专利名称：用于催化水解HIVgp120的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及HIV感染及相关病理的治疗。尤其提供了催化HIVgp120蛋白水解的催化化(蛋白水解的)抗体，或其衍生物。
背景技术：
HIV-1的包被糖蛋白首先是以单一的160kD前体形式gp160合成，经细胞蛋白酶断裂Arg511-Ala512间的键，产生gp120和整合膜蛋白gp41(Kido，H.，etal.，生物化学杂志26813406-13413(1993))。gp120的生物学活性是HIV-1最初结合宿主细胞，病毒的繁殖及其对未感染的神经元和其它细胞的毒性作用中的一个关键成分(Kieber-Emmons，T.，etal.，生物化学生物物理年报989281-300，(1987)；Caponetal.，免疫学年度综述9649-678)。因此，gp120是针对AIDS的被动和自动免疫的一个靶点。(Kahn，J.O.，etal.，感染性疾病杂志1701288-1291(1994)；Birx，D.L.，etal.，免疫学中的当前观点5600-607(1993)；Berman，P.W.，etal.，美国国家科学院院刊855200-5204(1988))。gp120的构象抗原决定基与宿主细胞上的CD4受体的结合是HIV-1感染的第一步。组成这一抗原决定基的各个氨基酸位于第二(C2)，第三(C3)，第四(C4)保守gp120片段(Olsheveky，T.J.，etal.，病毒学杂志645701-5705(1990))。它们是gp120残基256，257，368-370，421-427及457。与CD4结合位点结合的单克隆抗体已有描述(Thali，M.，etal.，病毒学杂志656188-6193(1991)；Thali，M.，etal.，病毒学杂志665635-5641(1992))。由于CD4结合位点为构象抗原决定基，本身并不组成抗原决定基的远端残基对于保持与CD4结合的能力可能很重要。Gp120与其它宿主细胞蛋白间的相互作用对于病毒的繁殖也是必要的。例如，正如钙调蛋白拮抗剂的抑制活性表明，HIV-1的传染性可能涉及钙调蛋白与gp120的结合(Srinivas，R.V.，etal.，AIDS人类逆转录病毒研究1081489-1496(1994)。位于gp120V1和V2区之间的Asp180对于病毒复制是至关重要的(Wang，W-K.，etal。病毒学杂志69538-542(1995))。类似地，V3环对于传染性也是必要的(Ivanoff，L.A.，etal.，病毒学187423-432(1992))。因此很显然，gp120中CD4结合位点组成以外的结构决定簇对于病毒的基因组复制，外被蛋白的合成及病毒颗粒的包装似乎是必需的。
gp120被病毒颗粒排出并感染细胞被推测为AIDS发病的一个因素(Gelderblom，H.R.，etal.，Lancettii1016-1017(1985))。纯化的gp120对培养的神经元有毒(Brenneman，D.E.，etal.，自然335639-642(1988)；Muller，W.E.G.etal。欧洲药理学杂志226209-214(1992))。gp120包被的未感染T-淋巴细胞可被抗体依赖的单核细胞溶胞(Hober，D.etal.，FEMS免疫学医学微生物学1083-92(1995))。由于gp120-gp41复合物的结合诱导细胞凋亡而使未感染的CD4+细胞死亡(Laurent-Crawford，A.G.etal.，病毒学研究1465-17(1995))。Gp120亦与补体组分结合(Stoiber，H.etal.，AIDS919-26(1995))。
