肉芽肿病，巨细胞性动脉炎(暂时性动脉炎，Takayssu动脉炎)，其它动脉炎综合征(Kawasaki病，分离性中枢神经系统脉管炎，Buerger病(闭塞性血栓性脉管炎)，而本发明的消炎药对以上疾病有效。(4)免疫异常或自身免疫疾病免疫异常或自身免疫疾病包括各种器官移植后伴发排斥反应的炎症；神经系统疾病包括多发性硬化病、Guillan-Barre综合征，与HTLV-1相关的脊髓病等；胃肠疾病包括炎性肠疾病(clone病、溃疡性大肠炎)，原发性胆汁性肝硬化等；内分泌疾病包括自身免疫甲状腺疾病，例如Hashimoto病、Basedow病、胰岛素依赖性糖尿病(胰岛炎)等；循环系统的疾病包括特发性心肌炎、Chagas(非炎性)心肌病、扩张心肌病、心内膜肌纤维变性、特发性良性心包炎、嗜酸性细胞性心内膜炎、心脏手术后综合征、心肌梗塞后综合征、抗磷脂抗体综合征等；呼吸系统疾病包括特发性间质性肺炎、肺纤维变性等；肾脏疾病包括间质性肾炎等；皮肤病包括天疱疮、类天疱疮、免疫原性获得性水疱性表皮松懈病等；眼病包括晶状体诱导的眼色素炎、Vogt-Koyanagi-Harada综合征等(自身免疫疾病和免疫缺陷病，《最新内科医学》第22期，ImuraHiroo编辑，Nakayama-shoten，1993，pp.91-206)。本发明的消炎药对以上疾病都有效。后文将通过参照实施例、实施例、比较实施例对本发明进行描述参考实施例1硫酸皮肤素的制备将1千克来自母鸡的鸡冠(crest)切碎并煮沸。在残余物中加入5克链霉蛋白酶(商品名为Kaken-seiyaku)，使其在50℃下消化12小时。使消化液过滤通过硅藻土并将滤液的pH调至5.8-6.3。加入从灰色链霉菌属(streptomycesgriceus)(Seikagaku-Corporation)衍生获得的透明质酸酶，并使其在50℃消化3小时。在溶液中加入氯化钠至浓度为0.65M，溶液然后上柱于预先用0.5M盐溶液平衡的DiaionHPA-10阴离子交换柱(Mitsubishi-chemical的商品名)(3×20cm)。柱用0.5升的0.65M盐(saline)溶液，然后再用0.3L的1.1M盐溶液洗柱后，收集用1.8M盐溶液洗脱的部分并减压浓缩。浓缩物用蒸馏水透析过夜并浓缩至10ml，在其中加入5M氢氧化钠溶液使得其最终浓度为0.5M。碱性溶液在37℃下维持90分钟后，使其冷却并用乙酸中和。在加入两倍于中和溶液的量的乙醇后，接连用70％的乙醇、纯乙醇和乙醚洗涤得到的沉淀，并在五氧化二磷存在下对其减压干燥。在使干燥物(5克)在125ml水中过夜后，离心(10℃，10000rpm)15分钟除去少量的不溶物，在冰浴下加入125ml乙酸钠水性溶液以及乙醇，使得乙醇最终浓度为45％。溶液在4℃下保持20小时并离心形成沉淀，沉淀依次用90％乙醇、纯乙醇和乙醚洗涤并在五氧化二磷存在下减压干燥，从而形成纯化的硫酸皮肤素钠盐(后面简称为DS)。其平均分子量、特性粘度和二糖组分列在表1中。当然分离和纯化DS的方法不局限于上法，也可用公开的已审查过的日本专利042/1985或21241/1986中所述的方法。(1)平均分子量的测定DS的平均分子量是根据Arai等人(Biocim.Biophys.Acta，1117，60-70，1992)的方法来测定的。以有已知分子量的葡糖胺聚糖(用光散射法测得)作为标准，用高效液相层析(HPLC)测定凝胶渗透的洗脱部位，其中HPLC采用了前后相连的三根柱TSK凝胶G4000PWXL、TSK凝胶G3000PWXL和TSK凝胶G2500PWXL(每根柱的内径为7.8×300mm，Toso)。用流速为0.6ml/min的0.2M盐溶液作为洗脱剂，并用示差折射仪来进行检测。(2)二糖分析根据已知方法(见Shin-Seikagaku-Jikken-Kouza3所述的“2.8用葡糖胺聚糖降解酶对结构进行HPLC分析”“2.8StructuralanalysisbyHPLCusingglycisaminoglycandegradingenzyme”，TousituII，p49-62，(1991，Tokyo-kagaku-dojin))，对DS中硫酸酯基团部位进行如下分析。DS用软骨素酶(chondroitinase)ABC消化，得到的包括不饱和二糖的二糖(不饱和二糖)部分用高效液相层析(HPLC)分析，其结果与用软骨-6-硫酸酯酶处理所述不饱和二糖部分所得产物的HPLC分析结果进行比较。用软骨素酶ABC消化和用软骨-6-硫酸酯酶进行脱硫以及HPLC分析的实验条件如下a)用软骨素酶ABC进行消化根据Yoshida等人的方法(“分析生物化学”Anal.Biochem.，77，372-333(1989))，在20μlDS水性溶液(10mg/ml)中加入20μl0.4M的Tris-HCl(pH8.0)、20μl0.4M的乙酸钠、20μl0.1％的牛血清白蛋白和120μl水，并加入20μl的软骨素酶ABC(5U/ml)，使其在37℃下维持2小时。b)用软骨-6-硫酸酯酶消化在100ml上述的软骨素酶ABC的消化产物中，加入溶解有20μl软骨-6-硫酸酯酶(5U/ml)的20mMtris-乙酸缓冲液(pH7.0)，并在37℃下维持2小时。c)HPLC分析用HPLC(HitachiSeisakusho)对上述的50μl的软骨素酶ABC消化产物的溶液或软骨-6-硫酸酯酶消化产物的溶液进行分析，其中采用离子交换柱(YMC-PackPA-120-S5柱，内径为2.6×250mm)，并测定232nm处的吸光度。用0-100％梯度的800mM磷酸氢钠以1.5ml/min的流速洗脱60分钟。鉴定不同位置的有硫酸酯基团的不饱和二糖的洗脱峰。(3)特性粘度的测定根据第12版日本药典，测定DS的特性粘度。分析仪器粘度自动测定仪，用乌伯娄德粘度计VMC-052(Rigo)。溶剂0.2M氯化钠溶液(用相同溶液测定通过粘度计的流下时间)。测定温度30±0.1℃测定方法通过纵轴的截距测得特性粘度，其中纵轴为减少的粘度(ηred)，横轴为样品的浓度。ηred＝(ts/t0-1)/C上述方程式中，ts是含有DS的0.2M氯化钠溶液的流速，t0是溶剂(不含DS的0.2M氯化钠溶液)的流速，C是样品的浓度(重量％)。在表1中，归纳了上述从鸡冠和其它已知DS来源(牛肠、猪肠、猪皮)获得的DS的物理性质测定结果。从牛肠、猪肠和猪皮衍生获得的DS是根据国际申请WO95/09188中所述的方法来制备的。实施例1下面研究DS和低分子量肝素(LMWHep；商品名，Fragmin，Pharmacia，Kissei-yakuhin-kogyo)对凝血的影响。(1)实验用材料用10周龄大的雄性C57BL/6小鼠(一组有3只)。DS和LMWHep溶解在无菌生理盐水中。(2)实验方法在用DS(25mg/kg)和LMWHep(1mg/kg)经鼠尾部静脉给药后，随时间经过取血样并测定部分活性促凝血酶原激酶时间(APTT)。(3)结果图2显示了在每种试剂给药后APTT随时间经过的变化，其中○表示LMWHep给药的情况，●代表DS给药的情况(平均±标准误差(秒))。如在图2中，LMWHep的APTT(O)甚至在给药30分钟后仍超过300秒，这意味着LMWHep抑制了凝血因子的作用，大大地增加了出血的危险。相反，在给药60分钟后，没有发现有APTT延长活性，这意味在短期内从血中除去LMWHep将不能获得持久的长期效果。另一方面，在DS给药5分钟后，只有发现有轻度的APTT延长活性(●)，这意味着没有出血的危险。而且甚至在给药240分钟后仍发现有该活性，这说明DS比LMWHep有更安全而更持久的效果。