Gp120对于造成在AIDS病人中所观察到的神经损伤可能的贡献引起了广泛的兴趣(Everall，I.P.etal.，神经病理学杂志实验神经学52561-566(1993))。脑内生产性感染发生在相对小量的细胞中，包括小胶质细胞，多核巨细胞和血液来源的巨噬细胞(Epstein，L.G.etal.，神经学年报33429-436(1993))。而在病毒的未感染区，却有广泛的脑损害。这些提示病毒排出的可溶性gp120和感染细胞所产生的细胞因子可能与损害有关(Lipton，S.A.，脑病理学1193-199(1991)；Giulia，D.etal.，科学2501593-1595(1990)；Benos，D.J.etal.，美国国家科学院院报91494-498(1994))。gp120的神经毒性可能是间接的，包括对NMDA受体的刺激(Benos，D.J.etal.，美国国家科学院院报91494-498(1994))或细胞因子的诱导(Yeung，M.C.etal.，AIDS9137-143(1995))。Gp120还刺激单核细胞释放神经毒素(Giulian，D.等，美国国家科学院院报902769-2773，(1993))，表明其神经毒性作用可能需要这类细胞的参与。可溶性gp120神经毒性的证据包括(a)脑内表达gp120的转基因鼠具有广泛的神经元损伤(Tooggas，S.M.等，自然367188-193(1994))；(b)亚皮摩尔浓度的纯gp120可杀死培养的星形细胞和大脑皮层细胞((Brenneman，D.E.等，自然335639-642(1988)；Muller，W.E.G.等，欧洲药理学杂志226209-214(1992))。)；
(c)体内注射纯gp120产生脑损害(Hill，J.M.等，脑研究603222-223(1993))；(d)已有关于脑脊液中存在类gp120的神经毒性作用的描述(Buzy，J.等脑研究59810-18(1992))；(e)肽-T，与GP120的一个片段对应的八肽，且与神经肽VIP具有一定同源性，能改善AIDS病人的神经元障碍(Bridge，T.P.等精神药理学快报27237-245(1991))。
GP120表达许多线性和构象抗原决定簇，以此形成抗体。它们包括HIV感染个体产生的针对V3环的中和抗体(Dreyer，E.B.等，科学248364-367(1990)；Meylan，P.R.等，AIDS6128-130(1992)；Pollard，S.等，美国国家科学院院刊8811320-11324(1991))。由于V3环为高变区，这些抗体是型特异的，只对具有与引起初始感染的病毒株相似V3序列的HIV变种有直接的中和活性。另一方面，疾病后期产生的抗体具有广泛的保护性，这可由其抑制不同HIV-1病毒株感染易感细胞株和体外培养的原代淋巴细胞的能力来衡量。这些保护性抗体的一亚组是直接针对gp120的保守区，而其对于结合CD4受体和病毒繁殖是必需的(Hattori，T等，FEBS快报24648-52(1989)；Schulz，T等，AIDS人类逆转录病毒研究9159-166(1993)；Clements，G.T.等，AIDS人类逆转录病毒研究73-16(1991))。人们普遍认为针对gp120保守区的中和性抗体的募集对于抗AIDS的有效接种将是必要的。类似地，用抗体被动免疫的成功将依赖于识别gp120保守区的能力。
其他人观察到发现于系统性红斑狼疮病人中的自身抗体能结合gp120(Gu，R.等，AIDS人类逆转录病毒研究91007-1015(1993；Callebaut，C.等科学2622045-2050(1993))。提示了gp120的抗体和I型HLA重链(H-链)抗体间的交叉反应(Sattentau，Q.J.等病毒学杂志677383-7393(1993))。也有AIDS病人表达DNA-水解催化性抗体的报道(Wolley，D.W.等，JohnWiley&Sons，Inc.1952 82页)。
关于抗体可能产生催化活性的推测追溯至Wolley，1952(Gao，O.S..等生物化学杂志26932389-32393(1994))，他提示如果暴露于抗原足够长的时间，免疫系统会合成催化性抗体。在抗体L-链和丝氨酸蛋白酶之间存在可检测到的同源序列(Sun，M.等生物化学杂志269734-738(1994))。Kohen等报道了以缀合于载体蛋白上的类固醇或二硝基酚进行免疫，激发了具有酯酶活性的抗体形成(Sun，M等免疫学杂志1535121-5126(1994)；Paul，S.等应用生物化学和生物技术47241-255(1994))。可水解神经肽VIP的人类自身抗体已有论述(Li，L.等，分子免疫学1996，印刷中)。催化VIP水解的自身抗体已被复制(reproduce)(Li，L等免疫学杂志1543328-3332(1995))。其他研究小组显示了自身抗体可介导DNA的水解(Tyutyulkova，S.等，生化和生物物理Acta1996，印刷中；Kalaga，R.等，免疫学杂志1552695-2702(1995))。