如上所述，由于大于1m妒此的LMWHep将引起出血的不良效应，因此在下列实验中LMWHep的最大剂量为1mg/kg。由于甚至LMWHep随抗凝活性的增加都将引起如上所述的出血倾向，因此认为用肝素(Hep)来治疗是不实际的，因此没有进行肝素的实验。实施例2用小鼠的SLE(病理)模型-1进行的研究确认单用硫酸皮肤素的效果(1)实验材料用17周大的雄性小鼠MRL(1pr/1pr)作为SLE模型，而用有相同周龄和性别的C57BL/6小鼠作为正常对照。用按参考实施例1中的方法制备的DS或低分子量肝素(LMWHep，Fragmin)作为试剂，在使用时试剂溶解在无菌生理盐水中。(2)实验方法从17周大的小鼠中取血样，只选择有肾炎的血脲氮(BUN)水平几乎相同高的MRL鼠，并将其分成4组，每组有5只鼠。对一组用无菌生理盐水给药作为未治疗的对照组，在其它3组中对尾部静脉用5mg/kgDS、25mg/kgDS、和1mg/kgLMWHep给药，给药为每天一次和每周5次。在4星期后，用戊巴比妥钠麻醉后取血样品，在放血杀死动物后切除肾脏。所得的血清和血浆用于测定BUN、肌酸酐和纤维蛋白原，肾脏用来进行病理组织学检查。(3)结果(见图3-6)1)对于肾功能的影响图3a和图3b中分别表明了BUN和肌酸酐的测定结果(图中所示的每种物质的血清水平(mg/dL))。在图3a中，PRE(虚线)表示在试剂给药最初的平均BUN(17周大)。如图所示，该值明显比正常对照组(C57BL/6)高的多，这表明MRL鼠产生肾炎。在图3b中，*表示经Bonferroni检查对未治疗对照组有显著的差别(p＜0.05)。未治疗对照组的BUN和肌酸酐水平比正常对照组(C57BL/6)要高的多，这表明其肾功能遭到破坏。在治疗组中，在5mg/kgDS组、25mg/kgDS组和1mg/kgLMWHep组中BUN水平稍有改善。在治疗组中，在5mg/kgDS组和1mg/kgLMWHep组中肌酸酐水平也稍有改善，而在25mg/kgDS组中肌酸酐水平则有明显改善。2)对肾脏病理组织学研究的影响图4a-c显示了在对MPL鼠和正常对照鼠进行尸体解剖时的肾脏组织图，即肾脏每一级别的病理组织学变化。图4a显示了正常对照和其它MRL鼠的组织图(照片放大倍数为500倍)。每张照片的右侧底部的横线表示为10μm。图5a表示MC肾小球数/总肾小球数的百分数(％)，图5b表示DP肾小球数/总肾小球数的百分数(％)。对鼠肾脏解剖的显微镜观察结果是，在未治疗对照组中发现有明显的肾小球炎症图样，其中没有发现正常的肾小球(图4a)，(1)被WHO分类为稍有肥大襻(ahsa)和细胞增生的最小变化(MC)型(图4b)，(2)肾小球几乎完全丧失肾小球囊内腔和血脉内腔并充满了细胞组分和沉淀物，其功能可推定为丧失(在WHO分类中与弥漫性肾小球性肾炎的增生性肾小球性肾炎(后面简称DP)对应，图4c)和(3)介于(1)和(2)间的情况。根据这些结果，MRL(1pr/1pr)鼠肾小球的损伤认为是从MC逐渐变为DP，其中由于单核细胞和肾小球细胞的增生和/或血纤维蛋白和免疫复合物的沉积而丧失了肾小球囊内腔和血管内腔。MC型肾小球/总肾小球的百分数和DP型肾小球/总肾小球的百分数的测定结果表现为在25mg/kgDS组中MC肾小球比率有显著提高，而在5mg/kgDS组和1mg/kgLMWHep组中稍有提高(图5a)。另一方面，DP肾小球比率在5mg/kgDS组和25mg/kgDS组中明显随剂量而降低，而在LMWFep组中没有发现有该效应(图5b)。如上所述，通过病理组织学检查发现DS有防止肾炎发展的作用，而LMWFep只能维持最小变化(MC)组的肾炎情况，但对已经发展的肾炎没有效果。3)对于肾动脉的病理组织学变化的影响图6a表示正常对照鼠的肾动脉病理组织图，图6b-d表示MRL鼠肾动脉的病理组织图，即肾动脉在每一步的病理组织变化(放大倍数为204倍)。每张照片右端底部的横条表示50μm。根据显微检查的结果，病理组织图发现MRL鼠肾动脉中有下列3个阶段的血管炎轻微程度血管周围有炎性的细胞浸润(图6b)中级程度血管周围有炎性的细胞浸润，膜外侧和中间层萎陷(空泡变性，血纤维蛋白沉积)(图6c)严重程度血管周围有炎性的细胞浸润，膜外侧和中间层萎陷(空泡变性，血纤维蛋白沉积)和膜中间层和内侧有炎性浸润(图6d)。用这些病理组织图作为参数对每一组中的血管炎进行评价。结果为在25mg/kgDS组中严重程度的个体数减少而中间程度和轻微程度的个体数增加(表3)。1mg/kgLMWFep组、5mg/kgDS组和未治疗组间没有明显区别(表3)。从这些病理组织学观察可以发现DS对血管炎有抑制作用。表3</tables>数个体数4)对于血中纤维蛋白原水平的影响纤维蛋白原是一种急性反应物，不仅在肾小球性肾炎和血管炎中，而且在各种炎症中它的水平均会提高，它被认为是炎症的一个参数(“健康和疾病中的预促凝活性”ProcoagulantActivityinHealthandDisease，Eds.Levy，G.A.和E.H.CRCPressBocaRaton1994)。如图7所示，MRL(1pr/1pr)鼠未治疗组中，该可变参数比正常对照组的要高的多，这意味着未治疗组中有严重的炎症。在5mg/kg组和25mg/kg组中，该增量随剂量增加而受抑制，但在LMWFep组中几乎没有发现有该影响。实施例3用SLE2-型小鼠的研究确定硫酸皮肤素和环磷酰胺的合用效果(1)实验材料用10周大的雄性NRL(1pr/1pr)小鼠作为实验用动物，用根据参照实施例1制备的DS作为试剂并将其溶解在无菌生理盐水使用。将注射用安道生(endoxan)(环磷酰胺，Shiongi)溶解在每个加有5ml注射用蒸馏水的小管内(100mg/小管)，然后再加入无菌生理盐水使得其浓度为4、6和8mg/ml。对阴性对照组(未治疗组)用无菌生理盐溶液给药。(2)实验方法对10周大的动物进行称重并取血样品来测定血清BUN(脲氮)和血清肌酸酐。用连续分层随机法(stratifiedcontinuousrandomizatio)将动物分成5组，每组6只鼠，使得每组中的平均值和标准偏差几乎与其它组中相同。每天用DS对鼠尾部静脉用1ml一次性注射器给药，剂量水平为25mg/kg/天，一周5次(星期六和星期日不给药)。环磷酰胺一周一次进行腹腔内给药，根据在小鼠中研究的相同试剂的文献(Shiraki，M.等人，“临床与实验免疫学”Clin.Exp.Immunol.，55，333-339(1984))所述的方法给药剂量为20mg/kg、15mg/kg或10mg/kg。在给药期间，每天仔细观察动物。8周后，用戊巴比妥钠麻醉取血样品，并放血杀死动物。然后测定血清肌酸酐水平、脾脏重量和肠淋巴结的重量。(3)结果(见图8-10)1)对肾功能的影响在图8中显示了血清肌酸酐水平(mg/dL)的测定结果。与阴性对照组相比，单用20mg/kg安道生给药没有表现出对肌酸酐水平有任何影响。然而安道生(10mg/kg和25mg/kg)与25mg/kg的DS合用给药使得肌酸酐水平略有改善，而15mg/kg的安道生和DS的结合给药使得肌酸酐水平有显著改善(p＜0.05)。特别值得注意的是20mg/kg安道生和25mg/kgDS的合用给药和15mg/kg安道生和25mg/kgDS的合用给药这两种情况比单用20mg/kg安道生给药的效果要好。而且15mg/kg安道生和25mg/kgDS的联合给药组提供的结果比20mg/kg安道生单独给药组要好得多，因此，可以发现DS可抑制安道生的毒性并且是很有效的。2)对于脾脏重量的影响MRL鼠的脾脏重量与正常鼠相比异常地高。因此进行了对MRL鼠内增大的脾脏的治疗。图9显示了脾脏重量的测定结果。与阴性对照组相比，单用10mg/kg安道生给药的组没有任何效果，而其它所有组对脾肿大有效果。