具有酶活性的抗体使配体特异的，高效的催化性化学转化成为可能。许多生物学介质是肽或蛋白，包括致病生物的抗原，激素，神经递质和肿瘤特异抗原。这就使利用免疫系统广泛的特异性来催化化学反应成为可能，而不局限于天然存在的酶的范围内。将抗体的特异性与酶的催化能力相结合可能会产生理想的治疗试剂的潜力，即能特异水解重要的病毒包被蛋白的催化性抗体。
发明概述HIV感染的治疗方法还未成熟。现有的治疗方法旨在抑制病毒复制，延长疾病的潜伏期。本发明提供了可用于AIDS病人，降低体内HIV和可溶性gp120水平的方法和组合物。给病人服用这些组合物可能会减轻AIDS相关痴呆病人的神经症状。
本发明包括从病人血清中分离得到的水解性抗-gp120抗体和L链抗体组分，它们能有效地将gp120降解成无活性的亚片段。提供了介导gp120水解的催化性抗体及抗体组分的分离和纯化方法。
本发明的优选方案中抗体和抗体组分利用重组的方法制备。就寻求gp120降解活性筛选血清后，分离外周血淋巴细胞用作编码活性的mRNA来源以产生cDNA文库。本发明催化性抗体和抗体组分的编码基因的分离是利用本领域的技术人员所熟知的方法完成的。用于L链表达克隆分离的本发明的L链噬菌体展示是深思熟虑的。从分离自HIV-1和SLE病人的淋巴细胞中，利用与IgG基因的保守区对应的引物进行所有免疫组分克隆也是可期望的。
重组gp120水解抗体或抗体组分的分离、表达和纯化之后，提供了给HIV-感染病人用药的方法。催化性gp120降解的抗体或其组分可以适当的药物制剂静脉注射给药。或者本发明的gp120水解抗体可通过一插管进行脑室内腔隙(intraventricular compartment)给药。本发明的催化性L链也可翻译融合于转铁蛋白，以介导其通过HIV-1感染病人的血脑屏障。
附图简述
图1是在还原(A)和非还原(B)条件下，本周蛋白及其VL区跑胶的银染情况。
图2A是一张放射自显影照片，表明放射性标记的gp120与Lay2-L链37℃孵育6小时的水解。
图2B是表明未标记的gp120被Lay2-L链水解的银染SDS-page胶。
图3显示了随着Layer2L链的浓度不断升高，标记的gp120底物逐渐减少。
图4描绘了Layer2L链催化的标记gp120水解对PH的依赖。
图5显示了用Layer2L链处理后gp120对神经元细胞神经毒性的降低。
图6表明用Layer2L链预处理对HIV传染性的抑制。
图7是表明用循环PCR合成的编码Layer2VL区的cDNA大小的胶。
图8是一张放射自显影照片，表明放射性标记gp120被分离自SLE病人的L链的水解。
图9是一张放射自显影照片，表明放射性标记gp120被分离自HIV病人的L链的水解。
发明详述未预见的发现正常人类蛋白能特异性地识别gp120并催化裂解其中的一个肽键，为发展新的获得性免疫缺陷症(AIDS)的治疗手段提供了可能。从药理学上来说抗-gp120水解抗体可能用于AIDS病人的治疗，例如用于AIDS-相关的痴呆治疗。初步结果提示抗-gp120蛋白水解作用消除了gp120介导的神经毒性。其它更直接的应用则是以可注射的蛋白溶液，通过破坏gp120受体结合位点，或者使病毒的受体结合位点不稳定，从而通过结合和降解gp120，来减小HIV的感染性。水解gp120抗体可用作免疫系统的补充来增强机体自身机制控制疾病的能力。本发明中作为实施例的具有gp120水解活性的L-链之一分离自多发性骨髓瘤病人(Lay2)。造成骨髓瘤L-链特异性的初始抗原刺激还不清楚。L-链与gp120的反应反映了交叉反应性现象，后者归因于结合位点与gp120间偶然的结构契合。这位病人死的时候，AIDS还未被认可为临床病种(clinical entity)，病人是否为HIV-1抗体阳性不得而知。多发性骨髓瘤在AIDS病人中发病率很高(Erhan，S.等，自然251353-355(1974)，但还未发现催化性L-链的供者有AIDS。