每一例中的DS剂量为25mg/kg。值得注意的结果是，如果用相同剂量的安道生，则安道生和DS联合方式进行给药这组的结果比单用安道生给药组要好。3)对于肠淋巴结重量的影响MRL鼠的肠淋巴结重量与正常鼠相比异常地高。对这种异常情况进行了治疗。图10显示了肠淋巴结重量的结果。与阴性对照组相比，发现其它所有组中淋巴结重量均减少。重要的是，10mg/kg安道生与DS联合给药这组的结果比单用10mg/kg安道生给药组要好。每一例中DS的剂量均为25mg/kg。根据实施例3的结果可以发现DS与免疫抑制剂的结合可提高免疫抑制剂的抗炎效果，并提供了与单用一定剂量水平(后称剂量A)的免疫抑制剂同样或比其更好的效果。即发现少于剂量A的免疫抑制剂与DS(DS的剂量没有限制)的组合可提供比单剂量A的免疫抑制剂更好的效果。因为DS是一种有硫酸酯基团的葡糖胺聚糖，因此其它有硫酸酯基团的葡糖胺聚糖与免疫抑制剂合用也将提供这种效果。实施例4用多发性硬化模型(MS)大鼠进行研究下面研究了DS对作为多发性硬化型动物的实验用过敏性脑脊髓炎(EAE)(一种典型的中枢神经系统的免疫异常疾病，被认为与自身免疫有关(“临床免疫学”Clinialimmunologyillustrated，p112-117，Brostoff，Scadding，Male，Roitt编辑，Shun-ichiHirose，ShogoKano，TomioTada翻译，Nanko-do，1994))的大鼠的影响。(1)实验材料用4周大的雌性Lewis大鼠作为实验用动物，并将其分成2组，每组有10-11只鼠。用荷兰猪的髓磷脂碱性蛋白质(后称为GPMBP)与含有结核杆菌(MTB)的Freund完全辅剂作为免疫物。用根据参照实施例1制备的DS作为试剂，在使用时将其溶解在无菌生理盐水中。用DS给药的组后面称为DS组。在阴性对照组中用无菌生理盐水给药。(2)实验方法每只大鼠通过在其脚上注射12.5μgGPMBP和200μgMTB来免疫。自免疫后第3天起，对DS组和阴性对照组分别用5mgDS和无菌生理盐水来进行一天一次腹腔内给药。有EAE特征的临床症状如下用数字定义(后称临床点数)无症状，0；尾部张力减退，1；下肢张力减退，2；下肢瘫痪，3；上肢瘫痪，4；死亡，5。每只大鼠每天的症状用数字表示，并研究每组中疾病的开始天数和累计的临床点数。用学生t-测试(Studentt-test)来检查显著性的区别。(3)结果DS组(12.4±1.7)和对照组(16.3±5.9)间的累积临床点数有显著不同(p＜0.05)，这意味DS抑制症状。而且，DS组的平均开始天数为9.5±0.5天，而对照组为9.1±0.3天，这意味着在DS组中症状的出现有推迟的趋势，且DS可抑制症状的出现。从这些结果可以发现DS是治疗MS的有效试剂，因为EAE是MS的一种动物(病理)模型。实施例5进行硫酸皮肤素(1)静脉单次给药来测试毒性实验方法用5周大的雌性和雄性CrjCD-1小鼠(JapaneseCharlesRiver(均为n＝5)作为实验用动物。根据参照实施例1的相同方法获得的DS溶液用无菌蒸馏水和无菌生理盐水制成等渗，并经小鼠的尾部静脉用2000mg/kgDS进行静脉给药，并进行14天的观察。(2)结果在14天观察后，5只雌性鼠和5只雄性小鼠均无死亡。因此，在上述条件下DS的致死量估计超过2000mg/kg。实施例6药物(1)包含硫酸皮肤素作为有效组分的注射液将DS(500mg)溶解在100ml生理盐溶液中，灭菌并注入安瓿瓶内(每个中为5ml)，它可用于血管内注射、皮下注射或肌内注射。(2)与免疫抑制剂的合用将下述剂量的各种免疫抑制剂溶解在100ml生理盐溶液中，并灭菌、注射入安瓿瓶中。