最近的报道论证了HIV感染涉及HIV的快速复制和CD4T-细胞高更新率之间的平衡(Wei等，自然373117-122，1995；Ho等，自然373123-126，1995)。在免疫系统仍很强壮，但已发生了感染时，进行进攻性地病毒特异地蛋白水解治疗，将会使感染消除的可能性提高，或使潜伏期延长。
以下实施例提供了对本发明更详尽描述。它们并不旨在任何方面限制本发明。
实施例I抗体L链介导的GP120水解描述了从多发性骨髓瘤病人中纯制的29个单克隆抗体L链(Solomon，A.，酶学方法116101-121(1985)；样品由Solomon博士提供，Tennessee大学)，就水解125I-标记gp120能力筛选具有VIP水解活性的重组L链(Gao，Q-S.，等生物化学杂志26932389-32393(1994))和多克隆抗-VIP抗体(Paul，S.等，生物化学杂志26616128-16134(1991)。电泳纯gp120(IIIB；AIDS研究及参比试剂程序，NIH)通过氯胺-T法进行放射性标记，然后凝胶过滤纯化125I-gp120。通过SDS-PAGE和放射自显影在120KD处观察到放射性标记的gp120的单带。图1是银染的SDS-PAGE胶，显示了L-链制备的纯度。将L-链与125I-gp120孵育，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和定量放射自显影分析反应混合物(Brugger，C.等，生物化学杂志26618358-18362(1991)。鉴定出一个具有gp120水解活性的人类单克隆L-链(Lay2)。其余的L-链和抗VIP抗体均无活性。gp120水解活性与L-链蛋白峰从凝胶过滤柱中同时洗脱出。在生理缓冲液和营养基(磷酸盐缓冲液(PBS)，Hank’s盐缓冲液(HBSS)及RPMI1640)中观察到近等当量的gp120被Layer2降解。非还原条件下电泳明显可见质量约80KD，50KD附近成片条带，20KD和＜6KD的四个放射性标记的gp120降解产物。见图2A。80KD的带在还原条件下似乎进行了片段化，提示其含有二硫键片段。用得自HIV-1病毒株IIIB，SF2和MN的125I-gp120观察到完全相同的产物分布图。放射性标记的80KD带延长孵育至36小时时似乎经历了进一步的消化。除各带密度与标记的gp120不同外，未标记gp120的降解分布图均与标记gp120的类似，而各带密度不同可能是检测两种底物所用方法(在Tyr残基处银染或125I-标记，然后进行放射自显影)的反映。从HIV-1病毒株IIIB，SF2和MN分离到的未标记gp120被Lay2(250nM；6小时)水解至类似水平(分别为50，44和60％)，通过对带密度的定量扫描进行估计。
用识别该蛋白的蛋白水解作用分解产物的抗-gp120抗体进行还原性胶的免疫印迹(Pollard，S.，等美国国家科学院院刊8811320-11324(1991))得到了由Lay2产生的很明确的产物带。见图2B。如图3所示，由120KD底物带密度的减小可看出，增加Lay2的浓度，gp120的水解明显增加。同时伴随着80KD和其它降解产物的增多。
由20nMLay2与不断升高浓度的Lay2(10-300nM)孵育所得到的对反应动力学的初步估计得到初速度，后者适用于Michaelis-Menten方程。反应的表观Km值为30nM，Vmax为0.06nmolgp120/nmolLay2/h。gp120对Lay2相对较高的亲合性，显示于所观察到的在平行反应中胰蛋白酶催化的水解在浓度高至1μM时仍未能饱和，提示胰蛋白酶对gp120的Km确实比Lay2的大。
125I-白蛋白不被Lay2水解表明所观察到的gp120水解不是非特异的现象，图2A。高浓度的VIP抑制Lay2对125I-gp120的水解(VIP的表观Ki，620nM)。Lay2也水解放射性标记的VIP，Km为144nM。基于Lay2对gp120的Km与其对VIP的Ki/Km的比较，Lay2似乎以5-21倍更强于VIP与gp120结合。gp120有两个与VIP同源的短区(LaRosa，G.J.，等，科学149932-935(1990)；Gorny，M.，等，免疫学杂志150635-643(1993))，这可能强调了两种多肽与Lay2间的反应性。
Lay2水解gp120的最佳PH在中性范围内，如图4所示，提示具中性PKa值的氨基酸残基作为催化残基(Ser，Thr，Tyr，His)的参予。丝氨酸蛋白酶抑制剂(0.3mM二异丙基氟代磷酸酯)存在下，Lay2-催化的水解基本上完全被抑制。而与之形成对比的，金属蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶及酸性蛋白酶的抑制剂(EDTA，碘代乙酰胺，胃酶抑素A)对此反应均无影响。这些结果提示Ser残基可能参与了gp120的水解。
Lay2的序列已被测定。Lay2是κIIc亚组中的一个成员。这个L-链的CDRs中Ser/Thr残基的数目异常地高。催化性的抗-VIPL-链的定点诱变表明它的Ser27a和His93为催化残基。在Lay2的27a位置上也存在一个Ser残基。Lay2的93位被Glu占据(而不是抗-VIPL-链中的His)。在利用计算机AbM程序构建的Lay2的初步模型中(Martin，A.C.R.等，美国国家科学院院刊869268-9272(1989))，Ser27a和Glu93处于可成氢键的距离内(2.9埃)。如果这些残基形成了氢键，所导致的Ser残基亲核性的增加可能允许其通过与丝氨酸蛋白酶水解中类似的机制参与肽键的水解。
比较了对照gp120和以Lay2处理的gp120(10μM，30小时)对于培养的鼠大脑皮层细胞生存能力的影响。如过去所报道(Brenneman，D.E.，等，自然335639-642(1988))，亚皮摩尔浓度的对照gp120对这些细胞有毒性。大脑皮层细胞由的新生Wistar鼠制得，0.25％胰蛋白酶分解组织。在补充有10％胎牛血清的MEM培养基中培养细胞。两天后，约80％的细胞为神经元，约20％为胶质纤维酸性蛋白阳性的星形细胞。以Lay2处理后，gp120的活性降低了10倍多，直接对应其水解水平。见图5。Lay2处理的gp120的电泳和银染显示，约85％的蛋白被消化。未加gp120的对照Lay2不表现神经毒性作用。
研究了Lay2对HIV感染抑制的能力。无血清条件下，以这个催化L-链预处理的确可抑制HIV-1(IIIB)感染MT-2细胞，后者为一个T细胞株，这一结果是通过对细胞病变结果(合胞体的形成)的显微观察和利用2，3-二(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)5-[(苯基氨基)-2H-四唑的氢氧化物的进行的微培养基四唑(MTA)试验测得的。见图6。该试验中的感染复数(MOI)为3.2。在更低的MOI值下，L-链可能显示更好的活性。不存在HIV-1时，以L-链处理细胞不产生细胞病变。这些结果提示L-链能识别和降解天然的gp120。
实施例II重组LAY2VL的制备如前所述，叫做Lay2的人类本周蛋白是由Tennesssee大学的AlanSolomon博士提供，收集自一位现已过世的病人。在细菌表达系统中进行Lay2重组形式的构建满足了可再生供应该催化剂的需要。这还有望为制备具有改进催化活性的Lay2衍生物提供可能。
对具有血管活性肠肽活性的催化L链的成功克隆和分离已在美国专利5,229,272中有描述，在此全文引入作为参考文献。
Lay2L-链可变区的序列曾由Solomon博士的实验室进行了测定。V-外显子编码部分在六个位置与编码人类IIL-链家族的三个种系基因之一不同(011-01)(Klein，R.，等，欧洲免疫学杂志233248-3271(1993)}。这些不同点，假定反映体细胞突变，其中之一包括CDR位置。在CDR3的92位，Lay2有一个亮氨酸残基，而不是异亮氨酸，Lay2蛋白和种系基因间的其它五个不同点包括距CDR部分较远的FR位点；Lay2的0位也有另一个残基，谷氨酸，代表不知意义的第七个不同。Lay2序列与011-01种系序列间的相似性值得注意，因为这可能反映了由这个种系基因得到的其它VL区结合和水解gp120的能力。