根据免疫抑制剂的种类决定其剂量，即环磷酰胺为30mg；硫唑嘌呤为30mg；咪唑立宾(mizoribine)为150mg；氨甲喋呤为3mg；tacrolimushydrate为3mg；cyclosporine15mg。这些免疫抑制剂与上述1获得的DS注射液合用。DS制剂可在上述免疫抑制剂给药前或给药后进行给药。例如，可用泼尼松龙(prednisolone)(25mg/天)、环磷酰胺或硫唑嘌呤(30mg/天)，咪唑立宾(150mg/天)，氨甲喋呤或tacrolimushydrate(3mg/天)或cyclosporine(15mg/天)来给药。这些免疫抑制剂对各种疾病的效果可由在此之前或以后给药的DS制剂来提高。而且，这些剂量可根据患者的严重程度而不同。在这些试剂中，泼尼松龙、环磷酰胺、氨甲喋呤和cyclosporine可进行血管内给药或口服。其它试剂的基本给药途径是口服。工业实用性硫酸皮肤素或其药学上可接受的盐可用作有用而无不良反应的抗炎试剂，而对抑制难消除的或迁延性的炎症或有免疫机理参与的炎症有效。而且，当有硫酸酯聚糖的葡糖胺聚糖或其药学上可接受的盐与一种免疫抑制剂如肾上腺皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、咪唑立宾、cyclosporine、氨甲喋呤、tacrolimushydrate等合用时，用比单用免疫抑制剂时更少量的免疫抑制剂可获得相同的效果，从而减少了由免疫抑制剂引起的不良反应。权利要求1.一种消炎药，它包含作为有效成份的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐。2.根据权利要求1所述的消炎药，它表现出对迁延性炎症的消炎作用。3.根据权利要求1所述的消炎药，它表现出对免疫机制参与的炎症的消炎作用。4.根据权利要求3所述的消炎药，它表现出对伴发自身免疫疾病的炎症的消炎作用。5.根据权利要求3所述的消炎药，它表现出伴发多发性硬化病的炎症的消炎作用。6.根据权利要求3所述的消炎药，它表现出对伴发胶原性疾病或其相关疾病的炎症的消炎作用。7.根据权利要求1至3中任一项所述的消炎药，它表现出对肾小球性肾炎的消炎作用。8.根据权利要求1至3中任一项所述的消炎药，它表现出对顽固性脉管炎的消炎作用。9.根据权利要求1至8中任一项所述的消炎药，用葡糖胺聚糖降解酶和高性能液相色谱测定二糖含量测得，所述硫酸皮肤素中ΔDi-0S(ΔHexAl→3GalNAc)含量为2-9％。10.根据权利要求1至8中任一项所述的消炎药，用Ubbelohde粘度测定仪，以0.2M氯化钠溶液作为溶剂在30±0.1℃测得的所述硫酸皮肤素的特性粘度(100ml/g)为0.8-2.0。11.根据权利要求1至8中任一项所述的消炎药，利用凝胶渗透法、以已知分子量的葡糖胺聚糖作为标准物并使用高性能液相色谱测得的所述的硫酸皮肤素的平均分子量为25,000-100,000。12.根据权利要求1至8中任一项所述的消炎药，用葡糖胺聚糖降解酶和高性能液相色谱测定二糖含量测得，所述硫酸皮肤素中ΔDi-0S(ΔHexAl→3GalNAc)含量为2-9％；用Ubbelohde粘度测定仪，以0.2M氯化钠溶液作为溶剂在30±0.1℃测得的所述硫酸皮肤素的特性粘度(100ml/g)为0.8-2.0；利用凝胶渗透法、以已知分子量的葡糖胺聚糖作为标准物并使用高性能液相色谱测得的所述的硫酸皮肤素的平均分子量为25,000-100,000。13.根据权利要求1至12中任一项所述的消炎药，其中所述的硫酸皮肤素来自鸡冠(crest)。14.一种增强免疫抑制剂消炎效果的增效剂，它包含具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐作为有效成份。15.根据权利要求14所述的消炎效果增效剂，其中所述的具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖至少是选自以下组中的一种硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素和硫酸胶质素。16.根据权利要求15所述的消炎效果增效剂，其中所述的具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖是硫酸皮肤素。17.根据权利要求14所述的消炎效果增效剂，其中所述的免疫抑制剂至少包括选自以下组中的一种肾上腺皮质类甾醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、咪唑立宾、cyclosproinee、甲氨蝶呤和tacrolimushydrate。18.一种药物，它包含具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐和一种免疫抑制剂。19.一种增强免疫抑制剂消炎效果的增效剂，当所述的免疫抑制剂与具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐联合使用时，所述葡糖胺聚糖以不同给药时间或给药途径被用来增强所述免疫抑制剂的消炎效果。20.根据权利要求19所述的药物，其中所述的具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖或其药学上认可的盐被制成针剂，而所述免疫抑制剂被制成口服药或针剂。21.根据权利要求18至20所述的药物，其中所述的具有硫酸根基团的葡糖胺聚糖至少是选自以下组中的一种葡糖胺聚糖硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、硫酸软骨素和硫酸胶质素。22.根据权利要求18至21所述的药物，其中所述的具有硫酸根的葡糖胺聚糖是硫酸皮肤素。23.根据权利要求18至22所述的药物，其中所述的免疫抑制剂至少包括选自以下组中的一种肾上腺皮质类甾醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、咪唑立宾、cyclosproinee、甲氨蝶呤和tacrolimushydrate。24.根据权利要求18至23所述的药物，其中所述的药物表现出消炎作用。25.一种治疗患炎性疾病的哺乳动物的炎症的方法，它包括给药有效量的消炎药，所述消炎药包含硫酸皮肤素或其药学上认可的盐作为有效成份。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的炎性疾病是迁延性炎性疾病。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述的炎性疾病是有免疫机制参与的炎性疾病。28.硫酸皮肤素或其药学上认可的盐或包含它们和免疫抑制剂的药物的用途，被用于制备消炎药。29.根据权利要求28所述的用途，其中的消炎药表现出对迁延性炎症的消炎作用。30.根据权利要求28所述的用途，其中的消炎药表现出对有免疫机制参与的炎症的消炎作用。全文摘要本发明公开了一种用于治疗迁延性炎症或有免疫机制参与的炎症的消炎药。该药物包含作为有效成分的硫酸皮肤素或其药学上认可的盐。该药物可用于预防或治疗肾小球性肾炎、胶原性疾病、多发性硬化病、顽固性脉管炎、免疫病或自身免疫疾病。当它与免疫抑制剂(肾上腺皮质类激素等)合用时,该药物显著增强免疫抑制剂的效果,从而能够减少免疫抑制剂的剂量。该药物经口服、肌内、血管内或动脉给药,剂量为每日50至3,000mg。文档编号A61K31/726GK1196734SQ96197080公开日1998年10月21日申请日期1996年9月19日优先权日1995年9月19日发明者京ヶ岛守,浅利晃申请人:生化学工业株式会社