编码Lay2VL区蛋白的cDNA通过循环PCR进行合成。见图7。蛋白全功能化的重组形式可如下述方法表达。这些方法过去曾成功地用于构建人类可变区(Wilkins-Steven，P.等Prot.科学4421-432(1995)。简而言之，VL区cDNA的构建包括利用循环PCR(Prodromou，C.等，Prot.Eng.5827-829(1992))使重叠的合成寡核苷酸相结合，这些寡核苷酸包括八个为提供跨整个VL区密码的寡核苷酸，一个N-末端信号序列及包含SfiI和NotI限制位点的侧翼序列以插入到表达载体中。cDNA还包括一个用于构建Fv的短的C-末端接头部分。
实施例IIIGP120催化性抗体由AIDS和SLE病人的分离及其重组生产上节所述L-链是通过对多发性骨髓瘤病人的随意筛选分离的。已知在自身免疫疾病如狼疮中催化性抗体高水平地形成，SLE病人体内已发现gp120结合抗体。这些观察结果促使我们对HIV阳性病人和狼疮病人的血清进行分析，观察是否有gp120的催化性抗体存在。
由AIDS病人和SLE病人血清(～0.5毫升)提纯的IgG部分经DEAD-纤维素色谱(DE52填料，Whatman)或蛋白G-琼脂糖(Pharmacia)，在50mMTris-HCl，PH7.5，0.002％叠氮钠中纯化。IgG组分以未结合状态从DEAE-纤维素柱上得到，而以酸洗脱的蛋白形式得自蛋白G柱。用100mM甘氨酸，PH2.7洗脱，然后以1MTris碱，PH9.0中和溶液。已知IgG制剂中含少量的游离L链，DEAE-纤维素纯化的IgG在高效的凝胶过滤柱(Superose，Pharmacia)上，50nMTris-HCl，100mM甘氨酸，150mMNaCl，0.025％吐温-20，0.02％叠氮钠，PH7.5中进一步纯化(流速0.5毫升/分钟；每一级分大小0.5毫升)。DEAE-纤维素纯化的IgG中的L链被确认为洗脱下来的质量为25KD的部分，柱子以质量已知的标准蛋白校准。得到的蛋白浓度通过280nm处紫外光吸收值测定(1cm径长比色杯中，0.8毫克/毫升蛋白溶液在280nm处给出1.0光密度)。Gp120的降解用上节所述的SDS-电泳和放射自显影进行测定。
上述血清为多克隆的。用二维凝胶电泳拆分不同的L链，然后电洗脱单个L链。一旦分离到单体L链，就进行氨基末端测序，以得到用于克隆的特异寡核苷酸探针。
图8表明125I-gp120(2nM)与来自SLE病人的，经蛋白Gsepharose纯化的IgG(3μM)37℃孵育18小时后，导致对应于约110KD处成片条带及质量37KD，24KD，10KD处可分辨带的gp120降解产物的出现。未反应的gp120在120KD处为明显的带。110KD的成片条带可能是一个多肽混合物，或者可能是一个单一产物，由于其质量与未反应gp120太接近，而无法在本实验的实验过程中与后者清晰地分离。
图9表明125I-gp120(2nM)与由HIV阳性病人纯化的L链(实验室编号#005)37℃孵育17小时后，导致对应于90KD，25KD，12KD及＜10KD处的gp120降解产物的出现。来自HIV阴性对照的类似的L链级分未表现gp120降解活性。已知IgG制剂中的L链浓度，如同本实验凝胶过滤所用浓度，很小。SDS-电泳和银染表明IgG组分中L链浓度＜1.5％。用作催化剂的L链的比活(％gp120的降解/蛋白浓度)可计算出，至少比上节所述的Lay2催化性抗体L链的特异性活性高112倍。
这些结果表明具有gp120降解活性的L链的合成是罹患HIV-1和SLE病人的一个相当普遍的免疫应答的组成部分。利用曾成功用于降解来自哮喘病人L链的VIP分离的技术，如Gao等所述，抗体工程方法，51286-291页，S.Paul编辑，Humana出版社，Totowa，NJ，(1995)，克隆以上参照病人的全部免疫组分可获得L链持续的供应。
稀有抗体可通过对噬菌体颗粒进行配体特异的亲合色谱迅速分离，这些噬菌体颗粒的表面展示重组抗体片段为基因III融合蛋白。已由一位哮喘病人的周围血淋巴细胞制备了一个VL-链噬菌体展示文库(Tyutyulkova，S.等，应用生物化学和生物技术，47191-198(1994)；Tyutyulkova，S.等，抗体工程方法中，5121377-394，S.Paul编辑，Humana出版社，Totowa，NJ，(1995)。这些试验中具有VIP结合活性的噬菌体颗粒通过固定于VIP上的亲合色谱富集。大肠杆菌中，两个VIP结合的L链以可溶形式表达，它们的一级结构通过cDNA的测序得知，蛋白通过金属鳌合作用和蛋白L亲合色谱纯化至电泳纯。
用(Tyr10-125I)VIP底物测定L链的蛋白水解活性。随着重组L链浓度的增加，VIP的水解成明显的线性增加。两条L链的反应对底物浓度均显示了饱和动力学。以VIP为底物的动力学系数(Kcat/Km)比高度进化的蛋白酶，胰蛋白酶的动力学系数好或与之相当。L链不催化非特异的蛋白酶底物，试卤灵的降解。凝胶过滤柱上～26KD活性的洗脱表明，L-链的单体形式对VIP的水解有贡献。
类似的方法可用于上述HIV和SLE病人的L链的克隆和表达。收集周围血淋巴细胞，通过逆转录酶-PCR法制备L链cDNA。将PCR产物克隆到噬菌体质粒载体pCANTABhis6中，后者可使L链在噬菌体颗粒表面展示或使其表达为可溶性蛋白。用噬菌体质粒DNA完成对感受态大肠杆菌TG1细胞的电穿孔后，以VCSM13辅助噬菌体再度感染，获救展示融合于蛋白3的L链的噬菌体颗粒，聚乙二醇沉淀并上gp120-sepharose柱进行亲合层析。低PH洗脱分离得到克隆，通过放射免疫法和/或ELISA检测gp120结合活性。克隆在大肠杆菌细胞中生长，以IPTG诱导培养液24小时以使可溶的L链分泌于上清液中。把IPTG的诱导时间由24小时降至3小时，L链也可表达于壁膜间隙中。
如前所述，催化性抗体的合成应答于底物的免疫。已由用VIP免疫的鼠克隆了一个抗体L链文库。对任意挑选或基于抗原结合活性挑选的L链克隆进行了蛋白分解活性的测定。通过在固定的VIP上的噬菌体的色谱完成了挑选。分离能水解(Tyr10-125I)VIP及普通蛋白酶底物(肽-甲基香豆酰胺)的有效催化剂。基于其VIP-结合活性的所选克隆显示了1-2数量级的催化活性的提高。催化活性的提高归因于VIP-结合亲合性的增加。IP为底物的更新数在0.1-2.2范围内。156个随机挑选的克隆中，近20％的纯化L链在10nM蛋白浓度下，以合成的肽作为底物，显示了催化活性。12个L-链克隆的可变区已测序，现正在寻找与催化活性相关的共同序列和立体结构。这些结果显示天然抗体L链常见的催化作用及通过以多肽进行免疫，发展抗原特异的催化活性。由于可变区序列的多样化，这可能通过催化活性的从头发展实现，或作为种系活性遗传和在成熟期间维持对免疫原的高亲合性。
HIV-1的感染引发一系列的免疫应答。利用本文提出的用于VIPL链克隆的方法，从上述病人的淋巴细胞进行L链文库的克隆还将被证明成功地用于抗gp120水解抗体L链的分离。
实施例IV用本发明的GP120水解L链治疗病人催化抗-gp120L链抗体可在适当的药物赋形剂中给病人用药以降低体内可溶性gp120的水平。
免疫球蛋白临床应用于静脉内给药(IVIG)已被详细综述过。参见如Dietrich等，血液792946-51(1992)；Rossi等，免疫学综述110135-149(1989)；Dwyer，J.M.，新英格兰医学杂志326107-16，(1992)；Schwartz，S.A.，临床免疫学杂志10∶81(1990)。
本发明纯化的gp120水解L链静注对病人给药以降低体内HIV-1和可溶性gp120的水平。根据病人体内病毒负荷调整剂量可在病毒负荷的1/100至等当量之间。由于L链为催化性的，用于中和病毒所需剂量的确很低。已知IgG的剂量为0.25-1g/kg体重时是安全的。通过给药前后ELISA分析可溶性gp120的水平来测定药效。
或者，本发明的抗gp120水解抗体直接给入AIDS相关的痴呆病人脑内。文献已有将治疗试剂给入脑内的报道。参见如Harbaugh，R.E.，生物医学药物治疗43483-485(1989)；Johnson等，神经外科学杂志70240-248(1989)；Giannone，L.等临床癌症杂志468-73(1986)。
gp120水解轻链可通过插管直接给入脑室内腔隙或者将其缀合于转铁蛋白，通过静注给药。本领域中融合蛋白的构建是熟知的。编码本发明催化L链的基因序列可与编码转铁蛋白的基因序列相连。转铁蛋白可通过血脑屏障，因而能有效地将本发明的L链给入脑内(Shin等，美国国家科学院院刊922820-2824(1995)。
尽管以上描述和特异性地引证了本发明的一些优选实施方案，并不意指本发明局限于这些方案。只要不脱离本发明的范围和精神，可对其进行各种修饰，如以下权利要求书中所提。
权利要求
1.一种催化性抗体或其抗体组分，其催化人类免疫缺陷病毒(HIV)的糖蛋白120中的肽键的降解。
2.根据权利要求1的抗体组分，选自Fab片段，轻链，轻链二聚体，Fd片段及Fd片段和轻链的混合物。
3.根据权利要求1的抗体组分，其中所述组分为L链。
4.制备可催化gp120降解的催化性抗体或其组分的方法，包括步骤a)通过测定低于120kd的所述gp120降解产物的产生就所述催化性抗体或催化性抗体组分的存在筛选血清样品；及b)纯化所述抗体或抗体组分。
5.制备降解gp120的抗体的催化组分部分的方法，所述组分选自Fab片段，轻链，轻链二聚体，Fd片段及Fd片段和轻链的混合物，所述方法包括步骤a)测定催化性抗体组分部分的基因序列；b)将编码所述催化性抗体组分部分的所述序列插入细胞中；c)在所述细胞中表达所述组分部分。
6.产生催化gp120降解的催化L链抗体组分的方法包括步骤a)用权利要求4的方法制备得到所述抗体L链组分；b)测定所述L链的序列；c)合成重叠的系列寡核苷酸，代表所述抗体L链组分的序列的各段；d)可操作地连接所述重叠系列的寡核苷酸，以得到完整的催化性抗体L链的基因序列；e)用所述基因序列转化细胞；及f)纯化来自所述细胞的所述催化性抗体L链。
7.权利要求6中的方法，其中所述细胞选自细菌，真菌，酵母，霉菌7动物细胞，原生动物细胞或植物细胞。
8.权利要求7中的方法，其中所述基因在插入所述细胞前经受突变。
9.一种降解gp120中肽键的催化性抗体或抗体组分，所述抗体或其组分从血清中分离。
10.根据权利要求9中的催化性抗体，其中所述血清来自被HIV-1感染的病人。
11.根据权利要求9中的催化性抗体，其中所述血清来自SLE病人。
12.产生本发明的催化性抗-gp120L链的方法包括a)从有抗-gp120催化性抗体L链的病人周围血淋巴细胞中分离mRNA；b)用逆转录酶-PCR由所述mRNA产生cDNA；c)利用适当的限制位点将所述cDNA插入载体；及d)将所述载体插入噬菌体中，以便使cDNA序列在所述噬菌体表面表达和展示重组蛋白；e)通过柱层析分离表达所述抗-gp120催化性抗体L链的噬菌体颗粒；f)用表达所述L链的所述噬菌体转化大肠杆菌；及g)纯化来自所述转化的大肠杆菌细胞的所述抗-gp120催化性抗体L链。
13.一种用具有gp120水解活性的催化性L链治疗HIV-1阳性病人的方法，包括通过静注，将所述L链于适当的药物载体中给药，剂量在0.1-1g/kg体重。
14.一种用具有gp120水解活性的催化性L链治疗HIV-1阳性病人的方法，包括a)可操作地将编码所述催化L链的基因序列与编码转铁蛋白的基因序列相连接；b)用所述可操作地连接的基因序列转化细胞，以合成融合蛋白；c)纯化所述融合蛋白；及d)将所述融合蛋白于一适当的药物载体中给病人用药。
全文摘要
发现了一种降解HIVgp120的催化性抗体及其组成。还描述了从病人体内分离,克隆和纯化这种抗体或抗体组分的方法。所述组合物可能应用于HIV感染的治疗中。
文档编号A61K39/395GK1197394SQ96197083
公开日1998年10月28日 申请日期1996年7月19日 优先权日1995年7月21日
发明者S·鲍尔, R·卡拉加 申请人:内布拉斯卡大学评议会